Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Das übergeordnete Ziel dieser Organkultur- und Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Methode ist es, den Prozess des Wolffschen Induktions-Coilings und der Entwicklung besser zu visualisieren und zu verstehen. Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie über die Mechanismen zu beantworten, die an der Entwicklung von Organform, -struktur und -funktion beteiligt sind. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie In-vivo-Systeme nachahmt und genauere Informationen liefert als Zellkulturstudien, bei denen es an Nischenfaktoren mangelt.

Legen Sie am 15. Tag nach der Empfängnis vor Mittag eine trächtige Maus in Rückenlage auf saugfähiges Seidenpapier und besprühen Sie die Bauchseite des Bauches mit 70 % Ethanol. Heben Sie mit einer Pinzette die untere Bauchhaut auf der Bauchseite des Tieres an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen seitlichen Schnitt, der sich von der Urogenitalöffnung bis zum Brustkorb erstreckt. Fassen Sie die Harnblase mit der Pinzette direkt über dem Gebärmutterhals und machen Sie einen Schnitt in die Gebärmutter.

Halten Sie die Harnblase fest und machen Sie einen Schnitt in das breite Band der Gebärmutter und den Übergang der Gebärmuttertuben, um die Gebärmutter vom paratenigalen Ansatz zu lösen. Legen Sie die Gebärmutter in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem HBSS und bewegen Sie das Gewebe vorsichtig, um das überschüssige Blut zu entfernen. Übertragen Sie die gespülte Gebärmutter in eine Petrischale, die frisches, eiskaltes HBSS auf Eis enthält, und schneiden Sie die Gebärmutterwand, um die Embryonen zu entfernen, und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit frischem HBSS auf Eis, während sie geerntet werden.

Setze einen Embryo mit der Seitenseite auf ein mit Ethanol getränktes Stück steriles Seidenpapier in eine neue Schale. Und verwenden Sie eine sterile Klinge, um einen diagonalen Schnitt über den Unterbauch des Tieres zu machen. Stecken Sie den Embryo auf eine sterile Schwammbasis entlang der Wirbelsäule und bewegen Sie den Embryo unter ein Präparier-Stereomikroskop.

Vorsichtig entlang der ventralen Mittellinie einschneiden und Leber und Darm entfernen. Das Urogenitalsystem sollte nun sichtbar sein. Machen Sie einen Schnitt in den Samenleiter und schließen Sie den Harnröhrenansatz.

Gefolgt von einem Schnitt, der die Befestigung des unteren Teils des Wolffschen Ganges am Gubernaculum vorsieht, um die Hoden und Wolffschen Gänge zu entnehmen. Legen Sie das Gewebe in eine neue Petrischale mit frischem HBSS auf Eis, während es gesammelt wird. Um die embryonalen Gonadenkämme zu kultivieren, geben Sie zunächst 300 Mikroliter Medium pro Vertiefung auf eine 24-Well-Zellkulturplatte.

Geben Sie als Nächstes einen kleinen Tropfen steriles HBSS in eine neue Petrischale und platzieren Sie eine 0,8 Mikrometer große Polycarbonat-Spurätzmembran auf dem Tropfen, wobei die glänzende Oberfläche zum HBSS zeigt. Legen Sie die Membran immer auf die Oberseite des HBSS-Tropfens, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen, wobei die raue Seite der Membran nach oben zeigt. Legen Sie mit einer sauberen Pinzette zwei Genitalleisten auf die raue Seite der Membran, ohne dass sich die Gewebe berühren.

Und verwenden Sie ein steriles Tuch, um das überschüssige HBSS zu entfernen. Während Sie die Genitalrippen auf die Membran übertragen, nehmen Sie die Probe zwischen den beiden Armen der Pinzette auf und achten Sie darauf, nach dem Transfer überschüssiges HBSS von der Membran zu entfernen, um ein zystisches Wachstum der Wolffschen Gänge zu verhindern. Setzen Sie dann die Membran in eine Vertiefung der 24-Well-Platte ein, um das Gewebe der Grenzfläche des Ohrmediums bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu kultivieren, wobei das Medium drei Tage lang täglich gewechselt wird.

