Name: Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von multiciliären Zellen in Danio rerio durch kombinierte In-Situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Diese Methode ermöglicht die simultane Markierung von Proteinen und RNA-Transkripten in der Embryonalniere.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die Gewährung R01DK100237 R.A.W und der National Science Foundation Graduate Research Fellowship No unterstützt. DGE-1313583, A.N.M. Wir bedanken uns auch bei der Hochschule der Wissenschaft Sommer Undergraduate Research Fellowship Program zur Unterstützung der M.U. Wir möchten das Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre Dame für ihre engagierte Betreuung unserer Zebrafisch danken. Wir möchten auch Danke, Abteilung der biologischen Wissenschaften sowie die Mitglieder unseres Labors für all ihre Unterstützung und wertvolle Einblicke.

Das folgende Protokoll verwendet Zebrafish Erwachsenen gepflegt und umsorgt vom Center for Zebrafish Research an der University of Notre Dame. Alle Methoden für die Arbeit mit Erwachsenen Zebrafisch und Embryonen wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt.
(1) Embryo Fixierung
<ol><li>Sammeln Sie Zebrafisch-Embryonen mit oben beschriebenen Methoden39,40. Um 24 Uhr hpf, 500 µL unspezifische Protease-Mischung-Lösung (50 mg/mL) auf der E3 in einem Embryo dish Inkubation bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.</li>
	<li>Wenn Embryonen beginnen, ausbrechen aus dem Chorion, entfernen Sie alle Flüssigkeit aus der Embryo-Schale.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen 2-3 Mal mit frischen E3 indem etwa 20 mL der E3, sanft wirbeln die E3 in der Schale, und dann die Flüssigkeit in eine flüssige Abfälle Gefäß umfüllen.</li>
	<li>Um die Embryonen einschläfern vor der Befestigung, fügen Sie 2 mL 0,2 % Tricaine auf der E3.</li>
	<li>Transfer der Embryonen in eine 5 mL-Glasflasche mit einem Kunststoff Pasteurpipette. Entfernen Sie die meisten der Tricaine/E3-Lösung mit der Pipette, nachdem die Embryonen auf den Boden des Röhrchens niedergelassen haben.</li>
	<li>Beheben Sie 24 hpf-Embryonen mit 5 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 2-4 h bei RT, ohne Aufregung. Achtung: PFA ist giftig und PFA-Lösungen unter einem chemischen Haube bearbeitet werden sollen, während die Forscher Augenschutz, Handschuhe und einen Laborkittel trägt. Vorbereitung der PFA-Fixativ aus dem granulierten PFA-Pulver sollte mit außerordentlicher Sorgfalt durchgeführt werden, da die granulierte PFA tendenziell durch statische Aufladung zu zerstreuen. Hinweis: Embryonen können beheben in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C. Bereiten Sie 4 % PFA durch Erhitzen 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) aufkochen ständig rühren die Lösung vollständig granulierte PFA auflösen. Sobald die Lösung wieder auf RT, die 4 % PFA Filter abgekühlt ist ist, indem man es durch ein 0,45 µm Einweg-System für Vakuumfiltration, sterilisiert dann und regelmÄÑig in 15 mL oder 50 mL Portionen für die Lagerung bei-20 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die 4 % PFA und waschen Embryonen zweimal mit 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (PBST) bei RT waschen die Embryonen einmal mit 5 mL 100 % Methanol (MeOH) bei RT hinzufügen 5 mL frische 100 % MeOH, die Embryonen und bei-20 ° C für mindestens 20 min inkubieren. Hinweis: Embryonen können gespeichert werden, in 100 % MeOH bei-20 ° C bis zum Embryo Vorbereitung bereit.</li>
</ol>(2) Embryo Vorbereitung und Hybridisierung
<ol><li>Rehydrieren die Embryonen durch Waschen einmal in 5 mL 50 % MeOH in 1 X PBST für 5 min bei RT weiter Rehydratation durch Waschen der Embryonen in 5 mL 30 % MeOH in 1 X PBST für 5 min bei RT waschen die Embryonen in 5 mL 1 X PBST zweimal für 5 min bei RT.</li>
	<li>Permeabilize die Embryonen von brüten sie in 5 mL einer Lösung von 1:1,000 Proteinase K (pK) (10 mg/mL) in 1 X PBST für 2 min bei RT Hinweis: Ältere Embryonen können länger als 2 min in die pK-Konzentration bereits erwähnt, aber eine Konzentration von 5 mg/mL und Inkubation Zeit weniger als 2 min. für Embryonen jünger als 24 vorgeschlagen inkubiert hpf.</li>
