Name: Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in Pflanzenzellwänden durch Raman-Imaging und multivariate Analyse. Diese zerstörungsfreie Methode liefert wertvolle chemische Einblicke in Biomasse.

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Wir danken dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (2016YDF0600803) für die finanzielle Unterstützung.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Schneiden Sie einen kleinen Gewebeblock (ca. 3 mm x 3 mm x 5 mm) aus der Pflanzenprobe ( zB Pappelstiel). </li><li> Tauchen Sie das Gewebe 30 Minuten lang in kochendes deionisiertes Wasser ein. Sofort 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf deionisiertes Wasser übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gewebe auf den Boden des Behälters sinkt, was darauf hinweist, dass die Luft im Gewebe entfernt wurde und dass sich das Gewebe erweicht hat. Hinweis: Für die Proben, die vor diesem Schritt nach unten sinken, wiederholen Sie diesen Zyklus im Allgemeinen 3-5 mal. </li><li> Vorbereitung von 20, 50, 70, 90% (v / v) Aliquoten von Polyethylenglykol (PEG) in deionisiertem Wasser sowie reinem PEG und halten die Lösungen bei 65 ° C. </li><li> Inkubieren Sie das Gewebe in einer Reihe von abgestuften PEG-Bädern, um das Wasser zu verdrängen und lassen Sie das PEG infiltrieren. Hinweis: In der Regel wird PEG mit einem Molekulargewicht 2.000 (PEG2000) zum Einbetten verwendet. <ol><li> Verarbeiten Sie das Gewebe mit gPEG in einem Trockenofen wie folgt: (a) 20% PEG für 1 h, (b) 50% PEG für 1,5 h, (c) 70% PEG für 2 h, (d) 90% PEG für 2 h und (E) 100% PEG für 10 h. </li></ol></li><li> Vorwärmen einer Kassette bei 65 ° C in einem Ofen. Gießen Sie den PEG mit dem Block in die Kassette und legen Sie den Gewebeblock in eine gewünschte Position mit vorgewärmten Pinzetten oder Nadeln. </li><li> Langsam die Kassette abkühlen und das Gewebe bei RT bis zum Gebrauch aufbewahren. </li><li> Den PEG-Block, der das Zielgewebe enthält, in einen kleinen Block (ca. 1 cm x 1 cm x 2 cm) mit einer scharfen Rasierklinge zerlegen und auf das Mikrotom aufbringen. </li><li> Schneiden Sie dünne Abschnitte aus dem PEG-Block (typischerweise 3-10 μm). </li><li> Spülen Sie den Abschnitt mit deionisiertem Wasser in einem Uhrglas 10 mal, um das PEG aus dem Gewebe zu entfernen. </li><li> Tauchen Sie die Sektionen mit Toluol / Ethanol (2: 1, v / v) für 6 h ein, um die Extrakte zu entfernen. Die Reaktionsflüssigkeit wird durch Mischen von 65 ml entionisiertem Wasser, 0,5 ml Essigsäure und 0,6 g Natriumchlorid zubereitetRitus in einem Becher Einen Teil und 3 ml Reaktionsflüssigkeit in eine 5 ml Durchstechflasche geben. Schrauben Sie auf die Oberseite der Durchstechflasche. </li><li> Die Durchstechflasche im Wasserbad bei 75 ° C für 2 h erhitzen, um das Lignin des Gewebes zu entfernen. Spülen Sie den Abschnitt mit deionisiertem Wasser in einem Uhrglas 10 mal aus. </li><li> Den unbehandelten / delignenten Abschnitt auf einen Glasmikroskop-Objektträger übertragen. Füllen Sie den Abschnitt sorgfältig mit Pinsel oder Nadeln. Das extra entionisierte Wasser mit Seidenpapier entfernen. </li><li> Tauchen Sie den Abschnitt in D 2 O ein. Bedecken Sie die Probe mit einem Glasdeckel. Den Deckel mit Nagellack abdichten, um die Verdampfung des D 2 O zu verhindern. </li></ol> 2. Spektrale Erfassung <ol><li> Öffnen Sie die Instrumentensoftware des konfokalen Raman-Mikroskops. Schalten Sie den Laser ein (Wellenlänge = 532 nm), fokussieren Sie auf die Oberfläche des kristallinen Siliziums mit einem 100fachen Mikroskopobjektiv und klicken Sie auf die Kalibriertaste, um das Instrument zu kalibrieren. </li><li> Gerät einschaltenZum optischen Mikroskop-Modus und schalten Sie die Mikroskop-Lampe ein. Montieren Sie den Mikroskop-Objektträger auf der Bühne, wobei der Deckel dem Objektiv zugewandt ist. </li><li> Sehen Sie die Probe mit einem 20X-Mikroskop-Objektiv an und suchen Sie den interessanten Bereich. Das Tauchöl auf das Deckglas auftragen und auf das Immersionsmikroskopobjektiv wechseln (60X, numerische Blende NA = 1.35). Konzentriere dich auf die Oberfläche der Probe. </li><li> Schalten Sie das Gerät in den Raman-Testmodus und schalten Sie die Mikroskoplampe aus. </li><li> Wählen Sie einen Mapping-Bereich mit einem rechteckigen Werkzeug. Ändern Sie die Schrittgröße, um die Anzahl der erhaltenen Spektren zu bestimmen. Hinweis: Beachten Sie die Schrittweite (meist größer als der durch die numerische Apertur des Objektivs berechnete Spotdurchmesser, theoretisch 1,22λ / NA). Größen darunter führen zu Überabtastungen. </li><li> Stellen Sie die optimalen Spektralparameter ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und die spektrale Qualität in einer geeigneten Erfassungszeit (im Allgemeinen &lt;8 h) zu erhaltenNding auf die Eignung der Probe. Im Allgemeinen werden die Bildgebungsparameter in die Instrumentensoftware wie folgt eingegeben: Laser (532 nm), Filter (100%), Loch (300), Schlitz (100), Spektrometer (1.840 cm -1 ), Rillen (1200t), Objektiv ( 60X Öl) und Erfassungszeit (2 s). </li><li> Speichern Sie die Spektraldaten vor der Datenverarbeitung und konvertieren sie in ein universelles Format ( zB TXT-Dateien). </li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Laden Sie die Spektraldaten (TXT-Dateien) in die Datenanalyse-Software ( zB Matlab). Wenden Sie eine Rauschunterdrückung auf den Datensatz an, um das SNR zu verbessern ( zB der Savitzsky-Golay-Algorithmus oder der Wavelet-Algorithmus) </li><li> Verwenden Sie unbehandelte Proben, um die Bilder von Lignin und Polysacchariden herzustellen. Für die Lignin-Bildgebung betrachten wir den spektralen Peak um 1.600 cm -1 aufgrund der aromatischen Ring-symmetrischen Streckschwingungen. Für die Polysaccharid-Bildgebung (einschließlich Cellulose und Hemicellulose) verwenden Sie den Spektralpeak aRund 2,889 cm -1 wegen der CH- und CH2-Strecken. </li><li> Verwenden Sie delignifizierte Proben, um die Bilder von Cellulose und Hemicellulose zu erzeugen. Führen Sie eine selbstmodellierende Kurvenauflösung (SMCR) auf den erworbenen Spektren durch, um die Spektren von Cellulose und Hemicellulose zu unterscheiden und ihre Verteilungen abzubilden. </li><li> Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Clusteranalyse auf die erfassten Daten durch, um die Raman-Spektren von verschiedenen Zellwandschichten zu unterscheiden. </li></ol>

<ol><li>Gonzalo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Enzymes+Involved+in+Lignin+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation.</a> J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).</li>
<li>Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosatella%2C+AA+%22Ionic+Liquids+in+the+Biorefinery+Concept%3A+Challenges+and+Perspectives%22">Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives</a>. , Wiley. 38-64 (2016).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+removing+spectral+contaminants+to+improve+analysis+of+Raman+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data.</a> Sci. Rep. 6, 39891(2016).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automatically+identifying+spectra+of+different+wood+cell+wall+layers+in+Raman+imaging+data+set%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set.</a> Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Pflanzenzellwand ist ein Verbundwerkstoff, der in mehrere Schichten organisiert ist, darunter Zell-Ecke (CC), Sekundärwand (SW, mit den S1-, S2- und S3-Schichten) und zusammengesetzte mittlere Lamellen (CML, mittlere Lamellen plus die angrenzende Primär- Wand), was es schwierig macht, bei der Probenvorbereitung eine ebene Oberfläche zu erhalten. So müssen Pflanzenproben, vor allem Gras, die eine kompliziertere Struktur als Holz haben, oft verfestigt werden, um eine Feinschnittung zu ermöglichen. PEG ist eine ideale ...

Pflanzenbiomasse ist die am häufigsten vorkommende erneuerbare Ressource auf der Erde; besteht hauptsächlich aus Lignin, Zellulose und Hemizellulose; und gilt als attraktive Quelle für Bioenergie und biobasierte Chemikalien1. Leider kann es dem Abbau widerstehen und der pflanzlichen Zellwand hydrolytische Stabilität oder strukturelle Robustheit verleihen. Diese Beständigkeit ist auf die zugängliche Oberfläche, die Größe der Biomassepartikel, den Polymerisationsgrad, die Zellulosekristallinität und das schützende Lignin2 zurückzuführen. Ein umfassendes Verständnis der strukturellen und chemischen Beschaffenheit der pflanzlichen Zellwand ist daher sowohl aus Sicht der Pflanzenbiologie und -chemie als auch aus Sicht der kommerziellen Nutzung von Bedeutung. Gängige nasschemische Analysen wie Chromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie liefern nur durchschnittliche Daten zur Zusammensetzung der gemessenen Probe. Darüber hinaus sind diese Methoden invasiv und zerstören die ursprüngliche Struktur des Pflanzengewebes3. 
Die Raman-Bildgebungstechnik ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zerstörungsfreien Visualisierung von räumlich aufgelösten chemischen Informationen4. Es verwendet ein Laserlicht, um eine inelastische Streuung mit einem Photon zu verursachen, und beruht auf Änderungen der Polarisierbarkeit, die sich aus den molekularen Schwingungen ergeben. In diesem Fall verursacht Wasser eine schwache Raman-Streuung, wodurch dieser Ansatz für In-situ-Untersuchungen biologischer Proben geeignet ist5. Die Anwendung der Raman-Bildgebungstechnik auf die pflanzliche Zellwand kann die Struktur und Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwände in ihrem nativen Zustand aufklären, mit einer Auflösung auf der Skala der einzelnen Zelle und sogar der Zellwandschichten6. Eine typische Raman-Imaging-Analyse einer pflanzlichen Zellwand besteht im Allgemeinen aus drei Schritten: 1) Probenvorbereitung, 2) spektrale Erfassung und 3) Datenverarbeitung. 
Obwohl einer der Hauptvorteile der Raman-Bildgebung die Möglichkeit ist, markierungsfreie und zerstörungsfreie Spektren mit minimaler Probenvorbereitung zu erzielen, ist dennoch eine physikalische Probenschnittung erforderlich, um die interessierende Oberfläche zu belichten. Dieser Vorgang sollte sorgfältig durchgeführt werden, um eine ebene Oberfläche zu erhalten, da die Technik von der Beibehaltung des optischen Fokus abhängt7. Die spektrale Erfassung erfordert ein Gleichgewicht zwischen Bildqualität und langen Erfassungszeiten8. Die Datenverarbeitung zielt darauf ab, die chemische Information effektiv aus den Bilddaten zu extrahieren, insbesondere für die Komponenten mit ähnlichen chemischen Strukturen, wie Cellulose und Hemicellulose. Aufgrund der starken spektralen Überlappung sind die genauen Spektren schwer zu erkennen. In diesem Fall ist die multivariate Analyse ein einfacher Ansatz, um die verborgenen strukturellen und chemischen Informationen effektiv aufzudecken9. In dieser Arbeit wird ein allgemeines Protokoll vorgestellt, das die Verwendung von Raman-Bildgebung zur Visualisierung der Hauptkomponenten in pflanzlichen Zellwänden, einschließlich Lignin, Cellulose und Hemicellulose, beschreibt.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM430</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Raman-Mikroskop</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Xplora</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Shanghai ZHICHENG</td><td>ZXFD-A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