Am vierten Tag der Kultur werden sich die abgewickelten Wolff'schen Kanäle in stark gewundene Rohre verwandelt haben. Um das Gewebe für die Immunfluorszene des gesamten Mount zu fixieren, übertragen Sie die Membranen mit den kultivierten Gonaden und Wolff'schen Gängen in neue Petrischale, die eiskaltes PBS enthalten. Die Membranen schwimmen auf dem PBS.

Verwenden Sie die Pinzettenspitze, um die Membranen zu senken. Und übertragen Sie das kultivierte Gonadengewebe in 4% Paraformaldehyd. Spülen Sie die Proben nach der Fixierung mit drei 10-minütigen Waschgängen in PBS plus Triton X unter leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur.

Dehydrieren Sie dann das Gewebe in einer abgestuften Ethanol-Serie für 10 Minuten für jedes Eintauchen bei vier Grad Celsius und 30 Umdrehungen pro Minute. Um die Proben zwischen den Immersionen zu wechseln, lassen Sie das Gewebe in den letzten zwei Minuten der Dehydrierung absetzen. Entfernen Sie dann so viel Alkohol wie möglich, ohne das Taschentuch zu berühren, und fügen Sie die nächsthöhere Konzentration Ethanol hinzu.

Nach der letzten Dehydrierung rehydrieren Sie das Gewebe in einer umgekehrt abgestuften Ethanolserie, wie gerade gezeigt. Waschen Sie dann die Taschentücher in PBS plus Triton X viermal für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Und 30 Umdrehungen pro Minute für jede Wäsche.

Blockieren Sie das Gewebe für eine Stunde bei Raumtemperatur mit Blotting-Puffer, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius und 30 Umdrehungen pro Minute im primären Antikörper von Interesse. Waschen Sie das Taschentuch am nächsten Tag viermal in PBS plus fettfreiem Milchpulver in Tween für 30 Minuten bei Raumtemperatur und 30 Umdrehungen pro Minute für jede Wäsche. Nach der letzten Wäsche das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur, unter langsamem Schaukeln und lichtgeschützt mit dem entsprechenden Sekundärantikörper beschriften.

Waschen Sie dann die Taschentücher dreimal in PBS plus Tween. Und analysieren Sie die Proben mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Im Laufe der Entwicklung erfährt der Wolff'sche Kanal signifikante Veränderungen, wobei ein einfaches und gerades Rohr in einen hochkomplexen und spiralförmigen Kanal verwandelt wird.

Um die molekularen Mechanismen der Morphogenese des Wolffschen Gangs zu entschlüsseln, kann das Kulturmedium mit Inhibitoren und Aktivatoren ergänzt werden, die auf verschiedene Signalwege abzielen. Zum Beispiel blieb dieser Wolff'sche Gang nach dreitägiger Kultivierung in Gegenwart eines eins-zu-signal-spezifischen Inhibitors abgewickelt. Ein Weg, der anscheinend am Coiling beteiligt ist.

Die Immunfärbung von Wolff'schen Gängen zeigt die Expression von Cytokeratin-8 und das Vorhandensein von PH3-positiven proliferierenden Zellen und dreitägigen Kulturgeweben sowie die Expression von Beta-Catenin in frisch isolierten ganzen montierten Geweben am Tag 18,5 nach der Empfängnis. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf bis 10 Minuten pro Embryo abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Durch dieses Verfahren können pharmakologische Wirkstoffe oder Hormone an den Kulturorganen getestet werden, um zusätzliche Fragen über die direkte Wirkung dieser Wirkstoffe auf bestimmte Gonadengewebe zu beantworten.

Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die Genitalleisten nicht direkt mit der Pinzette zu greifen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, um die Mechanismen zu erforschen, die an der Entwicklung angeborener Anomalien und Anomalien des Fortpflanzungssystems beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gentilrippen kultiviert und eine Immunfluoreszenz mit ganzem Mount durchführt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass beim Umgang mit diesem Material immer persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollte.