Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein allgemeines Verfahren zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in Pflanzenzellwänden unter Verwendung von Raman-Bildgebung und multivariater Analyse vorzustellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine allgemeine Methode zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der pflanzlichen Zellwand durch Raman-Bildgebung und multivariate Analyse vorzustellen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der pflanzlichen Biomasse zu beantworten, z. B. wie sich die wichtigsten chemischen Bestandteile in der pflanzlichen Zellwand verteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass arbeitslose und zerstörungsfreie Informationen über die Probe mit minimaler Probenvorbereitung erhalten werden können.

Schneide zu Beginn einen kleinen Gewebeblock aus der Pflanzenprobe ab. Tauchen Sie das Gewebe 30 Minuten lang in kochendes entionisiertes Wasser. Übertragen Sie es dann sofort für 30 Minuten in entionisiertes Wasser bei Raumtemperatur.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gewebe auf den Boden des Behälters sinkt, was darauf hinweist, dass die Luft im Gewebe entfernt wurde und das Gewebe weich geworden ist. Bereiten Sie 20%50%70%und 90%aliquot PEG und deionisiertes Wasser sowie reines PEG vor. Bewahren Sie die Lösungen bei 65 Grad Celsius auf.

Inkubieren Sie das Gewebe in einer Reihe von abgestuften PEG-Bädern, um das Wasser zu verdrängen und das PEG infiltrieren zu lassen. Trocknen Sie eine Stunde lang in 20 % PEG, eineinhalb Stunden in 50 % PEG, zwei Stunden lang 70 % PEG, zwei Stunden lang 90 % PEG und 100 % PEG für 10 Stunden. Als nächstes heizen Sie eine Kassette bei 65 Grad Celsius in einem Ofen vor.

Gießen Sie den Gewebeblock mit PEG in die Kassette und platzieren Sie den Gewebeblock dann mit einer vorgewärmten Pinzette oder Nadel in einer gewünschten Position. Kühlen Sie die Kassette langsam ab und lagern Sie das Taschentuch bis zur Verwendung bei Raumtemperatur. Präparieren Sie den PEG-Block mit dem Zielgewebe mit einer scharfen Rasierklinge in einen kleinen Block.

Montieren Sie den kleinen PEG-Block auf das Mikrotom und schneiden Sie dünne Schnitte aus dem PEG-Block ab. Spülen Sie dann die Schnitte 10 Mal mit entionisiertem Wasser in einer Uhrenklasse ab, um das PEG aus dem Gewebe zu entfernen. Tauchen Sie die Abschnitte anschließend sechs Stunden lang in Toluol und Ethanol, um die Extrakte zu entfernen.

Bereiten Sie die Reaktionsflüssigkeit vor, indem Sie 65 ml entionisiertes Wasser, 0,5 ml Essigsäure und 0,6 g Natriumchlorid in einem Becherglas mischen. Geben Sie einen Abschnitt und 3 ml Reaktionsflüssigkeit in ein 5-ml-Fläschchen. Schrauben Sie die Oberseite des Fläschchens an.

Erhitzen Sie dann das Fläschchen in einem Wasserbad bei 75 Grad Celsius für zwei Stunden, um das Lignin aus dem Gewebe zu entfernen. Spülen Sie den Abschnitt 10 Mal mit entionisiertem Wasser in einem Uhrglas ab. Übertragen Sie anschließend den unbehandelten und entholzten Schnitt auf einen Objektträger aus Glasmikroskop.

Falten Sie den Abschnitt vorsichtig mit Bürsten oder Nadeln auseinander. Entfernen Sie das überschüssige deionisierte Wasser mit Seidenpapier. Tauchen Sie dann den Abschnitt in Deuteriumoxid.

Decken Sie die Probe mit einem Deckglas aus Glas ab. Versiegeln Sie den Deckglas mit Nagellack, um die Verdunstung des Deuteriumoxids zu verhindern. Öffnen Sie die Bediensoftware des konfokalen Raman-Mikroskops.

Schalten Sie den Laser ein und konzentrieren Sie sich mit einem 100-fachen Mikroskopobjektiv auf den Service von Kristall und Silizium. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierung, um das Gerät zu kalibrieren. Schalten Sie das Gerät in den optischen Mikroskopmodus und schalten Sie die Mikroskoplampe ein.

Montieren Sie den Objektträger auf dem Tisch, wobei das Deckglas zum Objektiv zeigt. Betrachten Sie die Probe mit dem 20-fach-Mikroskopobjektiv und lokalisieren Sie den interessierenden Bereich. Wechseln Sie zum Tauchmikroskop-Objektiv.

Tragen Sie Immersionsöl auf das Deckglas auf und konzentrieren Sie sich dann auf die Oberfläche der Probe. Schalten Sie anschließend das Gerät in den Raman-Testmodus und schalten Sie die Mikroskoplampe aus. Wählen Sie einen Mapping-Bereich mit einem rechteckigen Werkzeug aus.

Ändern Sie die Schrittweite, um die Anzahl der erhaltenen Spektren zu bestimmen. Beachten Sie, dass die Schrittweite größer sein sollte als der Spotdurchmesser, der durch die numerische Apertur des Objektivs berechnet wird. Größen darunter führen zu einer Überbemusterung.

Stellen Sie die optimalen spektralen Parameter ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis und die beste spektrale Qualität sowie eine geeignete Erfassungszeit in Abhängigkeit von der Probeneignung zu erhalten. Im Allgemeinen geben Sie die Bildgebungsparameter in der Gerätesoftware mit einer Laserwellenlänge von 532 Nanometern, einem Filter von 100 %, einem Loch von 300, einem Schlitz von 100, einem Spektrometer von 1840 inversen Zentimetern, Rillen von 1200 T, einem 60-fachen Ölobjektiv und einer Erfassungszeit von zwei Sekunden ein. Speichern Sie die Spektraldaten vor der Datenverarbeitung und konvertieren Sie die Daten in ein universelles Format, bevor Sie mit der Datenanalyse fortfahren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier sind die originalen Raman-Spektren der Pappelzellwand zu sehen. Zwei wichtige Rauschsignale, einschließlich Basisliniendrifts und kosmischer Spitzen, schwappen zusammen mit den eigentlichen Signalen in die Kanäle über. Diese sollten vor der Datenanalyse entfernt werden.

Eine Rauschunterdrückungstechnik wie der Savitzky-Golay-Algorithmus oder der Wavelet-Algorithmus kann angewendet werden, um diese Rauschsignale zu eliminieren. Für die Lignin-Bildgebung ist der spektrale Peak um 1600 inverse Zentimeter aufgrund der symmetrischen Streckschwingung des aromatischen Rings zu berücksichtigen. Verwenden Sie für die Polysaccharid-Bildgebung den spektralen Peak um 2889 inverse Zentimeter wegen der CH- und CH2-Dehnungen.

Raman-Bilder von Cellulose und Hemicellulose können jedoch nicht direkt erstellt werden. Die Delignifizierung ist ein notwendiges Verfahren, um die spektralen Eigenschaften von ihnen freizulegen. Im Allgemeinen sind wir neu in dieser Methode.

Wir haben Schwierigkeiten, weil es eine Schulung in der Handhabung und dem Aussehen der Probenschnitte und der Datenanalyse erfordert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit in-situ-Methoden chemische Informationen über die pflanzliche Zellwand gewinnen können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie eine chemische Vorbehandlung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Widerspenstigkeit der pflanzlichen Zellwand.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die innere strukturelle Natur und die Topochemie innerhalb der pflanzlichen Zellwand geben kann, kann sie auch auf andere biologische Proben angewendet werden.