Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, multiciliierte Zellen des Zebrafisches in situ zu markieren und sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche Faktoren die multiciliierten Sulfate in der embryonalen Zebrafischniere regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl Protein- als auch RNA-Transkripte gleichzeitig markiert werden können, was in Abwesenheit von zebrafischspezifischen Antikörpern nützlich ist.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir bei der Analyse des Vorhandenseins von Zilien im Pronephros das Vorhandensein von Zilien nach Veränderungen am Embryo markierten. Beginnen Sie damit, die Zebrafischembryonen 24 Stunden nach der Befruchtung in fünf Millilitern 4%igem Paraformaldehyd für zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur zu fixieren, ohne zu rühren. Als nächstes waschen Sie die Embryonen zweimal in PBS mit 0,1 % Tween 20 oder PBST, gefolgt von einer Wäsche mit fünf Millilitern 100 % Methanol.

Dann inkubieren Sie die Embryonen in fünf Millilitern frischem 100%igem Ethanol für mindestens 20 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Um die Embryonen für die Hybridisierung vorzubereiten, rehydrieren Sie die Neugeborenen fünf Minuten lang in fünf Millilitern 50 % Methanol und PBST, gefolgt von fünf Minuten in fünf Millilitern 30 % Methanol und PBST. Waschen Sie die Embryonen zweimal für jeweils fünf Minuten in fünf Millilitern PBST und inkubieren Sie die Embryonen zwei Minuten lang in fünf Millilitern einer Eins-zu-1.000 Proteinase K und PBST-Lösung, unmittelbar gefolgt von zwei weiteren Wäschen in fünf Millilitern PBST.

Fixieren Sie die Embryonen mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in fünf Millilitern 4%igem Paraformaldehyd, gefolgt von zwei Wäschen in fünf Millilitern PBST 20. Um die Wechselwirkungen zwischen den Embryonen und der Hybridisierungslösung zu erleichtern, werden die Embryonen in fünf Milliliter PBST in aufrechte Mikrozentrifugenröhrchen mit flachem Boden in ein Mikrozentrifugengestell überführt und die Embryonen zweimal für jeweils fünf Minuten in 1,5 Millilitern Hybridisierungslösung gewaschen. Nach dem zweiten Waschen inkubieren Sie die Embryonen in 1,5 Millilitern frischer Hybridisierungslösung bei 70 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen für vier bis sechs Stunden.

Ersetzen Sie dann die Hybridisierungslösung durch 10 Mikroliter RNA-Sonde von Interesse und 500 Mikroliter Hybridisierungslösung für eine Sondenhybridisierung über Nacht bei 70 Grad Celsius. Waschen Sie die Embryonen am nächsten Morgen zweimal in 1,5 Millilitern 50%igem Formamid und 2x Kochsalz-Natriumcitrat-Puffer oder SSC für 20 bis 30 Minuten pro Waschgang bei 70 Grad Celsius. Waschen Sie die Embryonen dann einmal in 1,5 Millilitern 2X SSC allein bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von zwei Wäschen in 1,5 Millilitern 0,2X SSC bei 70 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten pro Waschgang.

Ersetzen Sie nach dem zweiten Waschen das 0,2-fache SSC durch 1,5 Milliliter Blockierungsreagenz für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Blockierungsreagenz durch 0,2 Milliliter Anti-Digoxin in Meerrettichperoxidase und Blockierungsreagenz im Verhältnis eins zu 1.000 für eine dreistündige Inkubation bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt ist. Waschen Sie die Embryonen dann zwei- bis viermal in 1,5 Millilitern Apfelsäurepuffer für 10 bis 15 Minuten pro Waschgang, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius in 1,5 Millilitern frischem Apfelsäurepuffer.

Ersetzen Sie am nächsten Morgen den Apfelsäurepuffer durch 1,5 Milliliter PBS und waschen Sie die Embryonen zweimal in 1,5 Millilitern PBS für fünf Minuten pro Waschgang. Inkubieren Sie die Embryonen 60 Minuten lang in 0,2 Millilitern fluoreszierender Si3-Fluoreszenzlösung, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden 10-minütigen Wäschen in 1,5 Millilitern aufsteigender Methanolkonzentration. Nach der letzten Inkubation inkubieren Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in 1,5 Millilitern 1%igem Wasserstoffperoxid und Methanol für 30 Minuten.

