Name: Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Mikrozirkulation im Mäusegehirn mit chronischem Schädelfenster. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung hämodynamischer und entzündlicher Veränderungen in der Pialmikrozirkulation über längere Zeit.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01-HL87290, R01-HL87290-S1 und R01-AI082610 von den National Institutes of Health, um LJMC unterstützt.

1. Kraniotomie Ein Kraniotomie in 8-zu-10-Wochen alten Mäusen muss im Voraus, wie oben beschrieben 1 durchgeführt werden, es sei denn, dass eine Titan-bar nicht in den Kopf des Tieres gelegt. Die chronische kranialen Fenster ist eine stabile Zubereitung ermöglicht Untersuchung der Pia Mikrozirkulation auch Monate nach der Implantation. In der Regel führen wir unsere Studien 2-3 Wochen nach der Schädelbasis Fenster Implantation. 2. Intravitalmikroskopie <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der Kraniotomie, Körpertemperatur überprüft wird und dann die Maus leicht mit Isofluran (4% für die Induktion, 1-2% für die Wartung). Leichte Betäubung wird verwendet, um Tier Stress und Unbehagen während der experimentellen Verfahren zu verhindern. </li><li> Die Tiere werden dann in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen und der Kopf sorgfältig gesichert mit Ohr Bars. Die Höhe wird mit Hilfe des rechten und linken Hebel. Kerntemperatur des Körpers aufrechterhalten wird mit einem Heizkissen. Da Mäuse mit zerebraler Malaria zu entwickeln Hypothermie, müssen die Temperatur-Einstellungen für jedes Tier angepasst werden. </li><li> Das Deckglas auf dem kranialen Fenster ist vorsichtig mit einem Wattestäbchen mit Mineralöl und ein Panorama-Bild der Schiffe unter dem Fenster ist mit Hilfe von einem Stereomikroskop und einer Digitalkamera (Nikon Coolpix 995, Japan) entnommen befeuchtet gereinigt. Das Bild gedruckt ist, identifiziert und datiert und wird als eine Karte für die Messung von Gefäßdurchmesser und der roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeiten eingesetzt werden. </li><li> Die Maus wird dann zu einer intravitalen Mikroskoptisch (customized Leica-McBain, San Diego, CA) übertragen. Ein Tropfen Wasser auf den kranialen Fenster unter Ausnutzung der auch durch die zahnärztliche Acryl gebildet wird platziert, wird der Fokus eingestellt. Die Messungen werden mit einem 20-fach (LUMPFL-WIR, numerische Apertur 0,6, Olympus) Wasserimmersionsobjektiv durchgeführt. Das gleiche Gefäße, so dass direkte Vergleiche zu ihren Ausgangswerten durchgeführt werden konnte und so für mehr robust Statistiken für kleine Stichprobe der Bevölkerung, gefolgt. Die Bilder werden mit einer digitalen schwachem Licht Hochgeschwindigkeitskamera (Hamamatsu C9300-221, Japan), oder zu wenig Licht analoge Kamera (COHU 4815, San Diego, CA) verbunden mit einem Videoband (JVC, Japan), Uhrzeit (Microimage Video Systems, Boyertown, PA) und einem Farbmonitor (PELCO, Clovis, CA). Das Band ist richtig, bevor die Aufnahme beginnt identifiziert, und die Zeitstempel ermöglicht die Identifizierung der Ereignisse durch die Dokumentation der Zeitrahmen, in dem diese Ereignisse wurden umkodiert. </li><li> Eine erste Überprüfung der Schiffe wird, um die Qualität der Vorbereitung zu bewerten und, wenn das Blut ist in allen Gefäßen fließt. Dann ist die Auswahl der Gefäße gemessen werden gemacht und es sollte Venolen und Arteriolen mit unterschiedlichen Durchmessern (in unserer Maus Pia Vorbereitungen, Reichweite die meisten Schiffe zwischen 20 und 80 um) gehören und decken verschiedene Standorte innerhalb des durch das Fenster ausgesetzt. Arteriolen und Venolen können einfach, indem Sie die Richtung des Blutflusses in die Verästelungen des Schiffes (ob es oder vertreibt sammelt Blut) unterschieden werden. In unseren Studien werden die Messungen in 12 Schiffen. Die genaue Lage der einzelnen Stelle zu messen ist, kommentierten in das Bild des Pia-Gefäße. </li><li> Für jeden Punkt, ist der Gefäßdurchmesser gemessen unter Verwendung eines Bildes Scher-Gerät (Bild Shear, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. Sobald die Stelle ausgewählt wurde, wird das Bild des Schiffes in senkrechte Position ausgerichtet und das Bild wird geschert, bis der Gegensatz Extreme ausgerichtet sind und das Lesen wird dokumentiert. Dieser Wert kann in Mikrometer durch vorherige Kalibrierung für jede spezifische Vergrößerung mit einem Absehen Calibration Tischmikrometer (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ) übersetzt werden. </li><li> Jeder Spot wird während mindestens 30 Sekunden für Erythrozyten-Tracking aufgezeichnet. Für Tracking ist eine Blutprobe erhoben und Erythrozyten sind fluoreszierend mit markierten die Carbocyanin Farbstoff Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) und infundiert über die Schwanzvene einer in vivo-Konzentration von ~ 0,4-0,5% 3 zu erhalten. Bei Tieren mit Plasmodium berghei ANKA (PbA) Expression des grün fluoreszierenden Proteins (PBA-GFP, eine Spende der Malaria Forschung und Referenzreagens Resource Center MR4, Manassas, VA; von CJ Janse und AP Waters hinterlegt) infiziert, keine Infusion von markiertem Zelle notwendig ist. Die Videobilder werden bei 150 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Dieser Zinssatz soll auf 1-6 Bilder von einer Zelle auf einem Video-Frame für die Bestimmung der Geschwindigkeiten zu erhalten, um 8 mm / s. Die Videobilder werden mit einem Personal Computer mit Adobe Premier 4.0 Software digitalisiert und xy-Koordinatensystem für jede Zelle Bildes unter Verwendung SigmaScan Pro 4.0-Software (SPSS Chicago, IL) 4. Zell-Positionen sind manuell und nicht durch Bildanalyse ermittelt, da das Auge eines geschulten Beobachters gezeigt wurde, um eine gute Einschätzung der Lage der Mitte einer Zelle, die gebenh in der Regel entspricht der Position der maximalen Fluoreszenz für die meisten Zellen Orientierungen beobachtet. Mehrere Bestimmungen der Position und Geschwindigkeit sind für jede Zelle hergestellt und gemittelt, um meine RBC Geschwindigkeit zu erhalten. </li><li> Wenn RBC Geschwindigkeitsmessungen offline durchgeführt werden, wird die gesamte Beobachtungszeit für jede Maus nicht überschreiten 10-15 Minuten Minimierung der cardiodepressive Auswirkungen der Narkose. </li><li> Sobald Gefäßdurchmesser und RBC Geschwindigkeitsmessungen verfügbar sind, die Berechnung des Blutflusses in jedes Schiff kann mit der Formel vorgenommen werden: Q = V x π (D / 2) 2, wobei Q = Blutfluss, V = RBC Geschwindigkeit und D = Gefäßdurchmesser. </li><li> Diese Verfahren können im Laufe der Zeit wiederholt werden. Zum Beispiel, in dem Mausmodell der cerebralen Malaria führen wir tägliche Messungen, beginnend am Tag 4 der Infektion. Die erhaltenen Werte jeden Tag für jede Maus sind in Bezug auf Tag 0 (vor der Infektion), die als 100% normiert. </li><li> Neben Gefäßdurchmesser und Blutfluss Messungen können weitere Auswertungen vorgenommen, zum Beispiel eine verbesserte Beurteilung der Perfusion und der Analyse der Leukozyten-und / oder Thrombozyten-Rollen und die Einhaltung in Pia-Schiffe sein. Diese Messungen werden mit Hilfe der Fluoreszenz-markierten Marker durchgeführt. Im Fall von Malaria, können wir auch erkennen, Umluft-oder anhaftenden Parasiten durch den Einsatz der PBA-Stamm, GFP zum Ausdruck bringt. </li><li> Für Perfusion Beurteilung verwenden wir eine Lösung von FITC-markiertem Albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), und Leukozytenadhärenz zu Pia Schiffe verwenden wir Antikörper gegen die pan-Leukozyten-Marker CD45 mit Texas Red (TxR) gekennzeichnet quantifizieren ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Dazu 25 &amp;mgr; l des Albumin-FITC (2mg/mL) und 20 &amp;mgr; l der anti-CD45-PE Antikörper (200μg/mL) werden gemischt und injiziert in den vorgewärmten Schwanzvene. Die Maus kann dann sofort abgebildet werden, wenn Leckmessungen dauert Albumin-FITC erlaubt wird, für 15 Minuten zirkulieren. Grüne Fluoreszenz (518nm) durch Albumin-FITC und GFP (PBA-GFP PRBC) emittiert wird gefangen genommen und mit ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), und anti-CD45-TxR Fluoreszenz (615nm) ist beendet und gefangen mit einem Vivid Standard: XF42. </li><li> Die Fluoreszenz-markierten Albumin ermöglicht eine verbesserte Visualisierung der Gefäßnetz, einschließlich eindringende Schiffe, und es ist besonders nützlich in Krankheiten wie zerebrale Malaria für nicht-durchblutete oder unter durchbluteten Gefäßen zu überprüfen. Es kann auch verwendet werden, um vaskuläre Leckage 5 messen werden. </li><li> Die Fluoreszenz-markierten anti-CD45 Antikörper machen es leicht zu identifizieren und zu quantifizieren, Leukozyten-Rolling und die Adhäsion an Pia Schiffe. Zur Vermeidung von Verzerrungen bei der Quantifizierung, quantifizieren wir rollen und Haftung in den gleichen Stellen vordefinierte, um den Blutfluss zu messen. Die Quantifizierung der Adhäsion von Leukozyten wird durch Zählen der Anzahl der Leukozyten in einem 100 um-Schiff Länge. Rollende wird durch Zählen der Anzahl der Leukozyten reisen mit einer Geschwindigkeit deutlich langsamer als Blutflussgeschwindigkeit in der gleichen Länge 100 um, während 30 Sekunden quantifiziert. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (Schritt 2,6) Bilder von der Maus Pia Gefäßnetz zugänglich durch die kraniale Fenster. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. (Schritte von 3,1 bis 3,5) Schematische Darstellung des Aufbaus für die Intravitalmikroskopie der Maus Pia Mikrozirkulation. 1: Intravitalmikroskopie Mikroskop; 2: 20X Wasserimmersionsobjektiv; 3: Lichtquelle; 4a: digitale Low-Light-High-Speed-Kamera, 4b: Analog-Kamera, 5: Maus in der stereotaktischen Rahmen, 6: Computer-Monitor, 7: Analog Shearer Monitor zeigt, wie das Bild Scherung (Pfeil) getan wird, um Gefäßdurchmesser zu messen. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. (Step 3,6-3,8) Microvascular roten Blutkörperchen Geschwindigkeitsmessungen durch Zell-Tracking von High-Speed-Fluoreszenz-Videoaufnahmen. Bilder von A bis F sind Folge Bilder von einem Pia Schiff, zeigt ein einziges bewegliches RBC über den mikroskopischen Bereich begrenzt durch die Kamera. Manuelle Bestimmung von Frame für Frame-Positionen von 15 oder mehr Zellen über das Feld, mit seinen vorkalibrierten Distanz, ermöglicht die Berechnung der mittleren RBC Geschwindigkeit in jedes Schiff mit Hilfe einer Excel-Tabelle. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. (Schritt 3,9) Daten eines repräsentativen Experiments zeigt die Veränderungen in Pia Blutfluss im Laufe der Zeit in Plasmodium berghei ANKA (PbA) infizierten Mäusen (n = 5) und in infizierten Mäusen der Kontrollgruppe (n = 5). Während in den Kontroll-Mäusen Pia Blutfluss im Zeitverlauf relativ stabil, zeigen PBA-infizierten Mäusen eine deutliche Abnahme des Blutflusseszum Zeitpunkt der zerebralen Malaria Entwicklung (Tag 6). Daten sind der Mittelwert ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. (Schritt 4,3) Eine große Zahl von Leukozyten adhärent Pia Schiffe mit einer Maus mit Plasmodium berghei ANKA infiziert, wie durch Färbung mit anti-CD45-Texas Red fluoreszierenden Antikörpern offenbart.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

