Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

Wir zeigen das Verfahren für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Milz mit GFP transgenen Malaria-Parasiten und die Quantifizierung der Parasiten Mobilität und die Durchblutung in diesem Organ.

In diesem Verfahren zeigen wir einen quantitativen intravitalen Mikroskopie-Ansatz, um die Dynamik der Parasitenpassage durch die Milz zu beurteilen. In einem Nagetier-Malaria-Modell werden Mäuse, die mit GFP-transgenen Parasiten infiziert sind, für die intravitale Mikroskopie der Milzvene vorbereitet. Die Kanülierung ermöglicht die Injektion von intravitalen Farbstoffen. Während des Experiments werden fluoreszierende Zellen abgebildet, die sich in verschiedenen Bereichen der Milz bewegen.

Wir liefern die Mythologie, um die Beweglichkeit von Parasiten im dreidimensionalen langsamen Kompartiment der roten Pulpa zu beschreiben und den Blutfluss der Gefäße zu berechnen. Diese Parameter wurden verwendet, um die Milzdynamik von zwei PUL-Stämmen zu vergleichen. Hallo zusammen.

Mein Name ist Nando El Portillo und eine der Hauptforschungsfragen in meinem Labor ist es, die Rolle der Milz bei Malaria zu verstehen. Die S-Splenomegalie ist einer der Meilensteine dieser Krankheit, aber aufgrund technischer und ethischer Probleme ist es sehr schwierig, Studien über dieses Organ durchzuführen. Um dies zu erreichen, haben wir Technologien entwickelt, die es uns ermöglichen, den dynamischen Durchgang dieses Parasiten zu sehen und dieses Phänomen zu quantifizieren.

Das werden Lorena und MI in diesen Protokollen erklären. Diese Forschung wird zum Teil in Zusammenarbeit mit den Gruppen von Dr. Ler von der Universität Hamburg in Deutschland und Dr. Maria Kbo hier an der Krankenhausklinik durchgeführt und hat die allgemeine Finanzierung von gefunden, fion Cellex und ministerielle CIA In Espanol Infektion wird von Spender M initiiert, der entweder mit tödlichen oder nicht-tödlichen GFP-Parasiten bei 10% Parasiten infiziert ist. Um den Parasiten zu kontrollieren, entnehmen Sie einen kleinen Tropfen Blut aus der Schwanzvene der Maus und verlängern Sie ihn auf einem Mikroskop.

Schieben Sie eine chole metrische Färbung mit GIMs. Eine Lösung ermöglicht die Visualisierung infizierter roter Blutkörperchen nach dem Trocknen, fixiert den Blutausstrich zwei Minuten lang mit Methanol, trägt eine Lösung auf GIMs auf und inkubiert 20 Minuten lang. Waschen Sie den Objektträger mit aktuellem Leitungswasser und zählen Sie den prozentualen Anteil der PBCS an den gesamten Erythrozyten mit einem Lichtmikroskop mit 100 x Öl trocken. Objektiv.

Infizieren Sie Mäuse mit letalen oder nicht-tödlichen Parasiten, die aus dem Schwanzblut von Spendermäusen gewonnen wurden, die in PBS verdünnt wurden. Passen Sie die Dosis so an, dass eine halbe Million Parasiten pro Maus injiziert werden, um am dritten Tag nach der Infektion einen peripheren Parasitenanteil von 1 % zu erreichen, und injizieren Sie intraperitoneal. Alternativ können FITC-markierte RBCs in der Steuerung verwendet werden.

Die Tiere entnehmen einer Maus einen Milliliter arterielles Blut und waschen das Pellet durch Zentrifugation in PBS, das EDTA enthält, in FITC-Lösung und inkubieren zwei Stunden lang im Dunkeln unter leichtem Rühren. Nach dieser Zeit den Überstand durch Zentrifugieren entfernen und ausgiebig waschen. In eine Kontrollmaus injizieren, um den Durchschnitt 1 % in der peripheren Zirkulation zu erreichen, und fahren Sie mit In-vivo-Experimenten fort.

Hallo, ich bin mija. Um die Milz in vivo abzubilden, müssen wir eine kleine Synergie des Tieres durchführen, um die Milz auf einer offensichtlich solchen Technik freizulegen. Ich habe es von Stephanie GR im Labor von Arbeiter Heisler gelernt, bei der ich mich bedanken möchte und nun zeige ich Ihnen, wie es weitergeht.

Bildgebung der infizierten Myose Durchgeführt am dritten Tag nach der Infektion, wenn der Parat-Wert in beiden Stämmen 1 % beträgt. Halten Sie die Maus während des gesamten Eingriffs betäubt und in regulierter Temperatur. Schützen Sie die Augen vor der Hydratation und stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie das Fußpolster anpingen, bevor Sie fortfahren, um die intravenöse Verabreichung von Substanzen zu erleichtern.

Im Verlauf des Experiments wird die Mausschwanzvene kanüliert, um die Kanüle zu konstruieren. Führen Sie eine kleine Nadel in das eine Ende einer Tube und ihren Applikator in das andere. Befüllen Sie die Kanüle mit physiologischer Kochsalzlösung, um Blasen zu entfernen, und überprüfen Sie, ob die Lösung korrekt durch die Kanüle fließt.

Die Seitenvene des Schwanzes wird sauber kanüliert. Verbessern Sie die Sicht, indem Sie eine weiche Einschnürung an der Basis des Schwanzes vornehmen. Führen Sie die Spitze der Kanüle in die Vene ein.

