Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Mikrozirkulation im Gehirn der Maus mittels Intravitalmikroskopie zu untersuchen, die es ermöglicht, dynamische Veränderungen der hämodynamischen und entzündlichen Marker in der Mikrozirkulation des Flors über längere Zeiträume zu verfolgen. Diese Technik wurde am La Jolla Bioengineering Institute entwickelt, wo sie für viele Arten von Studien verwendet wurde. Zum Beispiel die Nachbeobachtung hämodynamischer Veränderungen im Verlauf einer Plasmodium-burgi-onca-Infektion und zum Zeitpunkt der Ausprägung von zerebraler Malaria.

Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Wochen vor den intravitalen Mikroskopieuntersuchungen ein chronisches Schädelfenster implantiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Gesamtmorphologie des Schädelfensters mit Hilfe eines hochauflösenden digitalen Bildes bei geringer Vergrößerung aufzunehmen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, intravitale Mikroskopiebilder mit konventioneller und fluoreszierender Beleuchtung zu erfassen und bestimmte Untersuchungszentren für Online-Messungen des Gefäßdurchmessers und der Erythrozytengeschwindigkeit auszuwählen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Intravitalanalyse der Leukozyten- und Thrombozytenadhärenz in den Florgefäßen mittels fluoreszenzmarkierter spezifischer Antikörper durchzuführen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die in vivo mikrozirkulatorische Veränderungen in zerebralen Spiegelmodellen physiologischer pathophysiologischer oder krankhafter Zustände durch intravitale Mikroskopie des Gehirns zeigen, um hämodynamische Veränderungen zu etablieren, die mit diesen Zuständen verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir das Gehirn in seiner physiologischen Umgebung beobachten, ohne es äußeren Einflüssen oder künstlichen Medien auszusetzen; die Intravitalmikroskopie hat im Vergleich zum Bild, der Magnetresonanz und der Angiographie eine räumliche und zeitliche Auflösung und ermöglicht es uns, von der mikroskopischen zur mikroskopischen Ebene zu blicken.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Physiologie und Pathophysiologie der Mikrozirkulation des Gehirns zu beantworten, wie z.B. hämodynamische und entzündliche Veränderungen bei akuten und chronischen Erkrankungen Zwei bis drei Wochen vor der Intravitalmikroskopie. Eine Kraniotomie wird bei acht bis 10 Wochen alten Mäusen durchgeführt, es wurde zuvor gezeigt, dass kein Titanstab in den Kopf des Tieres eingesetzt wird. Das chronische Schädelfenster ist ein stabiles Präparat, das eine Untersuchung der Mikrozirkulation des Flors auch Monate nach der Implantation am Tag des Experiments ermöglicht.

Überprüfen Sie zunächst die Körpertemperatur des Tieres, bevor Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen setzen, in dem zuvor präparierte, fluoreszenzmarkierte Erythrozyten durch die Schwanzvene der Maus infundiert werden. Dies wird eine Erythrozytenverfolgung ermöglichen, die später demonstriert wird. Betäuben Sie die Maus dann leicht mit Fluor.

4 % für Induktion, ein bis 2 % für die Wartung. Legen Sie das Tier anschließend in Bauchlage in einen stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen. Sichern Sie den Kopf vorsichtig mit den Ohrbügeln und stellen Sie die Höhe mit dem rechten und linken Hebel ein.

Reinigen Sie den Abdeckbezug am Schädelfenster vorsichtig mit einem mit Mineralöl angefeuchteten Wattestäbchen. Machen Sie dann mit einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera verbunden ist, einige Panoramafotos von den Schiffen unter dem Fenster. Nachdem Sie die Panoramafotos auf einen Computer übertragen haben, wählen Sie das beste aus, um es zu drucken, zu identifizieren und zu datieren.

Dieses Foto wird als Karte für Messungen des Gefäßdurchmessers und der Geschwindigkeiten der roten Blutkörperchen verwendet, die als nächstes zu Beginn der intravitalen Mikroskopie demonstriert werden. Übertragen Sie die Maus auf einen individuell angefertigten Intravital-Mikroskoptisch. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Schädelfenster und nutzen Sie dabei die Vertiefung, die das Zahnacryl bildet.

Zum Einsatz kommt ein 20 x Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,5. Die Bilder werden mit zwei Kameras aufgenommen, einer digitalen Hochgeschwindigkeitskamera, die mit einem Computer und Monitor verbunden ist, und einer analogen Kamera bei schlechten Lichtverhältnissen, die mit einem Videorekordband, einem Zeitstempel und einem Farbmonitor verbunden ist, bevor die Gefäße für die Messung ausgewählt werden, die Gefäße überprüft werden, um die Qualität des Präparats zu beurteilen und ob Blut in allen Gefäßen fließt. Wählen Sie dann die zu messenden Gefäße aus. Sie sollten Veranstaltungsorte und Arterien mit unterschiedlichen Durchmessern umfassen und verschiedene Stellen innerhalb des durch das Fenster freigelegten Bereichs abdecken.

In unserem Experiment wählen wir 12 Gefäße für die Messung aus, während Sie verschiedene Felder innerhalb des Schädelfensters betrachten. Um die Gefäße auszuwählen, die genaue Position jedes zu messenden Flecks auf dem Foto des PY-Gefäßsystems zu kommentieren, das zuvor für jeden Fleck aufgenommen wurde, wird der Gefäßdurchmesser mit einer Bildschervorrichtung gemessen. Sobald der Spot ausgewählt ist, wird das Bild des Gefäßes in der vertikalen Position ausgerichtet und das Bild wird bis zum Gegenteil geschert.

Die Extreme werden ausgerichtet und der Messwert dokumentiert. Für die Erythrozytenverfolgung wird jeder Fleck von der Digitalkamera für mindestens 30 Sekunden aufgezeichnet, und die Videobilder werden mit 150 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Diese Rate ist so eingestellt, dass ein bis sechs Bilder einer Zelle auf einem Videobild zur Bestimmung von Geschwindigkeiten von bis zu sechs Millimetern pro Sekunde erhalten werden.

Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück, um sich mit geeigneter Software von der Anästhesie zu erholen. Die aufgenommenen Videobilder werden digitalisiert und XY. Es werden Koordinatendaten für jedes Zellenbild abgerufen. Die Zellpositionen werden nicht durch Bildanalyse, sondern manuell bestimmt.

Angesichts der Tatsache, dass das Auge eines geschulten Beobachters eine gute Schätzung der Position des Zentrums einer Zelle liefert, die im Allgemeinen der Position der beobachteten maximalen Fluoreszenz entspricht. Für die meisten Zellorientierungen werden Positions- und Geschwindigkeitsbestimmungen für 15 Zellen in jedem Gefäß vorgenommen. Ein Mittelwert zur Ermittlung der mittleren RBC-Geschwindigkeit, sobald der Behälterdurchmesser und die RBC-Geschwindigkeitsmessungen verfügbar sind.

Die Berechnung des Blutflusses in jedem Gefäß kann unter Verwendung der Formel Q gleich D über zwei Quadrate mal PI mal V erfolgen, wobei Q gleich dem Blutfluss, V gleich der Erythrozytengeschwindigkeit und D gleich dem Gefäßdurchmesser für die Beurteilung und Analyse der Leukozytenadhärenz in Pfahlgefäßen ist. Die Intravitalmikroskopie wird an einem Tier durchgeführt, das mit einer Mischung aus FSE-markiertem Albumin und Antikörpern gegen den Pan-Leukozytenmarker CD 45, markiert mit Texas Red, infundiert wurde. Das fluoreszenzmarkierte Albumin ermöglicht eine verbesserte Visualisierung des Gefäßnetzwerks, einschließlich der durchdringenden Gefäße, und ist besonders nützlich bei Krankheitszuständen wie zerebraler Malaria, um nach nicht oder zu wenig durchbluteten Gefäßen zu suchen.

Die fluoreszenzmarkierten Anti-CD 45-Antikörper erleichtern die Identifizierung und Quantifizierung des Rollens und der Adhäsion von Leukozyten an Pfahlgefäßen. Die Quantifizierung der Leukozytenadhäsion erfolgt durch Zählen der Anzahl der Leukozyten in einer Gefäßlänge von 100 Mikrometern. Das Rollen wird quantifiziert, indem die Anzahl der Leukozyten gezählt wird, die sich 30 Sekunden lang mit einer Geschwindigkeit bewegen, die deutlich langsamer ist als die Blutgeschwindigkeit bei gleichen 100 Mikrometern Länge. Gezeigt.

Hier ist ein Beispiel für mikrovaskuläre Geschwindigkeitsmessungen der roten Blutkörperchen durch Zellverfolgung anhand von Hochgeschwindigkeitsfluoreszenz. Videoaufnahmen Bilder A bis F sind Sequenzbilder der Mikrozirkulation. Jedes Bild stellt die Position eines einzelnen fließenden roten Blutkörperchens dar, das Bild für Bild von der Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommen wird.

Diese Grafik aus einem repräsentativen Experiment zeigt die Veränderungen des Blutflusses im Stapel im Laufe der Zeit. Bei Plasmodium-, Burgi-, Onca-infizierten Mäusen und bei nicht infizierten Kontrollmäusen ist der Blutfluss über die Zeit relativ stabil, während bei Kontrollmäusen der Blutfluss relativ stabil ist. PBA-infizierte Mäuse zeigen einen Marktrückgang des Blutflusses in einer Zeit, in der sich zerebrale Malaria entwickelt.

Am sechsten Tag, der Färbung mit Anti-CD 45, Texas rot fluoreszierenden Antikörpern, zeigen sie eine große Anzahl von Leukozyten, die an den Pfahlgefäßen einer Maus haften, die mit Plasmodium burgi onca infiziert war. Dieses Verfahren hat neben dem einen Job, der heute hier ist, ein breites Anwendungsspektrum. Jede optische Technik, die in vivo verwendet werden kann, kann an dieses Modell angepasst werden, und Parameter wie Gewebe, Sauerstoffgehalt des Gewebes, pH-reaktive Sauerstoffspezies und endotheliale Interaktion mit Leukozyten können in diesem Modell untersucht werden.