Name: Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Erfahren Sie quantitative Intravitalmikroskopie der Milz zur Analyse von Malariaparasiten-Mobilität und Blutfluss. Diese Methode nutzt GFP-transgene Parasiten in Mäusen für Echtzeit-Imaging.

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Wir sind besonders dankbar, S. Graewe und V. Heussler für die Erstausbildung und kontinuierliche Eingang in Intravitalmikroskopie der Malaria-Parasiten, die J. Burns für die Spende von GFP transgenen Parasiten, A. Bosch (Konfokale Unit, CCIT-UB, IDIBAPS) Unterstützung bei der Bildanalyse und Quantifizierung und P. Astola für die technische Unterstützung. Wir danken R. Tous und I. Caralt für die Videoproduktion. MF ist ein Empfänger ein Promotionsstipendium von der Allgemeinheit von Katalonien. HAP ist ein ICREA Forschungs-Professor. Die Arbeit im Labor von HAP wird von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 242095, von der Privatstiftung CELLEX (Katalonien, Spanien), und durch das spanische Ministerium für Wissenschaft und Innovation (gefördert SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
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<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Umsetzung der Intravitalmikroskopie der Milz in diesem Nagetier Malaria-Modell eröffnet die Möglichkeit zur Untersuchung der dynamischen Passage der Parasiten durch dieses Organ, das bisher als eine &quot;black-box&quot; aufgrund technischer Überlegungen. In hier, war eine große Mühe geben, um eine quantitative Methode, die vergleichende Analyse der verschiedenen Parasiten Linien an den Einzel-und Bevölkerungszahlen ermöglicht anzupassen. Im Gegensatz zu anderen Geweben und Zellen, die zuvor in Malaria 3,5</sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Leica TCS SP5-konfokalen Mikroskop </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Deutschland </td><td> TCS SP5-Serien-Nr. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 mg / 3 ml </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW Dextran, konjugiert mit Texas Red </td><td> Molecular Probes </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceinisothiocyanat, Isomer I (FITC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa-Färbung </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Working-Lösung wird auf 10% in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

intravitalmikroskopie der milz: quantitative analyse von parasite mobility und die durchblutung

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Das Aufkommen der Intravitalmikroskopie in experimentellen Nagetier Malaria-Modellen hat große Fortschritte zur Kenntnis Parasit-Wirt-Interaktionen 1,2 zulässig. So haben in-vivo-Bildgebung des Malaria-Parasiten während der Pre-erythrozytären Stadien der aktiven Eingang des Parasiten in die Haut Lymphknoten 3, die komplette Entwicklung des Parasiten in der Haut 4 und die Bildung einer Hepatozyten-derived merosome die Migration gewährleisten aufgedeckt und Freisetzung von Merozoiten in den Blutstrom 5. Darüber hinaus hat die Entwicklung der einzelnen Parasiten in Erythrozyten vor kurzem dokumentiert mit 4D-Bildgebung und forderten unsere aktuelle Sicht auf den Protein-Export in Malaria-6. So hat intravitales Imaging radikal unsere Sicht auf wichtige Ereignisse in Plasmodium Entwicklung verändert. Leider Studien der dynamischen Lauf der Malaria-Parasiten durch die Milz, eine große Lymphorgane exquisit abgestimmt, um infizierte rote b klarelood Zellen fehlen aufgrund technischer Einschränkungen. Mit dem Mausmodell der Malaria Plasmodium yoelii in Balb / c Mäusen, haben wir intravital Bildgebung der Milz durchgeführt und berichtet ein Differential Umbau von IT und die Einhaltung der von Parasiten befallenen roten Blutkörperchen (pRBCs) zur Barriere Zellen Fibroblasten Ursprung in der roten Pulpa während der Infektion mit dem nicht-tödlichen Parasiten line P.yoelii 17X zu Infektionen mit dem P.yoelii 17XL tödlichen Parasiten Linie 7 entgegen. Zur Erreichung dieser Schlussfolgerungen wurde eine spezielle Methodik mit ImageJ freie Software entwickelt, um die Charakterisierung der schnellen dreidimensionalen Bewegung der Single-pRBCs ermöglichen. Ergebnisse mit diesem Protokoll erhalten erlauben die Bestimmung Geschwindigkeit, Richtung und Verweildauer des Parasiten in der Milz, bei der alle Parameter die Einhaltung in vivo. Darüber hinaus berichten wir über die Methodik zur Quantifizierung des Blutflusses mittels Intravitalmikroskopie und die Verwendung von verschiedenen Farbstoffe, um einen Einblick in die komplexe Struktur der Mikrozirkulation der Milz zu gewinnen. Ethik und Verlustrechnung Alle Tierversuche wurden an die Tierhaltung der Universität von Barcelona in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokolle von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Barcelona CEEA-UB (: 5429 Protokoll Nr. DMAH) genehmigt durchgeführt. Weibliche Balb / c-Mäuse von 6-8 Wochen alt wurden von Charles River Laboratories erhalten.

Wir zeigen das Verfahren für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Milz mit GFP transgenen Malaria-Parasiten und die Quantifizierung der Parasiten Mobilität und die Durchblutung in diesem Organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

Die Einführung der Intravitalmikroskopie in experimentellen Nagermodellen für Malaria hat bedeutende Fortschritte im Verständnis der Parasit-Wirt-Interaktionen ermöglicht 1,2. ...

In diesem Verfahren zeigen wir einen quantitativen Ansatz der intravitalen Mikroskopie, um die Dynamik des Parasitentransits durch die Milz zu untersuchen. In einem Nagetier-Malaria-Modell werden mit GFP-transgenen Parasiten infizierte Mäuse für die intravitale Mikroskopie der Milz vorbereitet; die Kanülierung einer Milzvene ermöglicht die Injektion von intravitalen Farbstoffen. Während des Experiments werden fluoreszierende Zellen bei ihrer Bewegung in verschiedenen Bereichen der Milz abgebildet.Wir liefern die Mythologie, um die Parasitenmobilität im dreidimensionalen langsamen Kompartiment des roten Pulps zu beschreiben, und berechnen den Blutfluss in den Gefäßen. Diese Parameter wurden verwendet, um die Milzdynamik zweier PULE-Stämme zu vergleichen. Hallo zusammen.Mein Name ist Nando El Portillo und eine der zentralen Forschungsfragen in meinem Labor besteht darin, die Rolle der Milz bei Malaria zu verstehen. Die Splenomegalie ist eines der charakteristischen Merkmale dieser Krankheit, doch aufgrund technischer und ethischer Probleme ist es sehr schwierig, Studien an diesem Organ durchzuführen. Um dies zu ermöglichen, haben wir Technologien entwickelt, die es uns erlauben, den

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Forschung

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Immunology and Infection

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In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung...

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

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Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

Dieser Artikel berichtet über eine detaillierte Methode zur dynamischen Messung und Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit in einzelnen Blutgefäßen des Lebergefäßsystems der Maus unter Verwendung der intravitalen mikroskopischen Bildgebung in Kombination mit einer spezifischen Methodik zur Bildaufnahme und -analyse.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

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Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

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