	<li>Entfernen Sie pK-Lösung und waschen sofort in 5 mL 1 x PBST zweimal bei RT beheben die Embryonen in 5 mL 4 % PFA bei RT für mindestens 20 Minuten. Hinweis: Embryonen können beheben in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie PFA und waschen zweimal in 5 mL 1 X PBST bei RT</li>
	<li>Transferieren Sie die Embryonen in 5 mL 1 X PBST in flachen Boden Mikrozentrifugenröhrchen platziert aufrecht in einem Microcentrifuge Rack bei RT, Interaktionen zwischen jedem Embryo und der nachfolgende Hybridisierung Lösung zu erleichtern.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen zweimal in 1,5 mL Hybridisierung Lösung (Hyb +) bei RT Add 1,5 mL frische Hyb + und inkubieren Sie Embryonen bei 70 ° C im Ofen für ca. 4-6 h Hybridisierung.</li>
	<li>Die 1,5 mL Hyb + mit einem Volumen von Sonde Lösung zu ersetzen (10 µL RNA-Sonde/500 µL Hyb +) ausreichen, um die Embryonen in vollem Umfang abdecken. Hinweis: Synthetisieren Sie Antisense RNA-Sonde, die zuvor mit Methoden39beschrieben.</li>
	<li>Hybridisieren Sie die Sonde über Nacht im Backofen bei 70 ° C Hybridisierung mit der Einzelrohre positioniert aufrecht im Microcentrifuge Rack ohne schütteln.</li>
</ol>3. heiße Waschungen und blockieren
Hinweis: Heiße Waschungen erfolgen durch die Embryonen die geeignete Lösung aufsetzen und dann im Ofen bei 70 ° c Hybridisierung Inkubation Um die Waschlösungen bei 70 ° C zu halten, 50 mL Röhrchen jeder Lösung in der Hybridisierung Backofen stellen wenn die Sonde / Hyb + Mischung hinzugefügt.
<ol><li>Entfernen Sie die Sonde. Waschen Sie die Embryonen zweimal bei 70 ° C in 1,5 mL 50 % Formamid/2 x Puffer Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für 20-30 min. Hinweis: Die Sonde kann in Hyb + bei-20 ° C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt wieder verwendet.</li>
	<li>Einmal waschen die Embryonen bei 70 ° C in 1,5 mL 2 X SSC für 15 min. Waschen die Embryonen zweimal bei 70 ° C in 1,5 mL 0,2 X SSC für 20-30 min. Ersetzen 0,2 X SSC mit 1,5 mL blockierende Reagenzien und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Es ist möglich, blockierende Reagenzien bei RT für 4 h statt über Nacht inkubieren.</li>
</ol>(4) Antikörper Inkubationszeit und Maleic Acid Buffer Wäschen
Hinweis: Bewahren Sie Embryonen vor Licht geschützt.
<ol><li>Blocking Reagenz mit 0,2 mL anti-DIG-POD in blockierende Reagenzien in einem Verhältnis von 1:1,000 zu ersetzen und 3 h unter Folie oder einem anderen lichtundurchlässigen decken bei RT inkubieren Hinweis: Alternativ kann die Antikörper über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie nach 3 h die Embryonen in 1,5 mL Maleic Acid Puffer 2-4 Mal für 10-15 min bei RT inkubieren der Embryonen über bei 4 ° C in 1,5 mL frischen Maleic Säure-Puffer Nacht. Hinweis: Es ist nicht notwendig, über Nacht in Maleic Acid Puffer inkubieren, aber dabei sinkt also Sonde Hintergrund.</li>
</ol>5. probe Erkennung und Entfernung von Peroxidase
Hinweis: Bewahren Sie Embryonen vor Licht geschützt.
<ol><li>Entfernen Sie Maleic Acid Puffer zu und ersetzen Sie mit 1,5 mL 1 X PBS. Waschen von Embryonen zweimal in 1,5 mL 1 X PBS für jede 5 min bei RT inkubieren Embryonen in 0,2 mL der Cy3 fluoreszierende Färbelösung für 60 min bei RT Hinweis: Inkubationszeit kann für unterschiedliche Sonden variieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen einmal mit 1,5 mL der folgenden Prozent MeOH mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei RT: 30 % MeOH, 50 % MeOH, 75 % MeOH und 100 % MeOH.</li>
	<li>Den Embryonen mit 1,5 mL 1 % H2O2 in MeOH für 30 min bei RT. Wash die Embryonen einmal mit 1,5 mL der folgenden MeOH Lösungen mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei RT inkubieren: 75 % MeOH, 50 % MeOH und 30 % MeOH. Waschen Sie die Embryonen zweimal für 5 min bei RT in 1,5 mL 1 X PBS. Hinweis: Embryonen können mit PBS-Puffer über Nacht bei 4 ° c gespeichert werden</li>
</ol>(6) Immunfluoreszenz
Hinweis: Bewahren Sie Embryonen vor Licht geschützt.