kombinieren von raman imaging und multivariater analyse zur visualisierung von lignin, cellulose und hemicellulose in der pflanzenzellwand

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Die Anwendung der Raman-Bildgebung zur Pflanzen-Biomasse nimmt zu, da sie räumliche und kompositorische Informationen über wässrige Lösungen anbieten kann. Die Analyse erfordert in der Regel keine umfangreiche Probenvorbereitung; Strukturelle und chemische Informationen können ohne Etikettierung erhalten werden. Jedoch enthält jedes Raman-Bild Tausende von Spektren; Dies wirft Schwierigkeiten auf, wenn man versteckte Informationen extrahiert, vor allem für Komponenten mit ähnlichen chemischen Strukturen. Diese Arbeit führt eine multivariate Analyse ein, um dieses Problem zu lösen. Das Protokoll stellt eine allgemeine Methode zur Visualisierung der Hauptkomponenten, einschließlich Lignin, Cellulose und Hemicellulose, innerhalb der Pflanzenzellwand dar. In diesem Protokoll werden Verfahren zur Probenvorbereitung, spektrale Erfassung und Datenverarbeitung beschrieben. Es ist sehr abhängig von der Bedienerfertigkeit bei der Probenvorbereitung und der Datenanalyse. Mit diesem Ansatz kann eine Raman-Untersuchung von einem nicht-spezialisierten Benutzer durchgeführt werden, um hig zu erwerbenH-Qualitätsdaten und aussagekräftige Ergebnisse für die Pflanzenzellwandanalyse.

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über ein typisches Mikro-Raman-System für die Raman-Bildgebung einer Pflanzenzellwand. Als Beispiel haben die ursprünglichen Raman-Spektren der Pappel ( Populus nigra L.) signifikante Baseline-Drifts und Spikes (Abbildung 2a ). Nach Durchführung des automatischen Vorverarbeitungsverfahrens für den Raman-Bilddatensatz (APRI) werden diese beiden spektralen Verunreinigungen erfolgreich ent...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein allgemeines Verfahren zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in Pflanzenzellwänden unter Verwendung von Raman-Bildgebung und multivariater Analyse vorzustellen.

Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine allgemeine Methode zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand mittels Raman-Bildgebung und multivariater Analyse vorzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der pflanzlichen Biomasse zu beantworten, beispielsweise wie sich die wichtigsten chemischen Bestandteile in der Pflanzenzellwand verteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass mit minimalem Probenvorbereitungsaufwand automatisierte und zerstörungsfreie Informationen über die Probe gewonnen werden können.Schneiden Sie zunächst einen kleinen Gewebeprobeblock aus der Pflanzenprobe. Tauchen Sie das Gewebe 30 Minuten lang in kochendes entionisiertes Wasser ein. Überführen Sie es anschließend unverzüglich in entionisiertes Wasser bei Raumtemperatur und lassen es dort 30 Minuten lang. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gewebe auf den Boden des Behälters sinkt, was darauf hinweist, dass die Luft aus dem Gewebe entfernt wurde und das Gewebe weich geworden ist. Bereiten Sie Aliquote aus PEG und deionisiertem Wasser mit 20 %, 50 %, 70 % und 90 % sowie reines PEG vor. Halten Sie die Lösungen bei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Wand abgeleitet Kohlenhydrate.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

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