Name: Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung spezifischer Bakterientaxa in Gewebeschnitten.

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Die Autoren danken Dr. Kristen Earle für die unschätzbare Technikentwicklung, Amber Hann für die Hilfe bei der Fehlerbehebung, Dr. Jen Nguyen und Deanna Pepin für die kritische Überprüfung des Manuskripts sowie Dr. Hesham Soliman und dem Rossi-Labor an der University of British Columbia für den Zugang zum Mikroskop. Die Autoren danken für die Unterstützung durch CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's and Colitis Canada (an C.T. und K.M.N.), CIFAR (an C.T. und K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (an C.T.), die Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (an C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (an C.T.).

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das oben beschriebene Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode zur Visualisierung der Wirt-Mikrobiota-Schnittstelle. Diese Assays haben erheblich von der Protokollentwicklung profitiert, angefangen von der Optimierung der FISH-Markierung18 bis hin zur Schleimkonservierung und Bildgebung9. Fixierung und Einbettung bieten auch eine nützliche Aufbewahrung von Proben; Darüber hinaus können paraffininfiltrierte Kassetten ohne Einschränkungen verschickt werden, da die Proben vollständig fixiert und inert sind.
Bedeutung und alternative Methoden Die Kombination von FISH und Schleimfärbung ermöglicht die Analyse der Mikrobiota-Zusammensetzung an bestimmten Gewebestellen und die Interaktion zwischen einzelnen Bakterien und dem Wirt. Alternative Techniken, die die Analyse spezifischer Stellen innerhalb der Mikrobiota beinhalten, sind in der Regel nicht in der Lage, die Einzelzellnatur dieser Wechselwirkungen zu erforschen, wie im Fall der Laser-Capture-Mikrodissektion in Verbindung mit Sequenzierung19. Sequenzierungsbasierte Techniken haben jedoch den Vorteil, dass sie das Erbgut der Mikrobiota auf einer feineren Ebene und breiter erfassen können als 16S rRNA-Sonden.
Ein Fallstrick des vorgestellten Protokolls besteht darin, dass es eine einmalige Momentaufnahme der Mikrobiota in Bezug auf den Wirt liefert. Für die Echtzeitbildgebung bei lebenden Tieren sind spezielle bildgebende Verfahren erforderlich, um die Erfassung eines Fluoreszenzsignals in tiefem Gewebe zu erleichtern (z. B. intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie und Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie20,21). Bei diesen Methoden wird der Modellorganismus entweder mit Bakterien besiedelt, die mit Molekülen gefärbt sind, die an ihre Hülle binden20 oder gentechnisch veränderten Bakterien, die fluoreszierende Proteine beherbergen21. Im letzteren Fall ist die Reifung von Fluoreszenzproteinen ein Schlüsselthema, da die meisten fluoreszierenden Standardproteine Sauerstoff benötigen, um Licht zu emittieren. Daher werden Modellorganismen benötigt, die mindestens nanaerobe Umgebungen (nanomolare Sauerstoffkonzentration) haben, wie der aerobe Zebrafisch gut21.
In diesem Protokoll wird Methanol-Carnoy als Fixiermittel anstelle von Paraformaldehyd oder Formalin verwendet, da es kein Wasser enthält. Dies verhindert Hydratation, Austrocknung und Kollaps der Schleimschicht während der Verarbeitung und ermöglicht genaue Messungen der Schleimdicke. Während die Methacarnfixierung und die Paraffineinbettung zu einem Standard auf diesem Gebiet geworden sind, wurden verschiedene Fixiermittel und Einbettungstechniken untersucht, um die Schleimkonservierung zu optimieren9,22, wobei einige Studien darauf hindeuten, dass Harze der Paraffineinbettung überlegen sein können22. Eine weitere wichtige Einschränkung der Paraffineinbettung und Methacarn-Fixierung ist der Verlust der fluoreszierenden Proteinfluoreszenz, der durch den Einsatz alternativer Fixiermittel (z. B. Formalin oder Paraformaldehyd (PFA)) oder modifizierter Einbettungstechniken vermieden werden kann23. Jedes Fixiermittel hat Vor- und Nachteile, und die Wahl des Fixiermittels hängt von den Bildgebungsprioritäten ab. Bildgebungsmodalitäten können kombiniert werden, wenn biologische Replikate in PFA und Methacarn fixiert sind und Bilder aus beiden Proben gewonnen werden.
FISH wurde in Einzelfällen mit Immunfluoreszenz mit spezifischen polyklonalen Anti-Muc2C3-Kaninchen-Antikörpern kombiniert9,24. Diese Ergebnisse wurden nicht in großem Umfang mit anderen Muc2-Antikörpern reproduziert, was darauf hindeutet, dass die Wahl der Antikörper für den Erfolg der FISH-Immunfluoreszenz-Kombination entscheidend sein kann. Die Bedingungen für eine erfolgreiche Antikörperfärbung für einen bestimmten Antikörper erlauben möglicherweise keine Beibehaltung der FISH-Färbung.