<ol><li>Waschen der Embryonen in 1,5 mL DdH2O 5 min bei RT. Wash die Embryonen in 1,5 mL vorgekühlt Aceton (gehalten bei-20 ° C) für 7 min bei RT den Embryonen einmal in 1,5 mL DdH2O 5 min bei RT. Wash waschen die Embryonen einmal in 1,5 1 mL X PBST mit 1 % DMSO (PBDT) für 5 min bei RT</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen in 1,5 mL PBDT + 10 % fetalen bovine Serum (FBS) auf ein Rocker für 2 h bei RT.</li>
	<li>PBDT + FBS zu entfernen und ersetzen Sie mit 1,5 mL des primären Antikörper, Anti-acetyliert Tubulin (produziert von Maus) und Anti-γ-Tubulin (produziert von Kaninchen), verdünnt 1: 400 PBDT + 1 % zusammen FBS. Die Embryonen über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Die Inkubationszeiten variieren je nach den primären Antikörper. Testen von verschiedenen Zeitintervallen möglicherweise Kennzeichnung zu optimieren.</li>
</ol>(7) sekundäre Antikörper
Hinweis: Bewahren Sie Embryonen vor Licht geschützt.
<ol><li>Um überschüssige ungebundene Antikörper aus der Embryonen zu entfernen, waschen Sie in 1,5 mL PBDT + 1 % FBS + 0,1 M NaCl für 1 min bei RT auf einer Wippe.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen 5 Mal in 1,5 mL PBDT + 1 % FBS + 0,1 M NaCl für 30 min auf einer Wippe bei RT waschen die Embryonen in 1,5 mL PBDT + 1 % FBS für 30 min bei RT auf einer Wippe.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht bei 4 ° C in 200 µL der Sekundärantikörper Alexa 488 Ziege Anti-Maus IgG und Alexa 647 Ziege Anti-Kaninchen IgG, zusammen in PBDT bei 1: 500 verdünnt.</li>
</ol>8. DAPI-Färbung
Hinweis: Bewahren Sie Embryonen vor Licht geschützt.
<ol><li>Waschen Sie die Embryonen schnell bei RT in 1,5 mL PBDT zwei Mal. Ersetzen PBDT mit 1,5 mL DAPI, 1:15000 in 1 X PBST verdünnt und inkubieren Sie 15 min bei RT auf einer Wippe.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen in 1,5 mL PDBT + 1 % FBS + 0,1 M NaCl drei Mal bei RT für 15-20 min. Embryonen in 1,5 mL PBDT bei 4 ° C bis zu montieren und Bild zu speichern.</li>
</ol>9. Montage und Imaging für Zebrafish Pronephros
<ol><li>Laien Embryo Lateral auf Objektträger in einem kleinen Volumen, ca. 10 µL, PBDT.</li>
	<li>Drücken Sie den Embryo hinter den Augen mit ein paar feine Zange auf den Kopf zu entfernen und einige der Eigelb-Ball.</li>
	<li>Verwenden Sie die feinen Pinzette sanft entfernt den restlichen Eigelb-Ball aus dem Embryo Körper kratzen. Entfernen Sie die dissoziierten Eigelb und zusätzliche Flüssigkeit aus der Folie mit einem dünnen Tuch.</li>
	<li>Tropfen Sie einen Medien die restlichen Schwanz des Embryos zu montieren und positionieren Sie, so dass das Heck seitlich angeordnet ist. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite der Rute zum Glätten der Probenmaterials, dann legen Sie in einer überdachten Folie Box.</li>
	<li>Bild Niere Zilien bei 60 X Vergrößerung auf einem confocal Mikroskop über die folgenden Kanäle: DAPI blau (laser-Set 408.0 nm), FITC in grün (laser-Set 488.0 nm), Cy3 Farbstoff-markierten in rot (laser-Satz bei 561.0 nm), und Alexa 680 in weiß (laser-Set 637.0 nm).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das oben beschriebene Protokoll ist für die Kennzeichnung MCCs in der Pronephros mit odf3b Transkripte und α-Tubulin in den 24 hpf Zebrafish Embryos optimiert. Die besten Ergebnisse zu erzielen empfiehlt es sich, frisch fest- und vorbereitete Embryonen zu verwenden. Embryonen, die wurden behoben, und gespeichert in MeOH oder Hyb + bei-20 ° C für mehr als 1 Woche können verwendet werden, aber die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten Hintergrund Färbung steigt mit der Zeit, die die Embryonen im Speicher gehalten werden.
