Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

M-Zellen in einem spezialisierten Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Plaques eine wichtige Rolle spielen für die Schleimhaut Immunüberwachung im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir die Auswertungsverfahren für die bakterielle Transzytose von M-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die bakterielle Aufnahme durch M-Zellen zu untersuchen, die sich im Immunsystem der Darmschleimhaut befinden. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die Darm-Scheiterhaufenpflaster einer anästhesierten Maus freizulegen und zu ligieren. Anschließend werden fluoreszierende Bakterien in den ligierten Bereich injiziert.

Eine Stunde später werden die Scheiterhaufenflecken herausgeschnitten. Die Zellen im Gewebe werden dann durchdrungen und für den M-Zell-Marker, GP zwei, gefärbt. Abschließend werden die Proben mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet und Bakterien, die von M-Zellen transzytosiert werden, können sichtbar gemacht werden.

Neben dem Einblick in die molekularen Grundlagen der bakteriellen Transzytose durch m-Zellen kann die Ablehnung auch auf andere Systeme angewendet werden. Zum Beispiel könnte dieses Protokoll verwendet werden, um die Zellpermeabilität zu unterstützen und im eingerahmten Darm mit Chlor und Mikroben mit einem sterilen Glasspreizer die fluoreszierenden Bakterien auf einer LB-Schneckenplatte zu streifen und die Platte bei 37 Grad Celsius zu inkubieren, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der festen Schnecke und impfen Sie sie in zwei Milliliter frisches LB-Medium.

Anschließend kultivieren Sie die Bakterien auf einem Shaker über Nacht bei 37 Grad Celsius. Sobald die Starterkultur gewachsen ist, überführen Sie 500 Mikroliter Bakterien in 4,5 Milliliter LB-Medium und inkubieren Sie diese neue Kultur drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder bis ihre optische Dichte bei 600 Nanometern eins erreicht, was darauf hinweist, dass sich das Bakterienwachstum in der logarithmischen Phase befindet. Zu diesem Zeitpunkt zentrifugieren Sie die Kultur bei 3000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Bakterien nach der Zentrifugation zu ernten, entsorgen Sie die Schlinge und waschen Sie das Pellet mit fünf Millilitern sterilem PBS. Nach Wiederholung des Waschschritts suspendieren Sie die Bakterien in fünf Millilitern PBS.

Nachdem Sie die Maus unter eine kontinuierliche Fluoranästhesie gesetzt haben, verwenden Sie sterile Werkzeuge, um den Bauch der Maus aseptisch zu öffnen. Beginnen Sie damit, den Dünndarm freizulegen und die Pflaster des PI zu lokalisieren. Sobald die Pflaster eines PI gefunden wurden, verwenden Sie steriles Nähgarn, um den Darm etwa fünf Millimeter zu einer Seite des Pflasters zu ligieren.

Achten Sie darauf, dass die Blutgefäße während des Eingriffs nicht durchtrennt werden. Sobald der Darm ligiert ist, injizieren Sie mit einer Spritze 50 Mikroliter Bakteriensuspension etwa 10 bis sieben KBE in die ligierte Scheiterhaufen-Patch-Schlaufe auf der losen Seite des Darms. Verwenden Sie dann Garn, um die andere Seite des Darms zu ligieren.

Verschließen Sie den Bauch der Maus mit einem Clip und halten Sie die Maus eine Stunde lang unter Narkose, bevor Sie sie einschläfern. Um das Scheiterhaufenbeet zu ernten, schneiden Sie das Scheiterhaufenbeet vorsichtig aus. Spülen Sie PBS dann mehrmals kräftig durch den entnommenen Darmabschnitt, um die apikale Seite des PI-Pflasters zu waschen und überschüssige Schleimhautflüssigkeit und Bakterien zu entfernen.

Sobald das Pflaster des PI gewaschen ist, legen Sie es in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und fügen Sie Zytoeffekte oder Zytodauerwellenlösung hinzu. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis. Sobald das P'S-Pflaster fixiert ist, weichen Sie es fünf Minuten lang in einem Milliliter Dauerwellen-Waschpuffer ein.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Geben Sie dann die Probe in einen Milliliter Blockpuffer und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Nach dem Blockierungsschritt fügen Sie den monoklonalen Anti-Maus-Antikörper GP Two bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, um die M-Zellen zu färben.

Waschen Sie anschließend die Probe wie zuvor. Fügen Sie einen zweiten Boden für konjugierte Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang im Dunkeln auf Eis. Sobald die Probe gefärbt ist, waschen Sie die Probe vorsichtig in PBS.

Legen Sie dann drei oder vier Stücke kreisförmiges Deckglas auf einen Objektträger und betten Sie das Pires-Pflaster in 200 Mikroliter einer 30%igen Glycerinlösung in PBS ein. Verwenden Sie auf dem Objektträger ein DM IRE mit zwei konfokalen Lasermikroskopen oder ein Dekonvolutionsmikroskop mit Delta-Vision-Restauration, um die Probe zu beobachten. In diesem Bild ist zu sehen, dass grünes GFP-markiertes Salmonella typhimurium von GP zwei umgeben ist, das auf der apikalen Plasmamembran rot dargestellt ist.

In diesem gedrehten Bild sind Bakterien innerhalb der subapikalen zytoplasmatischen Vesikel sichtbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die bakterielle Transzytose durch M-Zellen mit ligiertem pys-intestinaler Lu asay beurteilt werden kann.