Fehlerbehebung In diesem Protokoll stellen Probenentnahme, Schneiden und Färben kritische Schritte dar, um die Erstellung von Bildartefakten zu verhindern. Zum Beispiel kann das Drücken auf das Gewebe bei der Entnahme und vor dem Einbetten zu einer Fehllokalisierung der Mikrobiota führen und die Schleimqualität beeinträchtigen. Eine weitere wichtige Überlegung ist, die Kombination von Segmenten sehr unterschiedlicher Dicke in einer einzigen Kassette zu vermeiden, z. B. ein relativ leeres Stück des Dünndarms und ein Pellet im distalen Dickdarm. Die unterschiedlichen Dicken führen zu Schwierigkeiten bei der Bildgebung: Nach dem Einbetten kann sich der Querschnitt in einer bestimmten Tiefe für ein Segment in der falschen Tiefe für die Bildgebung des anderen befinden (z. B. befindet sich das Lumen für jedes Gewebe in unterschiedlichen Tiefen) (Abbildung 1B, C und Abbildung 3A). Darüber hinaus können Sie für die Bildgebung von Tiermodell-Stuhlpellets in peritoneale Membranen eingewickelt werden24. Bei dieser Technik wird ein kleiner Abschnitt des frisch isolierten Peritoneums sanft um den Stuhl gefaltet und bewahrt die Struktur des Pellets während der im Protokoll beschriebenen Waschschritte.
Im Gegensatz zur Verarbeitung von tierischem Gewebe mit Inhalt stellt die Bildgebung menschlicher Darmproben einige Herausforderungen dar. Insbesondere werden der Luminalgehalt und die Schleimhautschleimhaut wahrscheinlich durch die Darmvorbereitung der Koloskopie gestört, die normalerweise vor Darmbiopsien oder Resektionsverfahren durchgeführt wird. Darüber hinaus ist es bei der Entnahme von Biopsien hilfreich, die Gewebeorientierung zu beachten, um bei der Identifizierung spezifischer Merkmale (z. B. Lumen vs. Submukosa) in Abwesenheit von Darminhalt zu helfen. Die Voreinbettung mit 3%igem Agar und/oder Agar:Gelatine-Mischungen kann bei der Aufrechterhaltung der Gewebepolarität nützlich sein25; Es gibt jedoch Probleme mit der Dehydrierung und Teilung von Agar, wie in der Literatur berichtet, und die Verarbeitungszeiten müssen möglicherweise geändert werden.
Ein Schlüsselaspekt für eine gute FISH-Färbung ist die Anpassung der Formamidkonzentration für spezifische FISH-Sonden. Formamid wird die Hybridisierungsstrenge von FISH-Sonden zu ihren Zielen kontrollieren. Es ist wichtig sicherzustellen, dass a) die richtige Formamidkonzentration für die Färbung einer bestimmten Gemeinschaft gewählt wird und b) dass eine geeignete Formamidkonzentration sogar für die verwendete Sondenkombination möglich ist - dies kann die optimale Sondenwahl bei Verwendung mehrerer Sonden beeinflussen. Websites wie mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) können bei der Berechnung der richtigen Formamidkonzentrationen für eine bestimmte Sonde helfen. In Ermangelung von Informationen über geeignete Formamidkonzentrationen kann dieses Protokoll mit 0% und 10% Formamid getestet werden.
Das Schneiden der eingebetteten Proben erfordert das Schneiden des Blocks auf eine ausreichende Tiefe, um luminale Scheiben zu erhalten, da ein zu flaches Schneiden in einen Block zu einer Querschnittsansicht der Zotten /Krypten ohne luminalen Inhalt führt (Abbildung 3A). Färben Sie die Proben kurz nach dem Schneiden auf ein optimales FISH-Signal und verwenden Sie frisches DAPI (oder DAPI, das bei -20 °C gespeichert ist), um Hintergrundprobleme zu beheben (Abbildung 3C). FISH-Färbung von Abschnitten, die älter als einen Monat sind, kann zu einer schlechteren / inkonsistenten Färbung führen.
Wenn das Gewebe oder der Deckglas in Bezug auf den Objektträger nicht perfekt flach ist, ist die Probe möglicherweise nicht an jeder Position innerhalb eines Fliesenscans scharf (Abbildung 3B), was zu verschwendetem Aufwand und potenziellem Photobleichen führt. Dies kann durch kleinere Kachelscans gelöst werden, bei denen alle Positionen als scharf verifiziert wurden. Das Schneiden mit stumpfen Klingen kann auch zur Ablösung des Schleim- und Leuchtinhalts führen, die während der Bildgebung als große dunkle Bereiche erscheinen. Schließlich kann die Verdunstung der Lösung oder der Blasen während des Hybridisierungsschritts zu einer ungleichmäßigen Färbung der FISH-Sonden im Gewebe führen.
