Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, multiziliäre Zellen des Zebrabärblings in situ zu markieren und sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren die multiziliären Zellen in der embryonalen Zebrabärblingniese regulieren. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sowohl Proteine als auch RNA-Transkripte gleichzeitig markiert werden können, was besonders nützlich ist, wenn spezifische Antikörper für den Zebrabärbling nicht verfügbar sind.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir mehrzilige Zellen im Pronephros markieren wollten, um die Anwesenheit von Zilien nach Veränderungen am Embryo zu analysieren. Fixieren Sie zunächst die Zebrafischembryonen 24 Stunden nach der Befruchtung in fünf Milliliter 4 % Paraformaldehyd zwei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Waschen Sie danach die Embryonen zwei Mal in PBS mit 0,1 % Tween 20 oder PBST und anschließend einmal mit fünf Milliliter 100 % Methanol.

Anschießend inkubieren Sie die Embryonen in fünf Milliliter frischem 100 % Ethanol mindestens 20 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Um die Embryonen für die Hybridisierung vorzubereiten, rehydrieren Sie die Neugeborenen in fünf Milliliter 50 % Methanol und PBST für fünf Minuten, gefolgt von fünf Minuten in fünf Milliliter 30 % Methanol und PBST. Waschen Sie die Embryonen zweimal je fünf Minuten in fünf Milliliter PBST und inkubieren Sie die Embryonen in fünf Milliliter einer 1:1.000-Proteinase-K-Lösung in PBST für zwei Minuten, unmittelbar gefolgt von zwei weiteren Waschschritten in jeweils fünf Milliliter PBST.

Fixieren Sie die Embryonen in fünf Millilitern 4 % Paraformaldehyd für mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Waschungen in jeweils fünf Millilitern PBST 20. Um die Wechselwirkungen zwischen den Embryonen und der Hybridisierungslösung zu erleichtern, überführen Sie die Embryonen in fünf Milliliter PBST in aufrechte, flachbodige Mikrozentrifugenröhrchen in einem Mikrozentrifugenständer und waschen Sie die Embryonen zweimal je fünf Minuten in 1,5 Millilitern Hybridisierungslösung. Nach der zweiten Waschung inkubieren Sie die Embryonen in 1,5 Millilitern frischer Hybridisierungslösung bei 70 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen für vier bis sechs Stunden.

Danach ersetzen Sie die Hybridisierungslösung durch 10 Mikroliter der gewünschten RNA-Sonde und 500 Mikroliter Hybridisierungslösung für eine Übernachthybridisierung bei 70 Grad Celsius. Am nächsten Morgen waschen Sie die Embryonen zweimal in jeweils 1,5 Milliliter 50 % Formamid und 2X Salinen-Natrium-Citrat-Puffer oder SSC bei 70 Grad Celsius, wobei jede Waschung 20 bis 30 Minuten dauert. Anschließend waschen Sie die Embryonen einmal in 1,5 Milliliter 2X SSC allein bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von zwei Waschungen in jeweils 1,5 Milliliter 0,2X SSC bei 70 Grad Celsius, wobei jede Waschung 20 bis 30 Minuten dauert.

Nach der zweiten Wäsche das 0,2× SSC durch 1,5 Milliliter Blockier-Reagenz ersetzen und eine Übernacht-Inkubation bei vier Grad Celsius durchführen. Am nächsten Morgen das Blockier-Reagenz durch 0,2 Milliliter Anti-Digoxigenin-Antikörper in Rettichperoxidase und Blockier-Reagenz im Verdünnungsverhältnis 1:1.000 ersetzen und drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Anschließend die Embryonen zwei bis viermal mit jeweils 1,5 Milliliter Malpufferpuffer waschen, wobei jede Wäsche 10 bis 15 Minuten dauert, gefolgt von einer Übernacht-Inkubation bei vier Grad Celsius in 1,5 Milliliter frischem Malpufferpuffer.

Am nächsten Morgen ersetzen Sie den Apfelsäure-Puffer durch 1,5 Milliliter PBS und waschen Sie die Embryonen zwei Mal mit jeweils 1,5 Milliliter PBS, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Inkubieren Sie die Embryonen für 60 Minuten in 0,2 Milliliter Si3-Fluoreszenz-Stillstehlösung, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden 10-minütigen Wäschen in 1,5 Milliliter Methanol mit ansteigender Konzentration. Nach der letzten Inkubation inkubieren Sie die Embryonen bei Raumtemperatur für 30 Minuten in 1,5 Milliliter 1 % Wasserstoffperoxid in Methanol.

