In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, pathologische Veränderungen der experimentellen zerebralen Malaria in vivo zu überwachen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Pathogenese der experimentellen zerebralen Malaria zu beantworten, da sie es uns ermöglicht, in vivo zu visualisieren, wie sich die Pathologie des gesamten Gehirns im Raum und im Laufe der Zeit entwickelt. Die Technik ermöglicht somit eine detaillierte Beurteilung der Hirnpathologie und kann zur Beurteilung der Wirksamkeit neuartiger Behandlungsstrategien bei zerebraler Malaria verwendet werden.

Die Durchführung des MRT-Setups wird von Manuel Fischer, unserem Laborleiter, durchgeführt. Beginnen Sie damit, weibliche Mücken 17 bis 22 Tage nach der Blutmahlzeit aus ihrem Käfig zu sammeln. Platzieren Sie mit einer Pinzette drei bis vier Mücken auf einem Objektträger, kombiniert mit einem Tropfen kaltem RPMI-Medium.

Legen Sie dann den Objektträger unter ein Mikroskop. Dehnen Sie die Mücke vorsichtig mit einer Pinzette zwischen Kopf und Körper und isolieren Sie die Speicheldrüse mit einer Spritze und einer Nadel. Sammeln Sie als Nächstes die Speicheldrüsen aus dem Objektträger, indem Sie sie mit einer Glaspipette aufsaugen und in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben.

Verwenden Sie dann ein kleines Plastikstäbchen, um die isolierten Speicheldrüsen im Zentrifugenröhrchen drei Minuten lang zu zerschlagen, um die Sporozoiten aus dem Speicheldrüsengewebe zu isolieren. Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 1.000 g und vier Grad Celsius, um die Sporozoiten aus dem restlichen Gewebe zu reinigen. Pipettieren Sie den Überstand, der die Sporozoiten enthält, in ein neues Zentrifugenröhrchen und zählen Sie die gereinigten Sporozoiten in einem Neubauer-Hämozytometer.

Sporozoiten zeigen eine typische Bewegung gegen den Uhrzeigersinn. Als nächstes wird die Konzentration der gereinigten Sporozoiten durch Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 10.000 pro Milliliter eingestellt. Setzen Sie zum Schluss eine C57BL/6-Maus in einen Rückhalteapparat und legen Sie ihren Schwanz in warmes Wasser, um die Schwanzvene besser sichtbar zu machen.

Injizieren Sie dann insgesamt 1.000 Sporozoiten oder 0,1 Milliliter in die Schwanzvene, um die Infektion auszulösen. Beginnen Sie damit, die Maus an einen 9,4-Tonnen-Magnetresonanztomographen (MRT) für Kleintiere zu bringen, der einen Volumenresonator für die Hochfrequenzübertragung verwendet. Tragen Sie dann Dexpanthenol-Augensalbe auf beide Augen auf.

Schalten Sie das temperaturgesteuerte Wasserbad auf 42 Grad Celsius ein, um die Körpertemperatur der Maus zu halten. Legen Sie dann einen Schwanzvenenkatheter in die Schwanzvene der Maus. Positionieren Sie als Nächstes die Maus für das MRT, indem Sie sie in Bauchlage und mit zusammengeknirschtem Rücken auf ein Tierbett legen, das mit einem Headlock und einer Zahnstange ausgestattet ist, um Kopfbewegungen zu minimieren.

Achten Sie darauf, die Halswirbelsäule der Maus nicht zu begradigen. Schließen Sie ein Kontrastmittel-Injektionssystem, das mit 0,3 Millimol pro Kilogramm Gd-DTPA gefüllt ist, an den Schwanzvenenkatheter an. Platzieren Sie als Nächstes die Kopfspule des 4-Kanal-Phased-Array-Oberflächenempfängers auf dem Kopf der Maus.

Legen Sie abschließend ein Atempad auf die Rückseite der Maus und überprüfen Sie die Atmung auf dem Überwachungsgerät. Schalten Sie den Positionslaser ein, indem Sie F2 auf dem Bedienfeld drücken, und bewegen Sie die Maus, bis sich das horizontale Positionslicht in der Mitte des kleineren Teils der Spule befindet, der den Kopf der Maus abdeckt. Schalten Sie den Positionslaser aus, indem Sie erneut F2 drücken, und bewegen Sie die Maus dann in die endgültige Position, indem Sie F3 auf dem Bedienfeld drücken.