Ein weiterer kritischer Parameter, der die Effizienz der FISH-Sondenbindung beeinflusst, ist der Wettbewerb zwischen verschiedenen Sonden. Eine nützliche Überprüfung, um zu überprüfen, ob die FISH-Sonde Bakterien markiert, besteht darin, die Kolokalisierung des Signals der FISH-Sonde mit DAPI zu untersuchen (Abbildung 2C, D). In Proben, die die Verwendung mehrerer rRNA-Sonden erfordern, ist die Anpassung von Parametern wie Hybridisierungstemperatur, Sondenkonzentration und Formamid von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Sonden effizient an die richtige Spezies binden18.
Hinweise zur Bildgebung FISH-gefärbte Bakterien lassen sich am besten mit einem konfokalen Mikroskop und einem Objektiv mit mindestens 40-facher Vergrößerung sichtbar machen. Während die 63-fache Vergrößerung bevorzugt wird, um Bakterien auf Einzelzellebene abzubilden, kann die 40-fache Vergrößerung auch durch Maximierung des digitalen Zooms oder durch Verwendung eines Superauflösungssystems verwendet werden. Systeme, die mit Superauflösungsfähigkeiten ausgestattet sind, können auch die subzelluläre Auflösung einzelner Bakterienzellen liefern. Objektive mit niedrigerer Vergrößerung können verwendet werden, um ein allgemeines Gefühl für die Bakterienlokalisation und die Schleimdicke zu erhalten.
Die Aufnahme von 16-Bit-Bildern anstelle von 8-Bit-Bildern wird ebenfalls dringend empfohlen, da der höhere Dynamikbereich dazu beiträgt, den großen Bereich des DAPI-Signals aus den extrem hellen Kernen des Epithels und das relativ schwache Signal luminaler Bakterien zu erfassen. Abgesehen von der Verwendung des oben beschriebenen Bildgebungsaufbaus ist die Wahl der Fluorophore eine wichtige Überlegung für die Bildgebung. Für eine optimale Trennung zwischen Bakterientypen ist sicherzustellen, dass sich die verwendeten Fluorophore in Anregungs- und Emissionsspektren nicht überlappen (es sei denn, die Bildgebung auf einem System mit der Fähigkeit, eine lineare Entmischung durchzuführen). Zusätzlich können Sonden in Kombination verwendet werden (z. B. die Kombination einer familienspezifischen Sonde und einer gattungsspezifischen Sonde), um zusätzliche Community-Mitglieder zu identifizieren. Bei der Verwendung von linearen sortenreinen oder nicht validierten Sonden ist es wichtig, die Genauigkeit und den Grad der FISH-Färbung an Reinkulturen zu testen8,14.
Sobald die Bilder gesammelt sind, stehen mehrere Tools für die quantitative Analyse der Wirt-Mikrobiota-Schnittstelle zur Verfügung, wie BacSpace26, HiPR-FISH8 und andere Segmentierungswerkzeuge27. BacSpace ist eine MATLAB-Software, die die Segmentierung der Gewebe- und Leuchtkomponenten sowie die Entfernung von Pflanzenmaterial aus Bildern ermöglicht26. Das Programm bietet auch eine Analyse der Schleimdicke in 2D und eine Quantifizierung der räumlichen Verteilung basierend auf Pixelabständen in verschiedenen Kanälen26. Umgekehrt ermöglicht die HiPR-FISH Bildanalyse-Software die Segmentierung von FISH-gefärbten Zellen8. Schließlich könnten auch andere bakterielle Segmentierungswerkzeuge, die für In-vitro-Experimente optimiert wurden27, an diese Anwendung angepasst werden.
Schlussfolgerung Die In-situ-Bildgebung ermöglicht die quantitative Analyse einzelner mikrobieller Taxa im Kontext anderer Gemeindemitglieder und der verschiedenen Mikroumgebungen, die durch Ernährung, Schleim und Wirtsepithelkrypten entstehen. Die Interaktion zwischen Organismen bestimmt die Biologie der wirtsassoziierten mikrobiellen Systeme und liefert eine wesentliche Analyse der Veränderung dieser Strukturen während der Störung, die Auswirkungen auf die Gesundheit hat. Insbesondere die Fähigkeit, die Mikrobiota in situ durch das oben beschriebene Protokoll abzubilden, bietet ein unglaubliches Fenster in die Biogeographie der Mikrobiota in Bezug auf den tierischen Wirt.