Waschen Sie dann die Embryonen 10 Minuten lang pro Waschgang in 1,5 Millilitern absteigender Methanollösung, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in 1,5 Millilitern PBS. Als nächstes waschen Sie die Embryonen fünf Minuten lang in 1,5 Millilitern doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von einer siebenminütigen Wäsche in 1,5 Millilitern Aceton mit minus 20 Grad Celsius. Waschen Sie die Embryonen fünf Minuten lang in weiteren 1,5 Millilitern doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche in 1,5 Millilitern PBST mit 1%DMSO oder PBDT.

Inkubieren Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in 1,5 Millilitern PBDT mit 10 % FBS auf einer Wippe für zwei Stunden. Ersetzen Sie dann PBDT und FBS durch 1,5 Milliliter der Primärantikörper für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen waschen Sie die Embryonen eine Minute lang in 1,5 Millilitern PBDT, FBS und 0,1 molaren Natriumchlorid unter Schaukeln, gefolgt von fünf 30-minütigen Schaukeln in 1,5 Millilitern PBDT, FBS und Natriumchlorid.

Waschen Sie die Embryonen nach dem letzten Waschen einmal in 1,5 Millilitern PBDT und FBS nur für 30 Minuten unter Schaukeln, gefolgt von einer Inkubation über Nacht in 200 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper bei vier Grad Celsius lichtgeschützt. Waschen Sie die Embryonen am nächsten Morgen schnell zweimal in 1,5 Millilitern PBDT, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in 1,5 Millilitern DAPI auf einer Wippe. Waschen Sie dann die Embryonen dreimal in 1,5 Millilitern PBDT mit FBS und Natriumchlorid für 15 bis 20 Minuten pro Waschgang und lagern Sie die Embryonen in 1,5 Millilitern PBDT bei vier Grad Celsius geschützt vor dem Umgebungslicht.

Um die Nieren des Zebrafisches abzubilden, legen Sie die Embryonen seitlich auf Objektträger in etwa 10 Mikroliter PBDT. Drücken Sie mit einer feinen Pinzette und einem Präpariermikroskop den ersten Embryo hinter die Augen, um den Kopf und einen Teil der Dotterkugel zu entfernen. Kratzen Sie dann vorsichtig die restliche Dotterkugel vom Embryokörper ab.

Achten Sie beim Entfernen der Dotterkugel darauf, die Dottersackverlängerung nicht zu berühren, da das Gewebe von Interesse leicht reißt und sich direkt über der Verlängerung befindet. Verwenden Sie ein dünnes Taschentuch, um das dissoziierte Eigelb und die überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger zu entfernen. Geben Sie dann einen Tropfen Einbettmedium auf das verbleibende Heck und positionieren Sie das Heck seitlich.

Glätten Sie das Ende mit einem Deckglas und legen Sie das Dia in eine abgedeckte Diabox. Verwenden Sie dann das 60X-Objektiv an einem konfokalen Mikroskop, um die Zilien der Niere auf den entsprechenden Fluoreszenzkanälen abzubilden. In den folgenden repräsentativen Bildern eines Zebrafischembryos, der wie gerade gezeigt gefärbt wurde, können multiciliierte Zellen anhand der Visualisierung der Antisense-Ribosonde identifiziert werden, die zur Erkennung der ODF3B-Transkriptexpression verwendet wird, der Gameten-Tubulin-markierten Basalkörper und der acetylierten Alpha-Tubulin-markierten Zilien.

Tatsächlich kann bei dieser Vergrößerung des embryonalen Pronephros eine multiziliierte Zelle mit ODF3B-Transkripten, mehreren Basalkörpern und Zilien beobachtet werden. Die benachbarte monociliierte Zelle kann durch ihren einzelnen Basalkörper und ihren einzelnen Zilium-Phänotyp unterschieden werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, frisch fixierte Embryonen zu verwenden und die Proben vor Umgebungslicht zu schützen, nachdem der erste Antikörper hinzugefügt wurde.