Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Mikroben, die mit dem Wirt assoziiert sind, bilden dieses sehr komplexe Ökosystem, das wirklich Bildgebung erfordert, um verstanden zu werden. Und durch dieses Partikel zeigen wir Ihnen, wie Sie den Färbeprozess durchlaufen und eine Visualisierung der Wirtsmikrobiom-Schnittstelle erreichen. Das Verständnis der Biologie von wirtsassoziierten Bakterien erfordert ein Verständnis ihrer Lokalisation in Mikroumgebungen.

Und diese Technik wird es uns ermöglichen, einzelne Taxa in Wirtsumgebungen sowie im Kontext anderer Bakterien zu visualisieren. Durch diese Technik wird es möglich sein zu bestimmen, welche Bakterien möglicherweise durch das Wirtsgewebe eingedrungen sind, sowie festzustellen, ob Schlüsselmerkmale wie der Wirtsschleim erschöpft sein können. Bereiten Sie frisches Methacarn in einem kompatiblen Behälter mit 60% absolutem Methanol, 30% Chloroform und 10% Eisessig zu.

Schneiden Sie mit scharfen und sauberen Werkzeugen Darmsegmente von den Mäusen für die Bildgebung ab. Minimieren Sie die Störung der Probe so weit wie möglich und behandeln Sie die Abschnitte an ihren Graten, um eine Beeinträchtigung des Bildgebungsbereichs zu vermeiden. Fixieren Sie die Probe so schnell wie möglich nach der Dissektion, um eine Degradation zu verhindern.

Legen Sie die Darmschnitte in Histologiekassetten, indem Sie vorsichtig eine Gewebekante mit einer Pinzette halten. Schließen Sie die Kassette und tauchen Sie sie vollständig in frische Methacarn-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Lösung beim Eintauchen der Kassetten nicht älter als einige Stunden ist. Für klinische Proben, die in einer klinischen Suite ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt werden, verwenden Sie einen Polyethylen-Vorratsbehälter mit einer in den Deckel geschnittenen Klappe, die den Durchgang der Histologiekassetten ermöglicht.

Kleben Sie diese Klappe zu, wenn Sie keine Proben passieren, um das Entweichen giftiger Dämpfe zu verhindern. Das Paraffin in einen hitzebeständigen Behälter geben und über Nacht in einem Ofen bei 60 Grad Celsius schmelzen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie die Flüssigkeit in den entsprechenden Abfallbehälter gießen und nacheinander in absolutem Methanol, absolutem Ethanol und Xylol inkubieren, wie im Textmanuskript beschrieben.

Öffnen Sie die Kassetten leicht, damit das Paraffin eindringen kann, ohne die Gewebesegmente mit Doppelhandschuhen oder Pinzette zu verlieren. Tauchen und verschließen Sie die Kassetten in den Behälter mit geschmolzenem Paraffin. Stellen Sie den Behälter wieder in den 60 Grad Celsius heißen Ofen und achten Sie darauf, dass die Kassetten mit Paraffin gefüllt sind und keine großen Luftblasen zurückbleiben.

Nach der Inkubation für zwei Stunden den Behälter aus dem Ofen nehmen. Entfernen Sie die Kassetten vorsichtig mit einer Pinzette. Den Ofen auf 60 Grad Celsius erhitzen und ein Coplin Glas vorwärmen.

Fügen Sie genügend Volumen Xylol in eine Glasflasche hinzu, um die Glasobjektträger zweimal im Glas abzudecken, und legen Sie Parafilm um den Deckel, um die Verdunstung der Xylole zu verhindern. Lassen Sie die Temperatur der Xylole 60 Grad Celsius erreichen. Bereiten Sie die FISH-Hybridisierungslösung wie im Textmanuskript erwähnt vor.

Legen Sie die Folien in das Coplin-Glas, stellen Sie sicher, dass die Abschnitte nicht mit anderen Objektträgern oder dem Glas in Berührung kommen, und backen Sie die Folien bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten. Füllen Sie das Coplin-Glas im Abzug mit vorgewärmten Xylolen aus dem Ofen und achten Sie darauf, nicht direkt auf die Proben zu gießen und möglicherweise das Gewebe zu entfernen. Stellen Sie das Coplin-Glas wieder in den 60-Grad-Ofen.

Gießen Sie gebrauchte Xylole in einen geeigneten Abfallbehälter, achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte auf den Glasobjektträgern nicht zu stören, und verwenden Sie eine Zange, um zu verhindern, dass die Objektträger aus dem Coplin-Glas fallen. Füllen Sie das Coplin-Glas mit den restlichen Xylolen auf und inkubieren Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug. Inkubieren Sie die Abschnitte in 99,5% Ethanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach der Inkubation die Objektträger aus dem Coplin-Glas. Wischen Sie die Rückseite der Objektträger auf einem Labortuch oder einem Papiertuch ab und trocknen Sie sie kurz an der Luft, bis die Ethanoltröpfchen verschwunden sind. Erstellen Sie sehr enge Kreise um jeden Gewebeabschnitt mit einem Flüssigkeitsblocker oder PAP-Pen, um den Ausdehnungsbereich zu begrenzen, der von der Hybridisierungslösung abgedeckt werden muss, und vermeiden Sie den Kontakt von Tinte mit dem Abschnitt.

Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor und fügen Sie 0,5 Mikrogramm Sonde pro 50 Mikroliter der verwendeten Lösung hinzu. Die Lösung wird auf die Abschnitte auf dem Objektträger pipettiert. Überlagern Sie den Abschnitt mit flexiblen Kunststoff-Deckgläsern, um sicherzustellen, dass das Volumen der verwendeten Flüssigkeit den gesamten Abschnitt abdeckt.

Erstellen Sie eine feuchte Kammer mit einer Pipettenspitzenbox mit Tüchern oder Papiertüchern, die mit überschüssiger Hybridisierungslösung oder PBS getränkt wurden, um Feuchtigkeit bereitzustellen. Inkubieren Sie den Objektträger in der Feuchtkammer bei 45 bis 50 Grad Celsius für mindestens drei Stunden, abhängig von der eingestellten Sonde, um die Verdunstung zu reduzieren. Entfernen Sie die Kunststoff-Deckgläser und inkubieren Sie die Objektträger in FISH-Waschpuffer in einem Coplin-Glas, die beide auf 50 Grad Celsius vorgewärmt sind.

Stellen Sie das Coplin Glas für 10 bis 20 Minuten wieder in den 50 Grad Celsius warmen Ofen. Entfernen Sie den FISH-Waschpuffer und ersetzen Sie ihn durch PBS im Coplin-Glas. Unmittelbar nach dem Nachfüllen des Coplin Glases mit PBS dekantieren Sie das PBS.

Entfernen Sie die Objektträger aus dem Glas und pipettieren Sie den Gegenfleck oben auf dem gesamten Abschnitt, während Sie darauf achten, dass das Gewebe nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Bei vier Grad Celsius 45 Minuten lang inkubieren. Waschen Sie die Flecken dreimal schnell mit frischem PBS.

Wischen Sie die Rückseite der Dias gegen ein Tuch oder Papiertuch und lassen Sie den größten Teil des PBS von den Abschnitten verdunsten, unterstützt durch eine Vakuumleitung, die mit einer Pipettenspitze verbunden ist. Montieren Sie die Abschnitte mit einem Montagemedium. Befestigen Sie die Deckgläser auf dem Dia, indem Sie die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack bemalen und dabei darauf achten, dass sie sich vom Rand des Dias fernhalten.

Lassen Sie es bei Raumtemperatur aushärten. Bilder des distalen Dickdarms der Maus, die mit Muribaculum intestinale monokolonisiert ist, und der mit Muribaculum intestinale und Bacteroides thetaiotaomicron bi-kolonisierte, sind hier gezeigt. Die Proben wurden mit einer FISH-Sonde drei Prime Cyanin-3 markiert speziell für Muribaculum-Isolat markiert und auch mit dem Rhodamin-gebundenen Lektin UEA-1 und DAPI gegengefärbt.

Die Bilder von Schnitten, die mit Cyanin-3 FISH, DAPI und kombinierten Cyanin-3 FISH- und DAPI-Kanälen gefärbt sind, zeigen die Lokalisation von Muribaculum intestinale. Alle bakterienförmigen und bakteriengroßen DAPI-Signale werden im Monokolonisationszustand mit Cyanin-3 markiert. Im Bi-Kolonisationszustand gibt es neben diesen Cyanin-3- und DAPI-Doppelpositivzellen DAPI-gefärbte Bakterienzellen, die wie erwartet Cyanin-3 negativ sind.

Mit Ausnahme längerer fadenförmiger Bakterien sind größere DAPI-positive Strukturen Pflanzenmaterial oder Kerne von Wirtszellen. Ein Darmsegment, das in einer Tiefe geschnitten wurde, die einen Blick auf das Lumen sowie Längsansichten des Epithels und ein flaches Abschnittssegment bietet, das nur Querschnitte von Krypten und keine konstante Schleimschicht oder Bakterien zeigt, beweist, dass flache Schnitte keine luminalen Scheiben des Darms liefern. Ungleichmäßige Gewebe- oder Deckglasabdeckung führt zu verschwommenen und ungleichmäßig beleuchteten Fliesenscans.

Ein Beispiel für normalen Hintergrund und hohen Hintergrund werden hier ebenfalls gezeigt. Wenn wir mehr über die Mikrobiota erfahren, wird es wirklich offensichtlich, dass Bulk-Assays wie sequenzieren nicht ausreichen, um wirklich zu bestimmen, was zwischen verschiedenen mikrobiellen Spezies passiert und wie sie miteinander interagieren. Und dafür brauchen wir wirklich Bildgebung.

Diese Art von Technik hat einige wirklich wichtige Entdeckungen ermöglicht, zum Beispiel, dass der Entzug von Ballaststoffen aus der Nahrung eine Ausdünnung der Schleimschicht und möglicherweise eine Infektion durch Krankheitserreger verursacht, wie Studien der Martins-Gruppe, sowie Studien über die Auswirkungen von osmotischem Durchfall und wie die Erschöpfung der Schleimschicht wirklich sowohl den Wirt als auch die Mikrobiota beeinflusst. Und das waren Studien, die sowohl von der Sonnenberg-Gruppe als auch von unserer Gruppe durchgeführt wurden.