Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die räumlich-zeitlichen Genexpressionsdynamiken der Wirbeltier-Segmentationsuhr mithilfe der Analyse fixierten Gewebes abzubilden. Diese Methode ermöglicht eine unvoreingenommene Beurteilung der oszillatorischen Genaktivität im präsomitischen Mesoderm, was entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen ist, die die Somatogenese bei Wirbeltieren steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass viele Proben gleichzeitig erzeugt und verarbeitet werden können, wodurch eine umfassende dreidimensionale Analyse der Genexpressionsdynamik in fixiertem Gewebe ermöglicht wird.

Den Vorgang wird Dr. Charlotte Bailey demonstrieren, die ehemalige Postdoktorandin in meinem Labor. Nachdem gemäß Textprotokoll ein Uterushorn einer Maus gewonnen wurde, unter dem Stereomikroskop mit gebogenen Scheren die dicke Muskelschicht des Uterushorns durchtrennen und jedes Embryo vorsichtig entnehmen. Mit gebogenen Scheren und feinen Pinzetten die Amnionhülle von jedem Embryo ablösen.

Entnehmen Sie dann mithilfe einer chirurgischen Nadel oder einer gebogenen Schere das Schwanzgewebe von jedem Embryo, indem Sie den Embryo vor den hinteren Gliedmaßenanlagen durchtrennen. Legen Sie das Schwanzgewebe mit der ventralen Seite nach unten. Erzeugen Sie anschließend Paare von PSM-Explantaten, indem Sie das Schwanzgewebe entlang der Mittellinie in zwei Hälften sezieren, wobei Sie eine sanfte Schaukelbewegung mit der Nadel verwenden.

Stellen Sie sicher, dass Neuralrohr, Chorda und PSM-Gewebe gleichmäßig auf die beiden Explantate verteilt sind. Pipettieren Sie anschließend jedes kontralaterale PSM-Explantat in einem kleinen Volumen vorgewärmten Kulturmedium auf die Unterseite eines 35-mm-Kunststoffkulturschalen-Deckels. Stellen Sie die Schale auf den Deckel und drehen Sie sie schnell um, sodass das PSM-Gewebe im hängenden Tropfen des Mediums vom Deckel hängt.

Kultivieren Sie die PSM-Explantate anschließend eine bis zwei Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Überführen Sie Paare von PSM-Explantaten in die einzelnen Vertiefungen einer 24-Loch-Gewebekulturplatte. Geben Sie dann 4 % Paraformaldehyd in PBS zu den Proben hinzu und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer schwingenden Plattform.

Nach der Inkubation die Probenmulden bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform mit PBS waschen. Mit einer feinen plastischen Pasteurpipette die PBS-Lösung auf den Proben drei- bis viermal erneuern. Um die Immunhistochemie durchzuführen, 2 % Triton X-100 in PBS einem PSM-Explantat aus jedem embryonalen Paar hinzufügen und die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform inkubieren, um sie zu waschen.

Spülen Sie die Proben kurz mit PBS. Ersetzen Sie dann das PBS durch Blockierungslösung und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer schwingenden Plattform. Verdünnen Sie die gewünschten primären Antikörper in Arbeitspuffer.

In diesem Beispiel werden Antikörper gegen Delta-like 1 und Notch1 in einer Verdünnung von 1:25 verwendet. Geben Sie die Antikörper zu den Explantaten hinzu und inkubieren Sie die Proben drei bis fünf Tage lang auf einer schwingenden Plattform bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie die Proben zweimal mit PBS, jeweils fünf bis zehn Minuten.

Danach dreimal mit 0,3 % Triton X-100 in PBS bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform waschen. Nach der Verdünnung der sekundären Antikörper im Arbeitspuffer 250–500 Mikroliter der Antikörperlösung in jedes Probenloch geben, wobei darauf geachtet werden sollte, die letzten paar Mikroliter der Lösung nicht zu verwenden, da diese Antikörperaggregate enthalten können. Die Platte mit Aluminiumfolie abdecken und die Proben drei bis fünf Tage im Dunkeln bei vier Grad Celsius in der sekundären Antikörperlösung inkubieren.

Nach der Inkubation die Proben zweimal für jeweils zehn Minuten mit PBST waschen. Anschließend das Gewebe einmalig bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform fünf Minuten lang mit PBS waschen. Im Anschluss an das Textprotokoll die verbleibenden kontralateralen PSM-Explantate durch eine Verdünnungsreihe aus Ethanol und PBST dehydrieren und rehydrieren.

Geben Sie zehn Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K in 0,1 % PBST zu den Explantaten hinzu und inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang ohne Schütteln. Entfernen Sie dann schnell die Proteinase-K-Lösung und spülen Sie die Proben kurz mit PBST ab. Geben Sie 4 % Formaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd in PBST zu den PSM-Explantaten, um sie nachzufixieren, und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang.

Anschließend die Proben zweimal für jeweils zehn Minuten mit PBST waschen und dann 50 % Hybridisierungsmix zum Gewebe geben. Bei 65 Grad Celsius ohne Schütteln für zehn Minuten inkubieren. Nach der Inkubation von Proben und Hybridisierungsmix gemäß dem Textprotokoll die Lösung entfernen und 0,25 bis 0,5 Milliliter vorgewärmten Hybridisierungsmix hinzufügen, der eine mit Digoxigenin markierte Antisense-RNA-Sonde gegen eine bekannte Komponente der Segmentierungsuhr enthält. Die Platte mit Klebeband versiegeln und die Proben zwei Nächte lang bei 65 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation die Proben 15 Minuten lang mit vorgewärmter 50 %igen Hybridisierungslösung in TBST waschen. Anschließend die Proben zweimal mit TBST spülen und dann das Gewebe 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform in TBST inkubieren. Danach die Explantate mindestens zwei Stunden in der Blockierungslösung vorinkubieren.