Modifikationen und Problembehandlung für diese Technik sind notwendig, um diese Methode für andere Suiten des bestimmten Markierungen, z. B. andere antisense Riboprobes und andere Antikörper anpassen. Viele Methoden zur Anpassung der Parameter der Schritte im Prozess der ganze Berg in Situ Hybridisierung wurden bisher dokumentiert von unserer Fraktion und anderen31,34,36,38, 39. Ebenso jedes Protein Antikörper erfordert einige Fehlersuche in Bezug auf die Färbung Zeiten und ungefähre Reichweiten von Verdünnungen und Inkubationszeiten für jedes Primärantikörper dürften am besten durch Auswertung der dokumentierten Ergebnissen28, 35. für Embryonen jünger als 24 hpf, pK-Behandlung sollte kürzer sein als 2 min, wo Embryonen, die älter als 24 hpf mit pK für länger als 2 min behandelt werden sollte. Auch Embryonen älter als 24 hpf Pigment vor der pK-Behandlung gebleicht werden sollten.
Nach der Färbung mit fluoreszierenden Färbelösung, ist es wichtig, alle verbleibenden Fleck, Antikörper und Peroxidasen zu entfernen, indem die Reihe von Methanol und Wasserstoff-Peroxid wäscht. Die PBS-Wäschen unmittelbar nach sind entscheidend für überschüssige Methanol aus den Embryonen zu entfernen. Wichtig ist, bevor Sie mit der IF-Antikörper, haben wir festgestellt, dass das Aceton und deionisiertes Wasser wäscht die Embryonen seltener an einander und/oder die Zentrifuge Rohre halten machen. In unserer Erfahrung, Antikörper gegen bestimmte Transkriptionsfaktoren und andere Gene obwohl sie effizient arbeiten können, Western blots, funktionieren nicht gut denn wenn in der Zebrabärbling. Hoch konservierte und reichlich Proteine wie α-Tubulin und β-Catenin, funktionieren jedoch auch in der Zebrabärbling für IF16,37.
Mit Fisch ist es möglich, RNA-Transkripte von Genen zu visualisieren, die noch keine spezifische Antikörper in der Zebrabärbling haben. Durch die Kombination von Fisch mit IF, kann dieses Protokoll beweist Co Lokalisierung von RNA-Transkripte und Protein gesehen in Vivo (Abbildung 2). Die flexible Art des Protokolls ermöglicht schnelle Fehlersuche für die Visualisierung der verschiedenen RNA-Transkripte und Proteine in zahlreichen Geweben und Zeitpunkten. In Kombination mit den bereits angesehenen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryonen, bietet dieses Protokoll von Fisch + wenn ein weiteres Tool um die Expression von Genen und Proteinen wichtige entwicklungspolitische Weg Verordnung zu erkunden.

In den letzten Jahrzehnten entstanden der Zebrabärbling (Danio Rerio) als bester Modellorganismus Entwicklungsbiologie zu studieren. Die Embryonen entwickeln außerhalb der Mutter und sind optisch transparent. Außerdem tritt die Bildung der lebenswichtigen Organe wie Auge, Niere und Vorderhirn schnell, mit Strukturen von nur 24 h Post Düngung (hpf) gebildet. Wichtig ist, ist das Zebrafish Genom mit Säugetiere1,2,3hoch konserviert. Darüber hinaus haben Zebrafisch und Säugetieren Organe ähnliche Anatomie und Physiologie. Die Zebrafish embryonale Nieren- oder Pronephros, zeigt den Wert des Modellsystems zur Prüfung Genfunktion während der frühen Nephrogenesis und Schicksal Bestimmung der konservierten epithelialen Zell-Populationen von Wirbeltieren Nephron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ebenso Zebrafish Embryos wird immer wichtiger bei der Prüfung der Ontogenese MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Wie der Name schon sagt, sind MCCs Epithelzellen zeichnet sich durch ein Bündel von bewegliche Cilien befindet sich auf der apikalen Oberfläche17. In der Zebrabärbling MCCs in Flüssigkeitsströmung funktionieren und sind in ein "Pfeffer" wie Mode in der Mitte jedes Nephron der Pronephros zerstreut durch 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. obwohl sie nur in einer Handvoll aufgefallen der menschlichen Niere Krankheit Fällen18,19,20,21, MCCs sind weit verbreitet in anderen Säugetieren Geweben wie dem Gehirn und Luftröhre22,23,24, die eine Vielzahl von Herausforderungen für experimentelles Design darstellt. Elegante Studien verschiedene vertebrate Modelle einschließlich Zebrafisch haben einen erhaltenen Weg von MCC Schicksal, mit der Notch-Signalweg als Inhibitor der MCC Entwicklung12,17,25 gezeigt. ,26,27. Daher stellt der Zebrafisch Pronephros eine leicht zugängliche Modell zur Untersuchung der genetischen Mechanismen der MCC Entwicklung in Vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparenz und einfache genetische Manipulation von Zebrafisch-Embryonen erwiesen sich als unschätzbare Eigenschaften sein, wenn die genetischen und molekularen Wege zu studieren, die Schicksal der Zelle, Gewebewachstum und Entwicklung des frühen Embryos1,2 regulieren ,3. Als solcher, traditionelle Techniken, um Protein und gen Transkripte, z. B. in Situ Hybridisierung und ganze Berg wenn zu visualisieren, angewendet und optimiert wurden der Zebrafisch16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Durch die Kombination von beliebten Protokolle für Fisch und wenn, ist es möglich, beschriften und MCCs in Vivo16,28,37,38zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>unspezifische Protease-Mischungslösung</td><td>Roche</td><td>11459643001, Pronase aus Streptomyces griseus</td><td>In E3 verdünnen <stark>ohne</stark> Methylenblau zu 50mg/ml Stammlösung; lagern bei -20°; C</td></tr><tr><td>E3-Lösung</td><td></td><td></td><td>50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4) in destilliertem Wasser verdünnen; 1 x 10-5 M Methylenblau (Sigma M9140) zugeben, um die Kontamination zu hemmen</td></tr><tr><td>Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>Zur Herstellung einer 0,2%igen Stammlösung 1 g Tricainpulver in 10 ml Tris auflösen, pH 9,5 und destilliertes Wasser bis zu 500 mL</td></tr><tr><td>Embryoschalen</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Glasfläschchen</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>Einwegkunststoff Pasteur-Pippetten</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>19210</td><td>4% PFA in 1X PBS auflösen und unter einem Abzug zum Kochen bringen. Abkühlen lassen und aliquotieren, dann bei -20°C lagern. Nach dem Auftauen für den Gebrauch nicht wieder einfrieren.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td> In <td>destilliertem Wasser verdünnen, um eine 1X</td></tr><tr><td>Tween-20-Aktie</td><td>herzustellen American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Durch Verdünnung in destilliertem Wasser eine 0,1%ige Tween-20-Aktie herstellen.</td></tr><tr><td>1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0,1 % Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>Methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>In destilliertem Wasser auflösen, um eine 10 mg/ml-Brühe herzustellen; aliquotieren und bei -20/deg lagern; C</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit flachem Boden</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>lagern bei -20°; </td></tr><tr><td>C-Hybridisierungslösung (HYB+)50</td><td></td><td></td> <td>% Formamid, 5X SSC, 0,1 % Tween-20, 5 mg/ml Hefe-Torula-RNA, 50 &mu; g/&mu; L Heparin; lagern bei -20°; </td></tr><tr><td>C-Hybridisierungsofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X Kochsalz-Natriumcitrat (SSC) Pufferlösung</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>in destilliertem Wasser verdünnen, um 2X und 0,2X Stamme</td></tr><tr><td>herzustellen blockierende Reagenzlösung</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>in Maleinsäurepuffer verdünnen, um eine 10%ige Stammlösung herzustellen; lagern bei 4°; C</td></tr><tr><td>Maleinsäure-Pufferlösung</td><td>Sigma</td><td>M0375 und S7653</td><td>150 mM Maleinsäure, 100 mM NaCl (pH 7,5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenin-POD, Fab-Fragmente</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>bei 4° lagern; C</td></tr><tr><td>Cy3 Fluoreszenz-Färbelösung</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 Systemlager</td><td>bei 4&Grad; C; Bereiten Sie die Färbelösung frisch vor, indem Sie das TSA-Reagenz (gelöst in 60 μl DMSO) im Kit-Puffer 1:50 verdünnen.</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500 ml</td><td>bei 4 μg lagern; C</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser in molekularer Qualität (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>lagern ein Aliquot bei -20 Grad; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquot und bei -20° C lagern; C</td></tr><tr><td>monoklonales anti-acetyliertes Tubulin klont 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquot und lagert bei -20°; C</td></tr><tr><td>anti-&gamma;-Tubulin-Anitkörper, hergestellt in Kaninchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>aliquot und gelagert bei -20°; C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA-Klon MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>Lagerung des bakteriellen Glycerinbestands bei -80°; C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Mehl 647 Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>bei 4&deg; C; vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>bei 4&deg lagern; C; vor Licht schützen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquot und lagern bei -20°; C</td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>feine Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzette Muster #55</td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly/Mount</td><td>Lager bei 4°; </td></tr><tr><td>C Konfokalmikroskop und zugehörige Software</td><td></td><td></td><td>Wir verwenden ein Nikon C2plus Konfokalmikroskop mit NIS-Elements AR</td></tr><tr><td>Software Rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von multiciliated zellen in der zebrabärbling durch ein kombiniertes protokoll der ganze berg leuchtstofflampen in situ hybridisierung und immunfluoreszenz

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In den letzten Jahren entstanden die Zebrafish Embryos als ein beliebtes Modell, Entwicklungsbiologie durch Merkmale wie ex Utero Embryonalentwicklung und optische Transparenz zu studieren. Insbesondere geworden Zebrafish Embryos Organismus wichtiger vertebrate Niere Organogenese sowie multiciliated Zellentwicklung (MCC) zu studieren. Um MCCs in der embryonalen Zebrafisch-Niere zu visualisieren, haben wir entwickelt ein kombiniertes Protokoll der gesamten-Mount Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) und ganze montieren Immunfluoreszenz (IF), die hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Dieses Manuskript beschreibt unsere Technik zur Lokalisierung Co RNA-Transkripte und Protein als Instrument zur Regulierung der Entwicklungsprogramme durch die Expression verschiedener Abstammung Faktoren besser zu verstehen.

Wildtyp Zebrafisch-Embryonen wurden behoben, um 24 Uhr hpf und sofort zubereitet wie oben beschrieben. Abbildung 1 zeigt einen experimentelle Workflow zusammen mit ausgewählten dargestellten Phasen. Der Workflow in Schritte 1 bis 8 beschriebenen umfasst die Prozesse der Probe Beschaffung, Fixierung und Manipulation des festen Gewebes, endogene Transkripte mit antisense Riboprobes gefolgt von Immunfluoreszenz zum Label benutzt von Interesse zu kennzeichnen. Schritt 9 im Workflow bezieht sich auf die Montage und bildgebende Verfahren, die speziell für die Visualisierung der Zebrafisch embryonalen Stamm zu optimieren. In den Zeichnungen, die Schritt 9 begleiten, zeigen wir die Methode der Manipulation zur Positionierung des Gewebes auf einen Objektträger. In diesem Schritt werden die Embryos Kopf und Eigelb Kugel entfernt, verlassen die Rute zwischen Objektträger und Deckglas seitlich positioniert werden. Entfernung der Eigelb-Ball und Kopf wird für die beste Darstellung der MCC Wohnbevölkerung in der Pronephros vorgeschlagen, wie der Dotter Ball Auto fluoresziert und den Montageprozess behindert.
In Abbildung 2, die den gleichen Wildtyp Embryo bei 60 X Vergrößerung und einen digitalen Zoom mit der gleichen Vergrößerung zeigt repräsentative Bilder erhalten, mit einem konfokalen Mikroskop angeboten. Die oberen Platten liefern Bilder jedes einzelnen Kanals, während die unteren beiden Platten die zusammengesetzten Überlagerung der diese Bilddaten sind. Das weiße Feld (in der linken Spalte Bild) beschreibt den Bereich, der im Mittelpunkt des digitalen Zooms (Bild rechts) ist. Markiert im abschließenden Panel des digitalen Zooms, wurden Kerne in DAPI, und MCCs wurden erkannt, basierend auf einem antisense Riboprobe entworfen, odf3b, zu erkennen, wo Antikörper an γ-Tubulin bezeichnen die basalen Körper und α-Tubulin bezeichnet die Zilien. In den digitalen Zoom der zusammengesetzten Überlagerung zeigt der gelbe gestrichelte Kreis den Umfang von einem MCC, die durch den Besitz von Zilien odf3b Protokolle und mehrere basale Körper identifiziert wurde. Die angrenzende Mono-ciliated Zelle, gekennzeichnet mit einem gelben gepunkteten Kreis wurde anhand der Phänotyp besitzen einen einzigen Basaltemperatur und einem einzigen Zilie identifiziert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische der experimentellen Flussdiagramm. Das Flussdiagramm zeigt einen experimentelle Workflow begleitet von Abbildungen der kritischen Phasen, in denen die Schneeflocke kalt Inkubation zeigt, drei gebogene Linien stehen für Wärme und die Uhr stellt langen Inkubationszeiten. Der Workflow kann durchgeführt werden, bei einem Mindestaufenthalt von 6 Tagen (siehe Tag-Nummer in der rechten oberen Ecke jeder Stufe im Prozess), obwohl einige Schritte über längere Zeiträume durchgeführt werden können, wie im Protokoll erwähnt. Eine detaillierte Darstellung der Montage zieht es heraus, zeigt die endgültige montierten Embryo Rute zwischen Objektträger und Deckglas. Ein schwarzer gestrichelter beschreibt den Bereich, der bei 60 X Vergrößerung abgebildet wird. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter führt zur Visualisierung von MCCs Zebrafisch Pronephros. Maximale Bildprojektionen eines 24 hpf Wildtyp Zebrafish Embryos bei 60 X Vergrößerung sowie einen digitalen Zoom auf die konfokale bei 60 X Vergrößerung des gleichen Embryos. Die weißen Felder zeigen das Gebiet für den Zoom im Mittelpunkt. Einzelne Flecken DAPI (Kerne), odf3b (MCCs), γ-Tubulin (basale stellen) und α-Tubulin (Zilien) sind beschriftet und dann in den beiden unteren Feldern zusammengeführt. In den digitalen Zoom bieten wir Annäherungen der Zelle Standorte wie folgt: ein MCC wird durch den gestrichelten gelben Kreis skizziert und die gestrichelte gelben Kreis beschreibt eine Mono-ciliated Zelle. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, multiziliäre Zellen des Zebrabärblings in situ zu markieren und sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren die multiziliären Zellen in der embryonalen Zebrabärblingniese regulieren. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sowohl Proteine als auch RNA-Transkripte gleichzeitig markiert werden können, was besonders nützlich ist, wenn spezifische Antikörper für den Zebrabärbling nicht verfügbar sind.