Mikrobielle Visualisierungstechniken haben ursprünge, die so alt sind wie die Mikrobiologie selbst, als Antonie Van Leeuwenhoek im 17. Jahrhundert mit seinem Mikroskop Bakterien (die er "Animalcules" nannte) aus Zahnbelag und Stuhl beobachtete. Seitdem wurden zahlreiche Techniken entwickelt, um die räumliche Organisation des Konsortiums von Bakterien, Pilzen und Viren zu visualisieren, die mit einem Wirt - der Mikrobiota1 - leben. Die Aufklärung der Lokalisation dieser Mikroben ist wichtig, um ihre Funktion in ihrem tierischen Wirt zu bestimmen. Die Biogeographie von Bakterien ist sowohl in kommensalen als auch in pathogenen Taxa wichtig, da die Nähe zu bestimmten Orten (z. B. dem Epithel), Nahrungssubstraten und spezifischen Mikroben die bakterielle Produktion von Metaboliten diktieren kann, die Interspezies und Inter-Kingdom-Interaktionen zugrunde liegen.
Eine Schlüsselstruktur, die Bakterien und wirtsgewebe an mehreren unterschiedlichen Körperstellen wie der Mundhöhle, dem Darm oder der Lunge trennt, ist der Schleim - eine vom Wirt produzierte Schicht, die sowohl die mikrobielle Translokation auf die Wirtsepithelzellen verhindert als auch als Nahrungsressource für die Mikrobiota dient2,3,4 . Die Charakterisierung von Verstößen und Veränderungen in dieser Barriere ist von entscheidender Bedeutung und führt zu mechanistischen Einblicken in Wirt-Mikrobiota-Interaktionen, die durch Sequenzierung allein nicht erhalten würden5,6,7. Beispielsweise ermöglichte die Bildgebung die Entdeckung, dass die Exposition gegenüber Antibiotika die Schleimschicht und die Organisation der Mikrobiota stören kann7,8 und dass Abführmittel den Schleim erschöpfen können, was mit großen Veränderungen der Immunparameter korreliert5.
Dieses Protokoll skizziert einen allgemeinen Rahmen für die Fixierung, Färbung und Bildgebung der Mikrobiota und des Wirtsgewebes (Abbildung 1), der auf der Arbeit von Johansson und Hansson9 aufbaut. Während dieses Protokoll im Zusammenhang mit Darmabschnitten modelliert wird, kann es leicht an andere Gewebetypen angepasst werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Verarbeitung von experimentellen klinischen Proben von Tieren oder Menschen; Hinweise zur Verarbeitung beider Probentypen wurden beigefügt. In dem hier gezeigten Beispiel wurden das Wirtsepithel und die luminalen Bakterien gleichzeitig mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung, Schleim mit dem Fluorescein (FITC)-konjugierten Lektin, Ulex europaeus Agglutinin I (UEA-1) und einem spezifischen Bakterientaxon unter Verwendung von FISH markiert. FISH-Sonden werden normalerweise gegen die 16S-rRNA-Gene eines Taxons entwickelt, um das hohe Signal der Bindung eines Transkripts mit hoher Kopie sicherzustellen.
In diesem Beispiel zielt die Sonde auf die 16S rRNA der Muribaculaceae-Bakterienfamilie ab (Abbildung 2). Die Flecken können jedoch leicht durch verschiedene FISH-Sonden und / oder Lektine ersetzt werden, um die entsprechende biologische Fragestellung zu berücksichtigen. Zuvor validierte FISH-Sonden finden sich auf ProbeBase10, einer Online-Ressource für rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden, oder auf SILVA11, einer ribosomalen RNA-Datenbank. Für das Design neuer Sonden kann sich der Leser auf neue Pipelines wie HiPR-FISH8 oder Oligominer12 beziehen. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die enge Packung von Bakterien im Darmlumen und die verschiedenen Merkmale des Darmschleims im gesamten Verdauungstrakt zu beobachten. Der hier beschriebene Workflow ermöglicht die quantitative Analyse der Mikrobiota im räumlichen Kontext ihrer Wirtsumgebung.