Die Intravitalmikroskopie hier beschriebene Methode bietet eine einzigartige und leistungsstarke Werkzeug für die detaillierte Beobachtung der Pia Mikrozirkulation in der Maus. Es ermöglicht Aussonderung einzelner Arteriolen und Venolen und Messung von Veränderungen einer Reihe von Parametern wie Gefäßdurchmesser, RBC Geschwindigkeiten, die Durchblutung, die Einhaltung und Rollen der Leukozyten, Thrombozyten und andere Blut-Elemente, vaskuläre Leckage-, Gewebe-pH und pO2 und möglicherweise viele andere Anwendungen. Die ...

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Carbocyaninfarbstoff Dil</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-TxR-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

intravitalmikroskopie von gehirn der maus mikrozirkulation mit einem closed cranial fenster

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Dieses experimentelle Modell wurde entwickelt, um die Maus Pia Mikrozirkulation während der akuten und chronischen, physiologischen und pathophysiologischen hämodynamischen, Entzündungs-und Stoffwechselerkrankungen zu beurteilen, mit in vivo Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein geschlossener Schädel-Fenster wird über den linken parieto-okzipitalen Kortex der Maus platziert. Lokale Mikrozirkulation wird in Echtzeit durch das Fenster mit epi-und Fluoreszenz-Beleuchtung und Messungen von Schiffen Durchmessern und roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeiten durchgeführt werden aufgezeichnet. RBC Geschwindigkeit gemessen mit real-time Kreuzkorrelation und / oder Fluoreszenz-markierten Erythrozyten. Leukozyten und Thrombozyten Einhaltung pialen Gefäße und Beurteilung der Perfusion und vaskuläre Leckage mit Hilfe der Fluoreszenz-markierten Marker wie Albumin-FITC und anti-CD45-Antikörper TxR gemacht. Mikrozirkulation kann wiederholt werden, über mehrere Tage auf Video aufgezeichnet. Wir haben zum ersten Mal die Fenster schließen Gehirn Intravitalmikroskopie der Pia Mikrozirkulation auf dynamische Veränderungen im Laufe des Plasmodium berghei ANKA-Infektion in Mäusen zu folgen und zeigen, dass die Expression von CM mit mikrozirkulatorischen Störungen durch Vasokonstriktion charakterisiert verbunden ist, starke Abnahme im Blut-Studie flow und schließlich Kreislaufkollaps.