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir mehrzilige Zellen im Pronephros markieren wollten, um die Anwesenheit von Zilien nach Veränderungen am Embryo zu analysieren. Fixieren Sie zunächst die Zebrafischembryonen 24 Stunden nach der Befruchtung in fünf Milliliter 4 % Paraformaldehyd zwei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Waschen Sie danach die Embryonen zwei Mal in PBS mit 0,1 % Tween 20 oder PBST und anschließend einmal mit fünf Milliliter 100 % Methanol.Anschießend inkubieren Sie die Embryonen in fünf Milliliter frischem 100 % Ethanol mindestens 20 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Um die Embryonen für die Hybridisierung vorzubereiten, rehydrieren Sie die Neugeborenen in fünf Milliliter 50 % Methanol und PBST für fünf Minuten, gefolgt von fünf Minuten in fünf Milliliter 30 % Methanol und PBST. Waschen Sie die Embryonen zweimal je fünf Minuten in fünf Milliliter PBST und inkubieren Sie die Embryonen in fünf Milliliter einer 1:1.000-Proteinase-K-Lösung in PBST für zwei Minuten, unmittelbar gefolgt von zwei weiteren Waschschritten in jeweils fünf Milliliter PBST.Fixieren Sie die Embryonen in fünf Millilitern 4 % Paraformaldehyd für mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Waschungen in jeweils fünf Millilitern PBST 20. Um die Wechselwirkungen zwischen den Embryonen und der Hybridisierungslösung zu erleichtern, überführen Sie die Embryonen in fünf Milliliter PBST in aufrechte, flachbodige Mikrozentrifugenröhrchen in einem Mikrozentrifugenständer und waschen Sie die Embryonen zweimal je fünf Minuten in 1,5 Millilitern Hybridisierungslösung. Nach der zweiten Waschung inkubieren Sie die Embryonen in 1,5 Millilitern frischer Hybridisierungslösung bei 70 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen für vier bis sechs Stunden.Danach ersetzen Sie die Hybridisierungslösung durch 10&nbsp;Mikroliter der gewünschten RNA-Sonde und 500&nbsp;Mikroliter Hybridisierungslösung für eine Übernachthybridisierung bei 70&nbsp;Grad Celsius. Am nächsten Morgen waschen Sie die Embryonen zweimal in jeweils 1,5&nbsp;Milliliter 50&nbsp;% Formamid und 2X Salinen-Natrium-Citrat-Puffer oder SSC bei 70&nbsp;Grad Celsius, wobei jede Waschung 20 bis 30&nbsp;Minuten dauert. Anschließend waschen Sie die Embryonen einmal in 1,5&nbsp;Milliliter 2X SSC allein bei 70&nbsp;Grad Celsius für 15&nbsp;Minuten, gefolgt von zwei Waschungen in jeweils 1,5&nbsp;Milliliter 0,2X SSC bei 70&nbsp;Grad Celsius, wobei jede Waschung 20 bis 30&nbsp;Minuten dauert.Nach der zweiten Wäsche das 0,2× SSC durch 1,5 Milliliter Blockier-Reagenz ersetzen und eine Übernacht-Inkubation bei vier Grad Celsius durchführen. Am nächsten Morgen das Blockier-Reagenz durch 0,2 Milliliter Anti-Digoxigenin-Antikörper in Rettichperoxidase und Blockier-Reagenz im Verdünnungsverhältnis 1:1.000 ersetzen und drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Anschließend die Embryonen zwei bis viermal mit jeweils 1,5 Milliliter Malpufferpuffer waschen, wobei jede Wäsche 10 bis 15 Minuten dauert, gefolgt von einer Übernacht-Inkubation bei vier Grad Celsius in 1,5 Milliliter frischem Malpufferpuffer.Am nächsten Morgen ersetzen Sie den Apfelsäure-Puffer durch 1,5 Milliliter PBS und waschen Sie die Embryonen zwei Mal mit jeweils 1,5 Milliliter PBS, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Inkubieren Sie die Embryonen für 60 Minuten in 0,2 Milliliter Si3-Fluoreszenz-Stillstehlösung, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden 10-minütigen Wäschen in 1,5 Milliliter Methanol mit ansteigender Konzentration. Nach der letzten Inkubation inkubieren Sie die Embryonen bei Raumtemperatur für 30 Minuten in 1,5 Milliliter 1 % Wasserstoffperoxid in Methanol.Waschen Sie die Embryonen anschließend jeweils 10 Minuten lang in 1,5 Milliliter absteigenden Methanollösungen, gefolgt von zwei Waschungen mit jeweils fünfminütiger Dauer in 1,5 Milliliter PBS. Danach waschen Sie die Embryonen 5 Minuten lang in 1,5 Milliliter zweifach destilliertem Wasser, gefolgt von einer siebenminütigen Waschung in 1,5 Milliliter