<table><tbody><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Coplin-Glas</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas, 22 & 22 mm, Nr. #1</td><td>VWR</td><td>CA48366-227-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Resuspendiert auf 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Leere Pipettenspitzenbox(en)</td><td></td><td></td><td>Zum Schmelzen von Paraffin</td></tr><tr><td>Ethanol, wasserfrei, molekulare Qualität</td><td>--</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FISH-Sonden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FISH-Hybridisierungslösung</td><td>--</td><td>-</td><td>-20 mM Tris&ndash; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01 % (w/v) SDS in nukleasefreiem Wasser. Optionale Hinzufügung von 5&ndash; 50% (v/v) Formamid</td></tr><tr><td>FISH-Waschpuffer</td> <td>--</td><td>--</td> <td>20 mM Tris&ndash; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkiertes Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1)</td><td>Lektin Vector Laboratories</td><td>FL-1061 (Fluorescein-markiert) oder RL-1062-2 (Rhodamin-markiert)</td><td>UEA-1 markiert fucosylierte Glykane, daher ist es nicht geeignet für keimfreie Mäuse oder für Proben von Fucosyltransferase 2 (FUT2)-defizienten Wirten.</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Abzug</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gletscheressigsäure</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td>Korrosive und brennbare</td></tr><tr><td>HybriSlip flexible Kunststoff-Deckgläser, 22 x 22 mm & mal 0,25 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL722222</td><td>für FISH-Hybridisierungsschritte, kann Glasdeckgläser ersetzen</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td>Giftiges und brennbares</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td></td><td></td><td>zum Schneiden</td></tr> von <tr><td>Mehrzweck-Probenaufbewahrungsbehältern, 473 mL</td><td>Fisher</td><td>14-955-117A</td><td>Kann durch einen Glas- oder Polyethylenbehälter Ihrer Wahl ersetzt werden. Methacarn ist nicht verträglich mit Polystyrol oder Metall.</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72180</td><td>Jeder Nagellack sollte funktionieren</td></tr><tr><td>Ofen</td><td></td><td></td><td>Notwendiger Bereich: 45-60 &deg; C</td></tr><tr><td>Paraffin: Leica Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x Lösung)</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>Verdünnung auf 1x für Protokoll</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS), 20% Lösung, RNase-frei</td><td>Invitrogen</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Loc HistoScreen Kassetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>CA83009-999</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochloridlösung, 1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, nukleasefrei</td><td>Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td>Giftig und brennbar</td></tr></tbody></table>

visualisierung von darmmikrobiota-wirt-interaktionen durch fluoreszenz-in-situ-hybridisierung , lektinfärbung und bildgebung

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Die Messung der Lokalisation von Mikroben in ihrem In-vivo-Kontext ist ein wesentlicher Schritt, um die funktionellen Beziehungen zwischen der Mikrobiota und dem Wirbeltierdarm aufzudecken. Die räumliche Landschaft der Darmmikrobiota wird durch physikalische Merkmale - Darmschleim, Krypten und Falten - streng kontrolliert und von wirtskontrollierten Eigenschaften wie pH-Wert, Sauerstoffverfügbarkeit und Immunfaktoren beeinflusst. Diese Eigenschaften begrenzen die Fähigkeit von kommensalen Mikroben und Krankheitserregern gleichermaßen, den Darm stabil zu besiedeln. Auf der Mikrometerskala bestimmt die mikrobielle Organisation die Nahbereichsinteraktionen zwischen verschiedenen Mikroben sowie die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrem Wirt. Diese Wechselwirkungen beeinflussen dann die großräumige Organfunktion und die Gesundheit des Wirts.
Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der räumlichen Organisation der Darmmikrobiota von Entfernungen zwischen Zellen bis hin zu organweiten Skalen. Die Methode basiert auf der Fixierung von Darmgewebe unter Beibehaltung der Darmstruktur und der Schleimeigenschaften. Die fixierten Proben werden dann eingebettet, geschnitten und gefärbt, um bestimmte Bakterienarten durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hervorzuheben. Wirtsmerkmale wie Schleim und Wirtszellbestandteile sind mit fluoreszierend markierten Lektinen markiert. Schließlich werden die gefärbten Schnitte mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung von Kachel-Scan-Bildgebung bei hoher Vergrößerung abgebildet, um die Mikrometer- bis Zentimeterlängenskalen zu überbrücken. Diese Art der Bildgebung kann auf Darmabschnitte aus Tiermodellen und Biopsien aus menschlichem Gewebe angewendet werden, um die Biogeographie der Mikrobiota im Darm in Gesundheit und Krankheit zu bestimmen.