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Dieses experimentelle Modell wurde entwickelt, um die piale Mikrozirkulation der Maus unter akuten und chronischen, physiologischen und pathophysiologischen hämodynamischen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mikrozirkulation im Maushirn mittels intravitale Mikroskopie zu untersuchen, wodurch die dynamischen Veränderungen hämodynamischer und entzündlicher Marker in der pialen Mikrozirkulation über längere Zeiträume hinweg verfolgt werden können. Diese Technik wurde am La Jolla Bioengineering Institute entwickelt, wo sie für zahlreiche Studientypen eingesetzt wurde. Beispielsweise zur Beobachtung hämodynamischer Veränderungen während des Verlaufs einer Plasmodium berghei-Infektion sowie zum Zeitpunkt des Auftretens einer zerebralen Malaria.Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Wochen vor den intravitale Mikroskopie-Studien ein chronisches Schädel-Fenster implantiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Gesamtmorphologie des Schädel-Fensters mithilfe eines hochauflösenden Digitalbilds bei niedriger Vergrößerung aufzuzeichnen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, intravitale Mikroskopiebilder unter Verwendung konventioneller und fluoreszenter Beleuchtung aufzunehmen und spezifische Untersuchungsstellen für Online-Messungen des Gefäßdurchmessers und der Erythrozyten-Geschwindigkeit auszuwählen.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Adhärenz von Leukozyten und Thrombozyten in den Pfeilern mittels fluoreszenzmarkierter spezifischer Antikörper intravitale zu analysieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die in vivo mikrozirkulatorische Veränderungen in zerebralen Spiegelmodellen physiologischer, pathophysiologischer oder krankhafter Zustände durch intravitale Mikroskopie des Gehirns zeigen, um die mit diesen Zuständen assoziierten hämodynamischen Veränderungen zu erfassen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir das Gehirn in seiner physiologischen Umgebung beobachten, ohne es externen Agentien oder künstlichen Medien auszusetzen. Im Vergleich zu bildgebender Magnetresonanztomographie und Angiographie bietet die intravitale Mikroskopie eine höhere räumliche und zeitliche Auflösung und ermöglicht es uns, vom makroskopischen bis zum mikroskopischen Niveau zu untersuchen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen zur Physiologie und Pathophysiologie der mikrovaskulären Durchblutung im Gehirn beantworten, beispielsweise hämodynamische und entzündliche Veränderungen während akuter und chronischer Erkrankungen. Zwei bis drei Wochen vor der intravitale Mikroskopie wird bei Mäusen im Alter von acht bis zehn Wochen eine Kraniotomie durchgeführt, wie zuvor beschrieben, mit der Ausnahme, dass keine Titanhalterung am Kopf des Tieres befestigt wird. Das chronische Schädel Fenster stellt eine stabile Präparation dar, die es ermöglicht, die piale Mikrozirkulation sogar Monate nach der Implantation am Tag des Experiments zu untersuchen.Zunächst überprüfen Sie die Körpertemperatur des Tieres, bevor Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen bringen und zuvor vorbereitete, fluoreszenzmarkierte Erythrozyten über die Schwanzvene der Maus infundieren. Dies ermöglicht die Verfolgung der Erythrozyten, was später gezeigt wird. Anschließend betäuben Sie die Maus leicht mit Isofluran.4 % zur Induktion, ein bis 2 % zur Aufrechterhaltung. Danach das Tier in Bauchlage in einen stereotaktischen Halter auf einer Heizplatte bringen. Den Kopf vorsichtig mit den Ohrstiften fixieren und die Ebene mithilfe der rechten und linken Hebel justieren.Reinigen Sie vorsichtig den Deckglaser des Schädel-Fensters mit einem mit Mineralöl angefeuchteten Wattestäbchen. Nehmen Sie anschließend mithilfe eines Stereomikroskops, das an eine Digitalkamera angeschlossen ist, mehrere Panoramafotos der unter dem Fenster liegenden Gefäße auf. Nach der Übertragung der Panoramafotos auf einen Computer wählen Sie das beste Bild aus, um es zu drucken, zu kennzeichnen und zu datieren.Dieses Foto wird als Karte für die Messung des Gefäßdurchmessers und der roten Blutkörperchengeschwindigkeiten verwendet, was im Folgenden zur Einleitung der intravitale Mikroskopie gezeigt wird. Übertragen Sie die Maus auf eine speziell angefertigte Bühne für die intravitale Mikroskopie. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Schädel-Fenster, wobei Sie die durch den Zahnacrylat gebildete Vertiefung nutzen.Ein 20x-Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,5 wird verwendet. Die Bilder werden mit zwei Kameras aufgezeichnet: einer digitalen lichtempfindlichen Hochgeschwindigkeitskamera, die an einen Computer und Monitor angeschlossen ist, sowie einer analogen lichtempfindlichen Kamera, die an ein VCR-Band, eine Zeitstempelvorrichtung und einen Farbmonitor angeschlossen ist. Vor der Auswahl der Gefäße zur Messung sollten die Gefäße überprüft werden, um die Qualität der Präparation zu beurteilen und festzustellen, ob Blut in allen Gefäßen fließt. Anschließend werden die zu messenden Gefäße ausgewählt. Diese sollten Venen und Arterien unterschiedlicher Durchmesser umfassen und verschiedene Bereiche innerhalb des durch das Fenster exponierten Gebiets abdecken.In unserem Experiment wählen wir 12 Gefäße zur Messung aus, während Sie verschiedene Bereiche innerhalb des kranialen Fensters betrachten. Zur Auswahl der Gefäße kennzeichnen Sie die genaue Position jedes zu messenden Punkts auf dem zuvor aufgenommenen Foto der PY-Gefäßstruktur; dort wird der Gefäßdurchmesser mithilfe eines Bildverschiebungsgeräts gemessen. Sobald der Punkt ausgewählt ist, wird das Bild des Gefäßes in vertikaler Position ausgerichtet und das Bild so lange verschoben, bis die gegenüberliegenden.Die Extrema werden ausgerichtet und die Messung dokumentiert. Zur Erythrozytenverfolgung wird jeder Punkt mindestens 30 Sekunden lang mit der Digitalkamera aufgezeichnet, und die Videobilder werden mit 150 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Diese Rate wird gewählt, um ein bis sechs Bilder einer Zelle auf einem Videobild zu erhalten, um Geschwindigkeiten bis zu sechs Millimetern pro Sekunde bestimmen zu können.Nach Abschluss der Datensammlung wird die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen entfernt und in ihren Käfig zurückgebracht, um sich von der Anästhesie zu erholen, wobei geeignete Software verwendet wird. Die gewonnenen Videobilder werden digitalisiert, und es werden XY-Koordinatendaten für jedes Zellbild ermittelt. Die Zellpositionen werden manuell und nicht durch Bildanalyse bestimmt.Da das Auge eines geschulten Beobachters eine gute Schätzung der Lage des Zellzentrums liefert, das im Allgemeinen der Position der maximalen Fluoreszenz entspricht, werden für die meisten Zellorientierungen Position und Geschwindigkeit für 15 Zellen in jedem Gefäß bestimmt. Ein Mittelwert wird berechnet, um die mittlere Erythrozyten-Geschwindigkeit zu erhalten, sobald die Gefäßdurchmesser- und Erythrozyten-Geschwindigkeitsmessungen vorliegen.Die Berechnung des Blutflusses in jedem Gefäß kann mithilfe der Formel Q gleich D durch zwei zum Quadrat mal PI mal V erfolgen, wobei Q dem Blutfluss, V der Erythrozyten-Geschwindigkeit und D dem Gefäßdurchmesser entspricht, zur Beurteilung der Perfusion und Analyse der Leukozytenadhärenz in Pfeilerg Gefäßen. Die intravitale Mikroskopie wird an einem Tier durchgeführt, das mit einer Mischung aus FSE-markiertem Albumin und Antikörpern gegen den Pan-Leukozyten-Marker CD 45, markiert mit Texas Red, infundiert wurde. Das fluoreszenzmarkierte Albumin ermöglicht eine verbesserte Visualisierung des vaskulären Netzwerks, einschließlich eindringender Gefäße, und ist insbesondere bei Krankheitszuständen wie zerebraler Malaria nützlich, um nicht oder unzureichend perfundierte Gefäße zu identifizieren.Die fluoreszenzmarkierten Anti-CD45-Antikörper ermöglichen es, das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten an Gefäßwänden leicht zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Quantifizierung der Leukozytenadhäsion erfolgt durch Zählen der Anzahl von Leukozyten in einem Gefäßabschnitt von 100 Mikron Länge. Das Rollen wird quantifiziert, indem die Anzahl der Leukozyten gezählt wird, die sich innerhalb von 30 Sekunden mit einer deutlich geringeren Geschwindigkeit als der Blutgeschwindigkeit im selben 100-Mikron-Abschnitt bewegen.Hier ist ein Beispiel für die Messung der mikrovaskulären Erythrozyten-Geschwindigkeit durch Zellverfolgung mittels Hochgeschwindigkeitsfluoreszenz. Die Videobildaufnahmen von A bis F zeigen aufeinanderfolgende Bilder der Mikrozirkulation. Jedes Bild stellt die Position eines einzelnen fließenden Erythrozyten dar, der von der Hochgeschwindigkeitskamera bildfrequenzweise erfasst wurde.Dieses Diagramm aus einem repräsentativen Experiment zeigt die zeitlichen Veränderungen der Blutflussgeschwindigkeit in der Milz. Bei mit Plasmodium, burgi, onca infizierten Mäusen und bei nicht infizierten Kontrollmäusen bleibt der Blutfluss in der Milz im Verlauf der Zeit relativ stabil, während infizierte Mäuse eine deutliche Abnahme des Blutflusses zum Zeitpunkt der Entwicklung einer zerebralen Malaria aufweisen.Am sechsten Tag zeigen Färbungen mit anti-CD45-Antikörpern, die mit Texas Red fluoresziert sind, eine große Anzahl von Leukozyten, die an den Blutgefäßen einer mit Plasmodium berghei infizierten Maus haften. Dieses Verfahren hat eine breite Palette von Anwendungen jenseits der hier heute gezeigten Aufgabe. Jede optische Technik, die in vivo angewendet werden kann, lässt sich an dieses Modell anpassen, und Parameter wie Gewebe, Sauerstoffgehalt des Gewebes, pH-Wert, reaktive Sauerstoffspezies sowie die Interaktion von Endothelzellen mit Leukozyten können in diesem Modell untersucht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Kortikale Durchblutung Dynamik kann in vivo durch bildgebende fluoreszierenden Dextran Farbstoffe in die Schwanzvene von Nagetieren, die mit 2-Photonen-Mikroskopie injiziert untersucht werden. Dieses Video zeigt, wie man Bild Blutfluss Dynamik in Neokortex der Maus über einen mit Glas überdachten kranialen Fenster Vorbereitung.

Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In diesem Video führen wir eine intravitale Bildgebung von präinjizierten Krebszellen in einem Mausmodell über ein implantiertes Schädelfenster durch. Dieses hochauflösende Zeitraffer-Bildgebungsverfahren ermöglicht die Untersuchung des dynamischen Verhaltens von Krebszellen in der lebenden Maus.

Cranial Window-based Intravital Imaging in a Mouse Model: Eine bildgebende Technik zur Untersuchung des Verhaltens von vorinjizierten Krebszellen im Gehirn eines Mausmodells

Quelle: Sweeney, A. M., et al. In vivo Bildgebung des Liquortransports durch den intakten Schädel der Maus mittels Fluoreszenzmakroskopie. (2019)Dieses Video zeigt den Prozess der Visualisierung des Liquorflusses (CSF) in einem Mäusegehirn mithilfe von Fluoreszenzbildgebung. Ein fluoreszierender Tracer wird in die Cisterna magna (CM) injiziert, so dass ihre Bewegung mit dem Liquor durch den Subarachnoidal- und perivaskulären Raum verfolgt werden kann. Die Zeitrafferbildgebung erfasst die Reise...

In-vivo-Bildgebung des Liquortransports in einem Mäusegehirn mittels Fluoreszenzmakroskopie

Chirurgische Verschluss eines distalen Arteria cerebri media Zweig (MCAo) ist ein häufig verwendetes Modell in experimentellen Schlaganfallforschung. Diese Handschrift beschreibt die grundlegende Technik der Dauer MCAo, mit der Einfügung eines seitlichen Schädelfenster kombiniert werden, die die Möglichkeit für eine Längsintravitalmikroskopie in Mäusen bietet.

Lateral Chronic Cranial Fenster Vorbereitung Ermöglicht In Vivo Beobachtung Nach Artery Occlusion Distal cerebri bei Mäusen

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Die transkranielle optische Bildgebung ermöglicht eine Großfeld-Bildgebung des Zerebrospinalflüssigkeitstransports im Kortex lebender Mäuse durch einen intakten Schädel.

In Vivo Imaging von Cerebrospinalfluid Transport durch den intakten Mausschädel mittels Fluoreszenz-Makroskopie

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Erfahren Sie die Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Mikrozirkulation im Mäusegehirn mit chronischem Schädelfenster. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung hämodynamischer und entzündlicher Veränderungen in der Pialmikrozirkulation über längere Zeit.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

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