Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die räumlich-zeitliche Genexpressionsdynamik der Wirbeltiersegmentierungsuhr mit Hilfe von festen Gewebeproben abzubilden. Diese Methode ermöglicht eine unvoreingenommene Beurteilung der oszillatorischen Gendynamik im präsomitischen Mesoderm, und dies ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Somatogenese von Wirbeltieren steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass viele Proben gleichzeitig erzeugt und verarbeitet werden können, was eine hohe dreiteilige Analyse der Genexpressionsdynamik in fixiertem Gewebe ermöglicht.

Verfahren wird von Dr. Charlotte Bailey demonstriert, einer ehemaligen Postdoktorandin in meinem Labor. Nach der Gewinnung eines Maus-Gebärmutterhorns gemäß dem Textprotokoll wurde unter einem Stereomikroskop mit einer gebogenen Schere die dicke Muskelmembran des Gebärmutterhorns durchtrennt und jeder Embryo vorsichtig entnommen. Präparieren Sie mit einer gebogenen Schere und einer feinen Pinzette die Fruchtblase von jedem Embryo.

dann entweder mit einer chirurgischen Nadel oder einer gebogenen Schere das Schwanzgewebe von jedem Embryo, indem Sie den Embryo vor den Knospen der hinteren Gliedmaßen schneiden. Balancieren Sie das Schwanzgewebe mit der Bauchseite nach unten. Erzeugen Sie dann Paare von PSM-Explantaten, indem Sie das Schwanzgewebe entlang der Mittellinie in zwei Hälften zerlegen, indem Sie eine sanfte Schaukelbewegung mit der Nadel ausführen.

Stellen Sie sicher, dass das Neuralrohr, die Chorda und das PSM-Gewebe gleichmäßig auf die beiden Explantate aufgeteilt sind. Pipettieren Sie dann jedes kontralaterale PSM-Explantat auf die Unterseite eines 35-mm-Kunststoffdeckels in einer kleinen Menge vorgewärmtem Kulturmedium. Stellen Sie die Schale auf den Deckel und drehen Sie sie schnell um, so dass das PSM-Gewebe in einem hängenden Tropfen Medium vom Deckel hängt.

Anschließend kultivieren Sie die PSM-Explantate in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden. Übertragen Sie Paare von PSM-Explantaten in die einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Geben Sie dann 4 % Paraformaldehyd in PBS zu den Proben und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer schaukelnden Plattform.

Verwenden Sie nach der Inkubation PBS, um die Probenvertiefungen bei Raumtemperatur auf einer schaukelnden Plattform zu waschen. Wechseln Sie mit einer feinen Pasteurpipette aus Kunststoff die PBS-Lösung drei- bis viermal auf den Proben. Um eine Immunhistochemie durchzuführen, fügen Sie 2 %Triton X-100 in PBS zu einem PSM-Explantat von jedem Embryonalpaar hinzu und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer wippenden Plattform, um sie zu waschen.

Verwenden Sie PBS, um die Proben kurz zu spülen. Ersetzen Sie dann das PBS durch eine Blocklösung und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippplattform. Verdünnen Sie die gewünschten Primärantikörper mit einem Arbeitspuffer.

In diesem Beispiel werden Antikörper gegen Delta-like 1 und Notch1 in einer Verdünnung von 1:25 verwendet. Geben Sie die Antikörper zu den Explantaten und inkubieren Sie die Proben auf einer schaukelnden Plattform bei vier Grad Celsius für drei bis fünf Tage. Nach der Inkubation waschen Sie die Proben mit PBS zweimal für jeweils fünf bis zehn Minuten.

Führen Sie dann drei Wäschen in 0,3%Triton X-100 in PBS bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform durch. Nach der Verdünnung der Sekundärantikörper in einem Arbeitspuffer sind 250-500 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Probenvertiefung zu geben, wobei darauf zu achten ist, dass nicht die letzten Mikroliter der Lösung verwendet werden, die Antikörperaggregate enthalten können. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und inkubieren Sie die Proben in Sekundärantikörperlösung im Dunkeln bei vier Grad Celsius für drei bis fünf Tage.

Waschen Sie die Proben nach der Inkubation mit PBST zweimal für jeweils zehn Minuten. Waschen Sie das Taschentuch dann mit PBS einmal bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform für fünf Minuten. Gemäß dem Textprotokoll werden die verbleibenden kontralateralen PSM-Explantate durch eine Ethanol-PBST-Verdünnungsreihe dehydriert und rehydriert.

Geben Sie zehn Mikrogramm Proteinase K in 0,1 % PBST pro Milliliter zu den Explantaten und inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang ohne Rühren. Entfernen Sie dann schnell die Proteinase K-Lösung und spülen Sie die Proben mit PBST kurz ab. Fügen Sie 4 % Formaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd in PBST zu den PSM-Explantaten hinzu, um sie nachzufixieren, und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang.

Nachdem Sie die Proben mit PBST zweimal für jeweils zehn Minuten gewaschen haben, fügen Sie dem Gewebe eine 50%ige Hybridisierungsmischung hinzu und inkubieren Sie zehn Minuten lang bei 65 Grad Celsius ohne Rühren. Nach der Inkubation der Proben und der Hybridisierungsmischung gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie die Lösung und fügen Sie 0,25 bis 0,5 Milliliter vorgewärmte Hybridisierungsmischung hinzu, die eine Digoxigenin-markierte Antisense-RNA-Sonde gegen eine bekannte Segmentierungsuhrkomponente enthält. Verschließen Sie die Platte mit Klebeband und inkubieren Sie die Proben zwei Nächte lang bei 65 Grad Celsius.