Das Auftreten von Blut deutet darauf hin, dass die Nadel gut positioniert ist. Ist dies nicht der Fall, wiederholen Sie die Kanüle stromaufwärts der Vene und befestigen Sie dann die Kanüle mit Kleber und Klebeband am Schwanz. Legen Sie den unteren Teil der Milz durch einen kleinen Schnitt in der Haut und Muskulatur an der linken Rückenseite des Tieres frei.

Platzieren Sie eine Milz an einer Stelle, an der weniger Atembewegung beobachtet wird, und tragen Sie PBS auf die freiliegende Oberfläche auf, um sie von den Maushaaren zu reinigen und mit Feuchtigkeit zu versorgen. Versiegeln Sie die Milz mit einer Abdeckung des Schlafes, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Hallo, mein Name ist Lorena.

Das gezeigte Protokoll ermöglicht es uns, die Bewegung von PULI-Parasiten durch die Milz zu visualisieren. Möglich wurde dies dank GFP-transgenen Parasiten. Mit freundlicher Spende von James Burnes von der Drexel University.

Die Bildgebung der Bewegung von fluoreszierenden Parasiten wird uns Aufschluss darüber geben, ob es Unterschiede im Verhalten zwischen letalen und nicht-letalen Stämmen gibt. Die Experimente mit der Vidal-Mikroskopie wurden in einem Leica Multiphotonenmikroskop durchgeführt, das mit einem Inkubationssystem mit Temperaturregelung und einem 63-fach-Glycerin-Objektiv ausgestattet war. Platzieren Sie das Tier auf dem Tisch des Mikroskops mit einer Abdeckung der Schlafmilz nach unten zum Objektiv. Anfänglich.

Die Visualisierung der Milz bei niedrigeren Vergrößerungen gibt einen Überblick über die Mikrozirkulationsstruktur des Organs. Es wird beobachtet, wie GFP-Parasiten die Milz mit autofluoreszierendem Gewebe fokussieren, die durch die verschiedenen Bereiche der Milz gelangen. Hallo, mein Name ist Maria Albo vom Wissenschaftlichen und Technologischen Zentrum der Universität Barcelona, und wir werden intravitale Bildgebung der Milz machen.

Um den Blutfluss und die Beweglichkeit infizierter roter Blutkörperchen zu untersuchen, werden wir ein konfokales Mikroskop verwenden, das mit einem Resonanzscan ausgestattet ist, der eine Hochgeschwindigkeitsbildgebung ermöglicht, die sehr nützlich ist, um die Bewegung des Organs zu vermeiden. Hierbei handelt es sich um ein Spektralmikroskop, mit dem der Sehbereich ausgewählt werden kann. Um sehr schnell abbilden zu können, werden wir die gleichzeitige Erfassung der beiden Fluorescein, Markierung und Reflexion durchführen.

Wählen Sie verschiedene Zonen aus, die mit Hilfe von RBC-, Reflexions-, Kontrast- und Vidal-Farbstoffen abgebildet werden sollen, um Milz-Mikrovaskulatur nachzuweisen. Wir erklären nun, wie man die Beweglichkeit von Parasiten im Gefäßblutfluss mit Hilfe der Vidal-Mikroskopie und der Bild-J-Software messen kann, um die Bewegung der Parasiten im dreidimensionalen Geflecht der roten Pulpa zu verfolgen. Erfassen Sie Bilder in fünf Z-Tiefen mit einem Hochgeschwindigkeits-Scanmodus.

Konvertieren Sie Bildstapel in Z-codierte Farbfilme, um die Verfolgung einer einzelnen fluoreszierenden Zelle zu erleichtern. Detaillierte Informationen Werden im Text bereitgestellt: Verfolgen Sie verschiedene Partikel im Zeitverlauf in der Tiefe in jedem Video unter Verwendung von X-, Y-, Z- und T-Koordinaten. Mobilitätsparameter wie Richtung, mittlere Geschwindigkeit und Verweilzeit können berechnet und als Verteilungskarten dargestellt werden, um eine vergleichende Analyse zwischen Stammpopulationen zu ermöglichen. Der Gefäßfluss in der Milz kann durch systemische Injektion mehrerer fluoreszierender Moleküle, die in der unterstützenden Tabelle beschrieben sind, wie z. B. Dextrin, dargestellt werden.

Und mit endogenem Erythrozytenreflexionskontrast scannen Sie den Blutfluss in der Mittellinie, indem Sie die Gefäße horizontal in Richtung des Laserscannings ausrichten und einen erhöhten Liniendurchschnitt verwenden. In diesen Bildern werden die Schlieren, die aus bewegten Zellen resultieren, zur Berechnung des Blutflusses verwendet, Bilder von Gefäßen mit unterschiedlichen Durchmessern aufgenommen und über den Herzzyklus hinweg Schwankungen ausgleichen. Die Milz galt lange Zeit als Blackbox in der Malariaforschung, und hier haben wir einen quantitativen intravitalen Mikroskopie-Ansatz entwickelt, um Einblicke in die Dynamik der Parasiteninfektion und des Blutflusses in diesem Organ zu erhalten, der es uns ermöglicht, wichtige biologische Fragen wie die In-vivo-Adhärenz infizierter roter Blutkörperchen an der Milz zu beantworten.

Danke und.