Um die Lokalisation spezifischer darmkommensaler Bakterien im Mausdarm zu untersuchen, wurden in dieser Studie keimfreie Swiss Webster Mäuse verwendet, die mit einzelnen Bakterienisolaten besiedelt waren. Für dieses Experiment waren die markierten Bakterienarten i) ein menschliches Isolat der Muribaculaceae-Familie5, Muribaculum intestinale, eine reichlich vorhandene und weit verbreitete Familie von Bakterien in der murinen Mikrobiota15, sowie ii) Bacteroides thetaiotaomicron, ein genetisch behandelbares und häufiges Darmbakterium. Nach zweiWöchiger Gleichgewichtsbekämpfung wurden die Mäuse eingeschläfert, und ein Segment des Dickdarms, das ein Fäkalienpellet enthielt, wurde geschnitten und in frisch zubereitetem Methacarn fixiert. Nach zwei Tagen der Fixierung wurden die Abschnitte durch Verarbeitung durch Methanol, Ethanol und Xylole dehydriert, mit Paraffin infiltriert, eingebettet und dann in luminale 4 μm-Scheiben geschnitten. Diese Proben wurden dann mit einer FISH-Sonde (3' Cy3-markiert) speziell für das Muribaculum-Isolat angefärbt, die mit Oligominer-Software12 entworfen und mit NuPACK und mathFISH16,17 auf sekundäre und tertiäre Struktur und minimale unspezifische Bindung überprüft wurde. Die Proben wurden auch mit dem Rhodamin-gebundenen Lektin UEA-1 (das fucosylierte Glykane im Schleim färbt) und DAPI gegengefärbt. Die gebeizten Schnitte wurden mit einem 40-fachen Ölobjektiv und einem Super-Resolution-Modul abgebildet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig01.jpg"> Abbildung 1: Workflow der Visualisierung der Mikrobiota-Wirts-Schnittstelle im Darm. (A) Ein veranschaulichter Workflow für die Pipeline. (B) Die beiden Schnittebenen ergeben entweder Querschnitte (bevorzugt für diese Pipeline) oder Querschnitts-"Donuts". (C) Das Einbetten von Geweben sehr unterschiedlicher Dicke kann zu Scheiben führen, die nur für das eine oder andere Gewebe optimal sind. Abkürzungen: FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Abbildung des Dickdarms zeigt die Lokalisation von Muribaculum intestinale relativ zum Schleim in einem gnotobiotischen Mausmodell. Die Abschnitte wurden mit DAPI (blau), Muribaculaceae FISH-Sonde (rot) und UEA-1 (grün) gefärbt. (A) Distaler Dickdarm der Maus monokolonisiert mit Muribaculum intestinale und (B) distaler Dickdarm der Maus bikolonisiert mit Muribaculum intestinale und Bacteroides thetaiotaomicron. Maßstabsbalken = 20 μm. (C und D) Cy3-FISH (links), DAPI (Mitte) und kombinierte Cy3-FISH + DAPI-Kanäle für luminale Einschubanteile von (A) bzw. (B). Maßstabsleiste = 5 μm. In (A) und (C) sind alle bakterienförmigen und bakteriengroßen DAPI-Signale mit Cy3 (einzelne Pfeilspitzen) markiert, und in (B) und (D) gibt es zusätzlich zu diesen Cy3- und DAPI-doppelpositiven Zellen (einzelne Pfeilspitzen) DAPI-gefärbte Bakterienzellen, die Cy3-negativ sind (Doppelpfeilspitzen), wie für Mono- und Bi-Kolonisationszustände zu erwarten. Mit Ausnahme längerer fadenförmiger Bakterien sind größere (&gt;4 μm lange) DAPI-positive Strukturen (stumpfe Pfeile) Pflanzenmaterial oder Kerne von Wirtszellen. Abkürzungen: FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig03.jpg"> Abbildung 3: Häufige Probleme. (A) Flache Schnitte liefern keine luminalen Scheiben des Darms. (Links) Ein Darmsegment, das in einer Tiefe geschnitten wurde, die einen Blick auf das Lumen sowie Längsansichten des Epithels bietet. (Rechts) Ein Darmsegment, das zu flach geschnitten wurde und nur Querschnitte von Krypten und keine konstante Schleimschicht oder Bakterien enthüllt. (B) Ungleichmäßige Gewebe-/Deckglasabdeckung kann zu verschwommenen und ungleichmäßig beleuchteten Fliesenscans führen. Es wurde ein Kachel-Scan mit unscharfen Positionen eingerichtet (obere rechte Ecke). (C) Beispiel für normalen Hintergrund (links) und hohen Hintergrund (rechts). In diesem Beispiel beachten Sie für das DAPI-Signal das Signal, das vom Epithel außerhalb der Kerne kommt. Alle Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzung: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Mikroben, die mit dem Wirt assoziiert sind, bilden dieses sehr komplexe Ökosystem, das wirklich Bildgebung erfordert, um verstanden zu werden. Und durch dieses Partikel zeigen wir Ihnen, wie Sie den Färbeprozess durchlaufen und eine Visualisierung der Wirtsmikrobiom-Schnittstelle erreichen. Das Verständnis der Biologie von wirtsassoziierten Bakterien erfordert ein Verständnis ihrer Lokalisation in Mikroumgebungen.Und diese Technik wird es uns ermöglichen, einzelne Taxa in Wirtsumgebungen sowie im Kontext anderer Bakterien zu visualisieren. Durch diese Technik wird es möglich sein zu bestimmen, welche Bakterien