Beginnen Sie mit einem Lokalisierungsscan, um sicherzustellen, dass sich das Gehirn der Maus im Isozentrum des Magneten befindet. Qualitative Beurteilung von vasogenen Ödemen mit Hilfe von 3D-T2-gewichteter Bildgebung. Wählen Sie eine RAR-Sequenz mit mehreren Schichten aus und passen Sie die Position der Scheibe an, wobei Sie sicherstellen, dass das gesamte Gehirn von der Nase bis zum Kleinhirn bedeckt ist.

Nachdem Sie die Sättigungsschnitte angepasst haben, starten Sie die Sequenz und warten Sie 10 Minuten und 48 Sekunden, um die Bilder aufzunehmen. Führen Sie als Nächstes eine T2-Relaxometrie durch, um das vasogene Ödem quantitativ zu beurteilen, indem Sie eine Echosequenz mit mehreren Schichten und mehreren Spins auswählen. Passen Sie die Slice-Position an und starten Sie die Erfassung der Sequenz, die acht Minuten und 53 Sekunden dauert.

Um sowohl das vasogene Ödem als auch das zytotoxische Ödem quantitativ zu beurteilen, führen Sie eine diffusionsgewichtete Bildgebung durch, indem Sie eine Spin-Echo-EPI-Diffusionssequenz auswählen. Passen Sie die Slice-Position und das Sättigungs-Slice an. Starten Sie dann die Sequenz und warten Sie sieben Minuten und 56 Sekunden, bis die Rohbilder aufgenommen wurden.

Beurteilen Sie anschließend Mikroblutungen mit Hilfe der sterngewichteten 3D-T2-Bildgebung. Wählen Sie eine durchflusskompensierte FLASH-Sequenz aus, passen Sie die Slice-Position an und starten Sie die Sequenz, die 15 Minuten und 40 Sekunden lang läuft. Beurteilen Sie anschließend die arterielle Durchgängigkeit mithilfe der Flugzeitangiographie, indem Sie eine 3D-FLASH-Sequenz auswählen.

Passen Sie die Slice-Position an, starten Sie die Sequenz und warten Sie dann sieben Minuten und 16 Sekunden, bis die Bilder aufgenommen wurden. Beurteilen Sie schließlich die Störung der Blut-Hirn-Schranke. Wählen Sie eine 3D-T1-gewichtete Bildgebung mit einer FLASH-Sequenz aus, passen Sie die Schichtposition an und starten Sie die Sequenz.

Warten Sie eine Minute und 14 Sekunden, bis Bilder ohne Kontrast aufgenommen wurden. Injizieren Sie dann einen Kontrast von 0,3 Millimol pro Kilogramm und wiederholen Sie die Messung. Eine Zunahme der Störung der Blut-Hirn-Schranke und eine Zunahme der Flüssigkeit deuten auf ein frühes vasogenes Ödem im Riechkolben hin, das bereits bei einer leichten Erkrankung vorhanden ist und sich mit zunehmender Schwere der Erkrankung in Richtung Hirnstamm auszubreiten beginnt.

Auf T2-Karten kann der Schweregrad des vasogenen Ödems quantifiziert werden, indem die interessierenden Regionen in bestimmte anatomische Regionen gezeichnet werden. Für jede Region kann eine T2-Relaxationszeit erreicht werden, die mit zunehmendem Ödem zunimmt. Darüber hinaus nimmt das Hirnvolumen, das auf Ödeme hinweist, bei mittelschwer kranken Mäusen im Vergleich zum Ausgangswert signifikant zu und bei schwer erkrankten Mäusen weiter zu.

Schließlich tritt die mikrovaskuläre Pathologie, die durch Mikroblutungen und eine Zunahme des Gefäßanfälligkeitskontrasts belegt wird, nach den ersten Anzeichen einer Störung der Blut-Hirn-Schranke bei vasogenen Ödemen auf. Diese Mikrohemmorhationen treten überwiegend im Riechkolben auf. Wenn das gesamte MRT-Protokoll erstellt wird, können alle Bilder einschließlich der Positionierung innerhalb einer Stunde erhalten werden, wenn es korrekt durchgeführt wird.

Das Minimalprotokoll sollte eine T2-gewichtete Sequenz oder T2-Relaxometrie und eine T2-sterngewichtete Sequenz umfassen, um das Vorhandensein eines vasogenen Ödems, einer Mikrohämorhagebelastung und einer mikrovaskulären Beeinträchtigung zu beurteilen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Ganzhirn-MRT pathologische Veränderungen bei experimenteller zerebraler Malaria visualisiert, einschließlich solcher Veränderungen wie Hirnschwellungen, die ex vivo schwer zu erkennen sind.