Danach die Lösung durch frische Blockierungslösung ersetzen, die eine 1:200 Verdünnung des mit HRB konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörpers enthält. Die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Tag die Proben am Raumtemperatur dreimal mit TBST spülen und sie in einzelne Vertiefungen einer neuen 24-Loch-Gewebekulturplatte überführen.

Anschließend die Explantate dreimal für jeweils eine Stunde mit TBST waschen. Verwenden Sie ein Tyramid-Signalverstärkungs-Kit, um die nachgewiesene mRNA sichtbar zu machen, bevor Sie die Proben zur Bildgebung vorbereiten. Bereiten Sie je ein geladenes Haftglasobjektträger für jedes Explantatpaar vor, indem Sie die klebende Abstandshalterfolie von einem 0,12 mm dicken Bildgebungsabstandshalter entfernen und diesen auf einen Objektträger kleben.

Nachdem ein Paar Explantate gemäß dem Textprotokoll auf dem Objektträger positioniert wurde, sollten die Proben 45–60 Sekunden lang haften bleiben, bis das Gewebe klebrig und durchscheinend erscheint, ohne vollständig auszutrocknen. In der Zwischenzeit entfernen Sie mit einer Pinzette die restliche Klebefolie vom Abstandshalter und geben einen großen Tropfen des zweifunktionellen Montagemediums und Klärungslösung in die Mitte des Abstandshalters auf die Proben. Legen Sie eine runde Deckglasplatte über die Proben, wobei sichergestellt sein muss, dass das Montagemedium gleichmäßig verteilt ist und alle Ränder Kontakt mit dem Abstandshalter haben.

Danach das Deckglasobjektträger umgedreht auf ein wenig fusselndes Papier legen. Fest andrücken, um sicherzustellen, dass das Deckglas vollständig am Abstandshalter haftet und überschüssiges Einbettmedium entfernt wird. Diesen Vorgang wiederholen, bis kein Einbettmedium mehr das Papier befleckt.

Reinigen und beschriften Sie den Objektträger und lagern Sie ihn bis zur Bildaufnahme im Dunkeln. Führen Sie anschließend die Bildaufnahme und Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. In diesem Experiment wird gezeigt, dass die Proteinausprägung von Delta-Like 1 und Notch1 außer Phase oszilliert, indem die Embryonen vorübergehend entsprechend der neu entstehenden Transkription des durch Notch regulierten Segmentierungsuhr-Gens intronischen lunatic fringe angeordnet werden, das in der einen Hälfte jedes Explantenpaares nachgewiesen wird.

Die Darstellungen sind entsprechend der Phase eins, zwei und drei des Segmentierungsuhr-Zyklus angeordnet. Die Ausdehnung der Expressionsdomänen für Delta-Like 1, Notch1 und intronischen lunatic fringe entlang der anterioposterioren Achse des PSM werden durch farbkodierte Balken markiert. Wie hier gezeigt, wird eine Darstellung erstellt, um die Signalintensität von Delta-Like 1, Notch1 und intronischem lunatic fringe in Bezug auf die anterioposteriore Achse des PSM zu quantifizieren, und veranschaulicht die axiale Variation und Signalintensität entlang des PSM während des gesamten Uhrzyklus.

Kymographen veranschaulichen die räumliche Verteilung von Delta-Like 1, Notch1 und intronischem lunatic fringe in zahlreichen PSMs. Jede Zeile des Kymographen stellt die Signalintensität eines einzelnen PSM-Explantats dar. Die Quantifizierung der Signalintensität von Delta-Like 1, Notch1 und intronischem lunatic fringe in Bezug auf die anteroposteriore Achse des PSM zeigt klare oszillatorische Expressionsdynamiken für diese Zielstrukturen auf.

Schließlich zeigen diese Kymographien die räumliche Verteilung der gespaltenen und aktivierten Form des Notch-Rezeptors NICD, von Delta-Like 1, des intronischen lunatic fringe und von Notch1 über zahlreiche PSMs hinweg. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Vertebraten-Mitogenese geholfen, die Dynamik der Segmentierungsgen-Oszillationen im präsomitischen Mesoderm von Huhn und Maus besser zu verstehen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie an einer großen Anzahl von Proben durchgeführt werden, wodurch gleichzeitig die Expressionsprofile mehrerer mRNA-Moleküle und Proteine von Interesse analysiert werden können.

Nach Durchführung dieses Verfahrens kann eine zusätzliche Quantifizierung der Bilddaten ein Verständnis zeitlicher Verzögerungen in der Genexpression sowie der subzellulären Lokalisation sowohl der RNA- als auch der Proteinsignale, die für den Forscher von Interesse sind, ermöglichen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die räumlich-zeitlichen Dynamiken der Genexpression der Wirbeltier-Segmentierungsuhr mithilfe von dicken Gewebeproben kartieren kann. Dies kann durch eine automatisierte Bildanalyse ergänzt werden, wie sie im Textprotokoll ausführlich beschrieben ist.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, eine gleichmäßige Verteilung von PSM, Chorda und Neuralrohr zwischen den PSM-Explantaten sicherzustellen und die Antikörperverdünnungen vor Beginn sorgfältig zu optimieren. Beachten Sie, dass die Arbeit mit Formamid, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd äußerst gefährlich sein kann. Tragen Sie stets persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie, wo angebracht, in einem Abzug.