möglicherweise durch das Wirtsgewebe eingedrungen sind, sowie festzustellen, ob Schlüsselmerkmale wie der Wirtsschleim erschöpft sein können. Bereiten Sie frisches Methacarn in einem kompatiblen Behälter mit 60% absolutem Methanol, 30% Chloroform und 10% Eisessig zu.Schneiden Sie mit scharfen und sauberen Werkzeugen Darmsegmente von den Mäusen für die Bildgebung ab. Minimieren Sie die Störung der Probe so weit wie möglich und behandeln Sie die Abschnitte an ihren Graten, um eine Beeinträchtigung des Bildgebungsbereichs zu vermeiden. Fixieren Sie die Probe so schnell wie möglich nach der Dissektion, um eine Degradation zu verhindern.Legen Sie die Darmschnitte in Histologiekassetten, indem Sie vorsichtig eine Gewebekante mit einer Pinzette halten. Schließen Sie die Kassette und tauchen Sie sie vollständig in frische Methacarn-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Lösung beim Eintauchen der Kassetten nicht älter als einige Stunden ist. Für klinische Proben, die in einer klinischen Suite ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt werden, verwenden Sie einen Polyethylen-Vorratsbehälter mit einer in den Deckel geschnittenen Klappe, die den Durchgang der Histologiekassetten ermöglicht.Kleben Sie diese Klappe zu, wenn Sie keine Proben passieren, um das Entweichen giftiger Dämpfe zu verhindern. Das Paraffin in einen hitzebeständigen Behälter geben und über Nacht in einem Ofen bei 60 Grad Celsius schmelzen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie die Flüssigkeit in den entsprechenden Abfallbehälter gießen und nacheinander in absolutem Methanol, absolutem Ethanol und Xylol inkubieren, wie im Textmanuskript beschrieben.Öffnen Sie die Kassetten leicht, damit das Paraffin eindringen kann, ohne die Gewebesegmente mit Doppelhandschuhen oder Pinzette zu verlieren. Tauchen und verschließen Sie die Kassetten in den Behälter mit geschmolzenem Paraffin. Stellen Sie den Behälter wieder in den 60 Grad Celsius heißen Ofen und achten Sie darauf, dass die Kassetten mit Paraffin gefüllt sind und keine großen Luftblasen zurückbleiben.Nach der Inkubation für zwei Stunden den Behälter aus dem Ofen nehmen. Entfernen Sie die Kassetten vorsichtig mit einer Pinzette. Den Ofen auf 60 Grad Celsius erhitzen und ein Coplin Glas vorwärmen.Fügen Sie genügend Volumen Xylol in eine Glasflasche hinzu, um die Glasobjektträger zweimal im Glas abzudecken, und legen Sie Parafilm um den Deckel, um die Verdunstung der Xylole zu verhindern. Lassen Sie die Temperatur der Xylole 60 Grad Celsius erreichen. Bereiten Sie die FISH-Hybridisierungslösung wie im Textmanuskript erwähnt vor.Legen Sie die Folien in das Coplin-Glas, stellen Sie sicher, dass die Abschnitte nicht mit anderen Objektträgern oder dem Glas in Berührung kommen, und backen Sie die Folien bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten. Füllen Sie das Coplin-Glas im Abzug mit vorgewärmten Xylolen aus dem Ofen und achten Sie darauf, nicht direkt auf die Proben zu gießen und möglicherweise das Gewebe zu entfernen. Stellen Sie das Coplin-Glas wieder in den 60-Grad-Ofen.Gießen Sie gebrauchte Xylole in einen geeigneten Abfallbehälter, achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte auf den Glasobjektträgern nicht zu stören, und verwenden Sie eine Zange, um zu verhindern, dass die Objektträger aus dem Coplin-Glas fallen. Füllen Sie das Coplin-Glas mit den restlichen Xylolen auf und inkubieren Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug. Inkubieren Sie die Abschnitte in 99,5% Ethanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie nach der Inkubation die Objektträger aus dem Coplin-Glas. Wischen Sie die Rückseite der Objektträger auf einem Labortuch oder einem Papiertuch ab und trocknen Sie sie kurz an der Luft, bis die Ethanoltröpfchen verschwunden sind. Erstellen Sie sehr enge Kreise um jeden Gewebeabschnitt mit einem Flüssigkeitsblocker oder PAP-Pen, um den Ausdehnungsbereich zu begrenzen, der von der Hybridisierungslösung abgedeckt werden muss, und vermeiden Sie den Kontakt von Tinte mit dem Abschnitt.Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor und fügen Sie 0,5 Mikrogramm Sonde pro 50 Mikroliter der verwendeten Lösung hinzu. Die Lösung wird auf die Abschnitte auf dem Objektträger pipettiert. Überlagern Sie den Abschnitt mit flexiblen Kunststoff-Deckgläsern, um sicherzustellen, dass das Volumen der verwendeten Flüssigkeit den gesamten Abschnitt abdeckt.Erstellen Sie eine feuchte Kammer mit einer Pipettenspitzenbox mit Tüchern oder Papiertüchern, die mit überschüssiger Hybridisierungslösung oder PBS getränkt wurden, um Feuchtigkeit bereitzustellen. Inkubieren Sie den Objektträger in der Feuchtkammer bei 45 bis 50 Grad Celsius für mindestens drei Stunden, abhängig von der eingestellten Sonde, um die Verdunstung zu reduzieren. Entfernen Sie die Kunststoff-Deckgläser