Aceton bei minus 20 Grad Celsius. Anschließend waschen Sie die Embryonen erneut 5 Minuten lang in 1,5 Milliliter zweifach destilliertem Wasser, gefolgt von einer fünfminütigen Waschung in 1,5 Milliliter PBST mit 1 % DMSO oder PBDT.Die Embryonen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 1,5 Milliliter PBDT mit 10 % FBS auf einem Rüttler inkubieren. Danach das PBDT und FBS durch 1,5 Milliliter der primären Antikörper ersetzen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Morgen die Embryonen einmal eine Minute lang mit Rütteln in 1,5 Milliliter PBDT, FBS und 0,1 molarem Natriumchlorid waschen, gefolgt von fünfmal 30-minütigen Waschgängen mit Rütteln in jeweils 1,5 Milliliter PBDT, FBS und Natriumchlorid.Nach der letzten Waschung die Embryonen ein Mal 30 Minuten lang mit Schütteln in 1,5 Milliliter PBDT und FBS waschen, gefolgt von einer Übernachtsinkubation in 200 Mikroliter der geeigneten sekundären Antikörper bei vier Grad Celsius, lichtgeschützt. Am nächsten Morgen die Embryonen kurz zwei Mal in 1,5 Milliliter PBDT waschen, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in 1,5 Milliliter DAPI auf einem Schüttler. Anschließend die Embryonen dreimal in 1,5 Milliliter PBDT mit FBS und Natriumchlorid waschen, jeweils 15 bis 20 Minuten pro Waschung, und die Embryonen in 1,5 Milliliter PBDT bei vier Grad Celsius, vor Umgebungslicht geschützt, lagern.Um die Nieren von Zebrafischen abzubilden, legen Sie die Embryonen seitlich auf Objektträger in etwa 10 Mikrolitern PBDT. Drücken Sie mit einer feinen Pinzette und unter Verwendung eines Stereomikroskops den ersten Embryo hinter den Augen zusammen, um den Kopf und einen Teil des Dottersacks zu entfernen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den verbleibenden Dottersack vom Embryokörper.Während des Entfernens des Eigelbkügelchens darauf achten, den Dottersackfortsatz nicht zu berühren, da das Gewebe von Interesse leicht einreißt und sich direkt oberhalb des Fortsatzes befindet. Mit einem dünnen Tuch das dissoziierte Eigelb und überschüssige Flüssigkeit vom Objektträger entfernen. Anschließend einen Tropfen Eindeckmedium auf den verbleibenden Schwanz geben und den Schwanz seitlich positionieren.Flachen Sie den Schwanz mit einem Deckglas ab und legen Sie die Probe in eine geschlossene Objektträgerbox. Verwenden Sie dann das 60X-Objektiv eines konfokalen Mikroskops, um die Zilien der Niere auf den geeigneten fluoreszierenden Kanälen abzubilden. In den folgenden repräsentativen Bildern eines Zebrafischembryos, der wie gerade gezeigt gefärbt wurde, können multiziliäre Zellen anhand der Sichtbarmachung des Antisense-Riboprobes identifiziert werden, das zur Erkennung der ODF3B-Transkriptexpression verwendet wurde, sowie der mit Gametentubulin markierten Basalkörper und der mit acetyliertem alpha-Tubulin markierten Zilien.Tatsächlich ist bei dieser Vergrößerung des embryonalen Pronephros eine mehrgegeißelte Zelle mit ODF3B-Transkripten, mehreren Basalkörpern und Geißeln zu erkennen. Die benachbarte eingegeißelte Zelle lässt sich anhand ihres einzelnen Basalkörpers und des eingeißeligen Phänotyps unterscheiden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, frisch fixierte Embryonen zu verwenden und die Proben ab dem Zeitpunkt des ersten Antikörpers vor Umgebungslicht zu schützen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Es sind Techniken beschrieben Phospho-Epitope in ganz Zebrafischembryonen zu Immunfärbung und dann leiten zweifarbige Leuchtstoff konfokalen Lokalisierung in zellularen Strukturen so klein wie primäre Zilien. Die Techniken zur Fixierung und Bildgebung können die Position und die Kinetik des Erscheinens oder Aktivierung spezifischer Proteine ​​definieren.

Immunfärbung Phospho-Epitope in Ciliated Organe Ganze Berge Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Visualisierung von multiciliären Zellen in Danio rerio durch kombinierte In-Situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Diese Methode ermöglicht die simultane Markierung von Proteinen und RNA-Transkripten in der Embryonalniere.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

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