Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aufnahme von Bakterien durch M-Zellen im Bereich des intestinalen Schleimhaut-Immunsystems zu untersuchen. Im ersten Schritt des Verfahrens werden die Peyer-Plaques eines anästhesierten Mäuses freigelegt und ligiert. Anschließend werden fluoreszierende Bakterien in den ligierten Bereich injiziert.

Eine Stunde später werden die Pflaster der Pyres ausgeschnitten. Die Zellen im Gewebe werden anschließend permeabilisiert und mit dem M-Zell-Marker GP2 gefärbt. Abschließend werden die Proben mit einem konfokalen Mikroskop untersucht, und Bakterien, die von M-Zellen transzytosed werden, können sichtbar gemacht werden.

Neben der Aufklärung der molekularen Grundlagen der bakteriellen Transzytose durch M-Zellen kann die Methode auch auf andere Systeme angewendet werden. Beispielsweise könnte dieses Protokoll dazu dienen, die Zellpermeabilität und das umgebende Darmgewebe mithilfe von Chlor und Mikroben zu untersuchen. Streichen Sie die fluoreszierenden Bakterien mit einem sterilen Glasverteiler auf eine LB-Agarplatte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie vom festen Agar und impfen Sie diese in zwei Milliliter frisches LB-Medium an.

Kultivieren Sie die Bakterien anschließend über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Schüttler. Sobald die Starterkultur gewachsen ist, überführen Sie 500 Mikroliter Bakterien in 4,5 Milliliter LB-Medium und inkubieren diese neue Kultur bei 37 Grad Celsius für drei bis vier Stunden, oder bis die optische Dichte bei 600 Nanometern den Wert eins erreicht, was darauf hinweist, dass sich das bakterielle Wachstum in der logarithmischen Phase befindet. Zentrifugieren Sie die Kultur danach bei 3000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Bakterien zu pelletieren. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand und waschen das Pellet mit fünf Milliliter steriler PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt und resuspendieren Sie die Bakterien anschließend in fünf Milliliter PBS.

Nachdem die Maus unter kontinuierlicher Isofluran-Anästhesie liegt, verwenden Sie sterile Instrumente, um aseptisch den Bauch der Maus zu öffnen. Beginnen Sie damit, den Dünndarm freizulegen, und suchen Sie die Peyer-Plaques. Sobald eine Peyer-Plaque gefunden wurde, verwenden Sie sterile Nähgarn, um den Darm etwa fünf Millimeter seitlich der Plaque abzuklemmen.

Achten Sie darauf, während des Eingriffs Blutgefäße nicht zu verletzen. Sobald der Darm ligiert ist, injizieren Sie mit einer Spritze 50 Mikroliter Bakteriensuspension mit etwa 10 hoch 7 KBE in die ligierte Peyersche-Plaque-Schleife auf der losen Seite des Darms. Anschließend ligieren Sie die andere Seite des Darms mit Garn.

Schließen Sie den Bauch der Maus mit einer Klammer und halten Sie die Maus eine Stunde lang unter Anästhesie, bevor Sie sie euthanasiert. Um den Pyres-Fortsatz zu gewinnen, entfernen Sie den Pyres-Fortsatz vorsichtig. Spülen Sie dann mehrmals kräftig PBS durch den gewonnenen Darmabschnitt, um die apikale Seite des PI-Fortsatzes zu waschen und überschüssige Mukusflüssigkeit sowie Bakterien zu entfernen.

Nachdem der PI-Patch gewaschen wurde, legen Sie ihn in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte und geben Sie Cyto-Effects- oder Cyto-Perm-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis. Sobald der PI-Patch fixiert ist, tauchen Sie ihn fünf Minuten lang in ein Milliliter Perm-Waschpuffer ein.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Anschließend geben Sie die Probe in ein Milliliter Blockierpuffer und inkubieren sie 30 Minuten auf Eis. Nach dem Blockierungsschritt fügen Sie anti-maus GP zwei monoklonalen Antikörper zu einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, um die M-Zellen zu färben.

Als Nächstes die Probe wie zuvor waschen. Einen sekundären Antikörper hinzufügen und die Probe zwei Stunden im Dunkeln auf Eis inkubieren. Nach der Färbung die Probe vorsichtig mit PBS waschen.

Danach drei oder vier runde Deckgläser auf einen Objektträger geben und den Pires-Patch in 200 Mikrolitern einer 30 %igen Glycerinlösung in PBS einbetten. Auf dem Objektträger die Probe mit einem DM-IRE2-Konfokalmikroskop oder einem Delta-Vision-Restaurierungs-Entfaltungsmikroskop beobachten. In diesem Bild ist grün markiertes GFP-gefärbtes Salmonella typhimurium zu sehen, das von GP2, das rot auf der apikalen Plasmamembran dargestellt ist, umgeben ist.

In diesem gedrehten Bild sind Bakterien innerhalb der subapikalen zytoplasmatischen Vesikel sichtbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die bakterielle Transzytose durch M-Zellen mittels ligierter pys intestinaler Lu-Assays beurteilt.