Nach der Inkubation verwenden Sie eine vorgewärmte 50%ige Hybridisierungsmischung in TBST, um die Proben 15 Minuten lang zu waschen. Spülen Sie die Proben dann mit TBST zweimal, bevor Sie das Gewebe in TBST bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform 30 Minuten lang inkubieren. Als nächstes inkubieren Sie die Explantate mindestens zwei Stunden lang in Blocklösung.

Ersetzen Sie dann die Lösung durch eine frische Blockierungslösung, die eine Verdünnung von 1:200 HRB-konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörpern enthält. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag spülen Sie die Proben mit TBST dreimal bei Raumtemperatur und überführen sie in einzelne Vertiefungen einer neuen 24-Well-Gewebekulturplatte.

Waschen Sie dann mit TBST die Explantate dreimal für jeweils eine Stunde. Verwenden Sie ein Tyramid-Signalamplifikationskit, um die detektierte mRNA sichtbar zu machen, bevor Sie die Proben für die Bildgebung vorbereiten. Bereiten Sie für jedes Explantatpaar einen geladenen Adhäsionsglasobjektträger vor, indem Sie die Klebefolie von einem 0,12 mm dicken Abstandshalter entfernen und auf einen Objektträger kleben.

Nachdem Sie ein Paar oder Explantate gemäß dem Textprotokoll auf dem Objektträger positioniert haben, lassen Sie die Proben 45-60 Sekunden lang am Objektträger haften, bis das Gewebe anfängt, klebrig und durchscheinend zu erscheinen, ohne vollständig auszutrocknen. Entfernen Sie in der Zwischenzeit mit einer Pinzette die restliche Klebefolie vom Abstandshalter und geben Sie einen großen Tropfen Einbettmedium mit Doppelfunktion und Reinigungslösung auf die Proben in der Mitte des Abstandshalters. Bringen Sie ein kreisförmiges Deckglas über die Proben an, wobei darauf zu achten ist, dass das Einbettmedium gleichmäßig verteilt ist und alle Kanten den Abstandshalter berühren.

Legen Sie dann die Deckglasfolie kopfüber auf etwas fusselarmes Papier. Drücken Sie fest nach unten, um sicherzustellen, dass das Deckglas vollständig auf dem Abstandshalter haftet und überschüssiges Montagemedium entfernt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis kein Eindeckmedium mehr das Papier abtupft.

Reinigen und beschriften Sie den Objektträger und bewahren Sie ihn bis zur Bildgebung im Dunkeln auf. Führen Sie dann die Bildgebung und Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. In diesem Experiment wurde gezeigt, dass die Expression von Delta-Like 1 und Notch1 aus der Synchronität oszilliert, indem die Embryonen vorübergehend entsprechend der naszierenden Transkription des notch-regulierten Segmentierungsuhr-Gens intronischen lunatischen Saums angeordnet werden, der in der einen Hälfte jedes Explantatpaares nachgewiesen wurde.

Die Panels sind nach Phase eins, zwei und drei des Segmentierungstaktzyklus angeordnet. Die Ausdehnung der Expressionsdomänen für Delta-Like 1, Notch1 und den intronischen lunatischen Saum entlang der anteroposterioren Achse des PSM ist durch farbcodierte Balken abgegrenzt. Wie hier gezeigt, wird ein Diagramm zur Quantifizierung der Signalintensität von Delta-Like 1, Notch1 und intronischem Lunatic Fringe in Bezug auf die anteroposteriore Achse des PSM erstellt und die axiale Variation und Signalintensität über das PSM während des gesamten Taktzyklus veranschaulicht.

Kymographen visualisieren die räumliche Verteilung von Delta-Like 1, Notch1 und intronic lunatic fringe über zahlreiche PSMs. Jede Zeile des Kymographen repräsentiert die Signalintensität eines einzelnen PSM-Explantats. Die Quantifizierung der Intensität von Delta-Like 1, Notch1 und der intronischen lunatischen Streifensignalintensität in Bezug auf die anteroposteriore Achse des PSM zeigt eine klare oszillatorische Expressionsdynamik für diese Ziele.

Schließlich zeigen diese Kymographen die räumliche Verteilung der gespaltenen und aktivierten Form des Notch-Rezeptors NICD, des Delta-Like 1, des intronischen lunatischen Saums und des Notch1 über zahlreiche PSMs. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Mitogenese von Wirbeltieren geholfen, die Dynamik der Segmentierungs-Genoszillation beim präsomitischen Mesoderm von Küken und Mäusen besser zu verstehen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie an einer großen Anzahl von Proben durchgeführt werden, so dass die Expressionsprofile mehrerer mRNAs und Proteine von Interesse gleichzeitig analysiert werden können.

Nach diesem Verfahren kann eine zusätzliche Quantifizierung der Bilddaten ein Verständnis für zeitliche Verzögerungen in der Genexpression sowie für die subzelluläre Lokalisierung sowohl der RNA- als auch der Proteinsignale liefern, die für den Forscher von Interesse sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die räumlich-zeitliche Genexpressionsdynamik der Wirbeltiersegmentierungsuhr mithilfe von dicken Gewebeproben abbilden können. Daran kann sich eine automatisierte Bildanalyse anschließen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine gleichmäßige Verteilung von PSM, Notochord und Neuralrohr zwischen den PSM-Explantaten sicherzustellen und die Antikörperverdünnungen vor Beginn sorgfältig zu optimieren. Denken Sie daran, dass die Arbeit mit Formamid, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd äußerst gefährlich sein kann. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen und gegebenenfalls in einem Abzug zu arbeiten.