und inkubieren Sie die Objektträger in FISH-Waschpuffer in einem Coplin-Glas, die beide auf 50 Grad Celsius vorgewärmt sind.Stellen Sie das Coplin Glas für 10 bis 20 Minuten wieder in den 50 Grad Celsius warmen Ofen. Entfernen Sie den FISH-Waschpuffer und ersetzen Sie ihn durch PBS im Coplin-Glas. Unmittelbar nach dem Nachfüllen des Coplin Glases mit PBS dekantieren Sie das PBS.Entfernen Sie die Objektträger aus dem Glas und pipettieren Sie den Gegenfleck oben auf dem gesamten Abschnitt, während Sie darauf achten, dass das Gewebe nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Bei vier Grad Celsius 45 Minuten lang inkubieren. Waschen Sie die Flecken dreimal schnell mit frischem PBS.Wischen Sie die Rückseite der Dias gegen ein Tuch oder Papiertuch und lassen Sie den größten Teil des PBS von den Abschnitten verdunsten, unterstützt durch eine Vakuumleitung, die mit einer Pipettenspitze verbunden ist. Montieren Sie die Abschnitte mit einem Montagemedium. Befestigen Sie die Deckgläser auf dem Dia, indem Sie die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack bemalen und dabei darauf achten, dass sie sich vom Rand des Dias fernhalten.Lassen Sie es bei Raumtemperatur aushärten. Bilder des distalen Dickdarms der Maus, die mit Muribaculum intestinale monokolonisiert ist, und der mit Muribaculum intestinale und Bacteroides thetaiotaomicron bi-kolonisierte, sind hier gezeigt. Die Proben wurden mit einer FISH-Sonde drei Prime Cyanin-3 markiert speziell für Muribaculum-Isolat markiert und auch mit dem Rhodamin-gebundenen Lektin UEA-1 und DAPI gegengefärbt.Die Bilder von Schnitten, die mit Cyanin-3 FISH, DAPI und kombinierten Cyanin-3 FISH- und DAPI-Kanälen gefärbt sind, zeigen die Lokalisation von Muribaculum intestinale. Alle bakterienförmigen und bakteriengroßen DAPI-Signale werden im Monokolonisationszustand mit Cyanin-3 markiert. Im Bi-Kolonisationszustand gibt es neben diesen Cyanin-3- und DAPI-Doppelpositivzellen DAPI-gefärbte Bakterienzellen, die wie erwartet Cyanin-3 negativ sind.Mit Ausnahme längerer fadenförmiger Bakterien sind größere DAPI-positive Strukturen Pflanzenmaterial oder Kerne von Wirtszellen. Ein Darmsegment, das in einer Tiefe geschnitten wurde, die einen Blick auf das Lumen sowie Längsansichten des Epithels und ein flaches Abschnittssegment bietet, das nur Querschnitte von Krypten und keine konstante Schleimschicht oder Bakterien zeigt, beweist, dass flache Schnitte keine luminalen Scheiben des Darms liefern. Ungleichmäßige Gewebe- oder Deckglasabdeckung führt zu verschwommenen und ungleichmäßig beleuchteten Fliesenscans.Ein Beispiel für normalen Hintergrund und hohen Hintergrund werden hier ebenfalls gezeigt. Wenn wir mehr über die Mikrobiota erfahren, wird es wirklich offensichtlich, dass Bulk-Assays wie sequenzieren nicht ausreichen, um wirklich zu bestimmen, was zwischen verschiedenen mikrobiellen Spezies passiert und wie sie miteinander interagieren. Und dafür brauchen wir wirklich Bildgebung.Diese Art von Technik hat einige wirklich wichtige Entdeckungen ermöglicht, zum Beispiel, dass der Entzug von Ballaststoffen aus der Nahrung eine Ausdünnung der Schleimschicht und möglicherweise eine Infektion durch Krankheitserreger verursacht, wie Studien der Martins-Gruppe, sowie Studien über die Auswirkungen von osmotischem Durchfall und wie die Erschöpfung der Schleimschicht wirklich sowohl den Wirt als auch die Mikrobiota beeinflusst. Und das waren Studien, die sowohl von der Sonnenberg-Gruppe als auch von unserer Gruppe durchgeführt wurden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Quelle: Ng, K. M., Tropini, C. Visualisierung der Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung, Lektinfärbung und Bildgebung. J. Vis. Exp. (2021).Dieses Video demonstriert das Verfahren der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), um die Darmmikrobiota im Darmgewebe der Maus zu färben, indem fluoreszierende Sonden mit bakterieller rRNA (Ribosomal-Ribonukleinsäure) hybridisiert und die Wirtsstrukturen für mikroskopische Analysen gegenfärben werden.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Darmbakterien in Maus-Darmschnitten

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Dieses Video zeigt die Visualisierung von Bakterien in deparaffinisiertem Blasengewebe von einem mit Harnwegen infizierten Patienten. Eine fluoreszenzmarkierte Sonde, die mit bakteriellen ribosomalen 16s-RNAs hybridisiert wurde, zeigt die gewebeassoziierten Bakterien und ihre Verteilung und liefert wertvolle räumliche Einblicke in ihre Dichte innerhalb der Probe.

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Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

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Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

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