Waschen Sie die Embryonen anschließend jeweils 10 Minuten lang in 1,5 Milliliter absteigenden Methanollösungen, gefolgt von zwei Waschungen mit jeweils fünfminütiger Dauer in 1,5 Milliliter PBS. Danach waschen Sie die Embryonen 5 Minuten lang in 1,5 Milliliter zweifach destilliertem Wasser, gefolgt von einer siebenminütigen Waschung in 1,5 Milliliter Aceton bei minus 20 Grad Celsius. Anschließend waschen Sie die Embryonen erneut 5 Minuten lang in 1,5 Milliliter zweifach destilliertem Wasser, gefolgt von einer fünfminütigen Waschung in 1,5 Milliliter PBST mit 1 % DMSO oder PBDT.

Die Embryonen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 1,5 Milliliter PBDT mit 10 % FBS auf einem Rüttler inkubieren. Danach das PBDT und FBS durch 1,5 Milliliter der primären Antikörper ersetzen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Morgen die Embryonen einmal eine Minute lang mit Rütteln in 1,5 Milliliter PBDT, FBS und 0,1 molarem Natriumchlorid waschen, gefolgt von fünfmal 30-minütigen Waschgängen mit Rütteln in jeweils 1,5 Milliliter PBDT, FBS und Natriumchlorid.

Nach der letzten Waschung die Embryonen ein Mal 30 Minuten lang mit Schütteln in 1,5 Milliliter PBDT und FBS waschen, gefolgt von einer Übernachtsinkubation in 200 Mikroliter der geeigneten sekundären Antikörper bei vier Grad Celsius, lichtgeschützt. Am nächsten Morgen die Embryonen kurz zwei Mal in 1,5 Milliliter PBDT waschen, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in 1,5 Milliliter DAPI auf einem Schüttler. Anschließend die Embryonen dreimal in 1,5 Milliliter PBDT mit FBS und Natriumchlorid waschen, jeweils 15 bis 20 Minuten pro Waschung, und die Embryonen in 1,5 Milliliter PBDT bei vier Grad Celsius, vor Umgebungslicht geschützt, lagern.

Um die Nieren von Zebrafischen abzubilden, legen Sie die Embryonen seitlich auf Objektträger in etwa 10 Mikrolitern PBDT. Drücken Sie mit einer feinen Pinzette und unter Verwendung eines Stereomikroskops den ersten Embryo hinter den Augen zusammen, um den Kopf und einen Teil des Dottersacks zu entfernen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den verbleibenden Dottersack vom Embryokörper.

Während des Entfernens des Eigelbkügelchens darauf achten, den Dottersackfortsatz nicht zu berühren, da das Gewebe von Interesse leicht einreißt und sich direkt oberhalb des Fortsatzes befindet. Mit einem dünnen Tuch das dissoziierte Eigelb und überschüssige Flüssigkeit vom Objektträger entfernen. Anschließend einen Tropfen Eindeckmedium auf den verbleibenden Schwanz geben und den Schwanz seitlich positionieren.

Flachen Sie den Schwanz mit einem Deckglas ab und legen Sie die Probe in eine geschlossene Objektträgerbox. Verwenden Sie dann das 60X-Objektiv eines konfokalen Mikroskops, um die Zilien der Niere auf den geeigneten fluoreszierenden Kanälen abzubilden. In den folgenden repräsentativen Bildern eines Zebrafischembryos, der wie gerade gezeigt gefärbt wurde, können multiziliäre Zellen anhand der Sichtbarmachung des Antisense-Riboprobes identifiziert werden, das zur Erkennung der ODF3B-Transkriptexpression verwendet wurde, sowie der mit Gametentubulin markierten Basalkörper und der mit acetyliertem alpha-Tubulin markierten Zilien.

Tatsächlich ist bei dieser Vergrößerung des embryonalen Pronephros eine mehrgegeißelte Zelle mit ODF3B-Transkripten, mehreren Basalkörpern und Geißeln zu erkennen. Die benachbarte eingegeißelte Zelle lässt sich anhand ihres einzelnen Basalkörpers und des eingeißeligen Phänotyps unterscheiden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, frisch fixierte Embryonen zu verwenden und die Proben ab dem Zeitpunkt des ersten Antikörpers vor Umgebungslicht zu schützen.