라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

이 실험의 전반적인 목표는 라만 이미징 및 다변량 분석을 통해 식물 세포벽의 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 주요 화학 성분이 식물 세포벽에 어떻게 분포하는지와 같은 식물 바이오매스 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 시료 준비로 시료에 대한 노동력 및 비파괴 정보를 얻을 수 있다는 것입니다.

시작하려면 식물 샘플에서 작은 조직 블록을 자릅니다. 끓는 탈이온수에 조직을 30분 동안 담그십시오. 그런 다음 즉시 실온의 탈이온수에 30분 동안 옮깁니다.

조직이 용기 바닥으로 가라앉을 때까지 이 단계를 반복하여 조직 내의 공기가 제거되고 조직이 부드러워졌음을 나타냅니다. 20%50%70% 및 90%의 PEG 및 탈이온수 및 순수 PEG를 준비합니다. 용액을 섭씨 65도로 유지하십시오.

일련의 등급이 매겨진 PEG 수조에서 조직을 배양하여 물을 대체하고 PEG가 침투할 수 있도록 합니다. 20% PEG에서 1시간 30분, 50% PEG에서 1시간 30분, 70% PEG에서 2시간, 90% PEG에서 2시간, 100% PEG에서 10시간 동안 건조합니다. 그런 다음 오븐에서 카세트를 섭씨 65도로 예열합니다.

PEG가 들어있는 조직 블록을 카세트에 붓고 예열된 핀셋이나 바늘을 사용하여 조직 블록을 원하는 위치에 놓습니다. 카세트를 천천히 식히고 사용할 때까지 티슈를 실온에 보관하십시오. 날카로운 면도날을 사용하여 표적 조직이 포함된 PEG 블록을 작은 블록으로 해부합니다.

작은 PEG 블록을 마이크로톰에 장착하고 PEG 블록에서 얇은 부분을 자릅니다. 그런 다음 시계 클래스에서 탈이온수로 섹션을 10회 헹구어 조직에서 PEG를 제거합니다. 다음으로, 톨루엔과 에탄올로 절편을 6시간 동안 담궈 추출물을 제거합니다.

비이커에 탈이온수 65mL, 아세트산 0.5mL, 염화나트륨 0.6g을 혼합하여 반응액을 준비합니다. 5mL 바이알에 한 섹션과 3mL의 반응 액체를 추가합니다. 바이알 상단을 조입니다.

그런 다음 바이알을 섭씨 75도의 수조에서 2시간 동안 가열하여 조직의 리그닌을 제거합니다. 시계 유리에 탈이온수로 섹션을 10회 헹굽니다. 다음으로, 처리되지 않고 제거된 부분을 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

브러시나 바늘을 사용하여 섹션을 조심스럽게 펼칩니다. 티슈 페이퍼로 여분의 탈이온수를 제거합니다. 그런 다음 섹션을 중수소 산화물에 담그십시오.

유리 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 중수소 산화물의 증발을 방지하기 위해 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 컨포칼 라만 현미경의 기기 작동 소프트웨어를 엽니다.

레이저를 켜고 100x 현미경 대물렌즈로 결정과 실리콘의 서비스에 집중합니다. 보정 버튼을 클릭하여 기기를 보정합니다. 기기를 광학 현미경 모드로 전환하고 현미경 램프를 켭니다.

현미경 슬라이드를 s에 장착합니다.tage, 커버 슬립이 대물렌즈를 향하도록 합니다. 20x microscope objective로 샘플을 보고 관심 영역을 찾습니다. 침지 현미경 대물렌즈로 전환합니다.

커버 슬립에 이멀젼 오일을 바르고 샘플 표면에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 기기를 라만 테스트 모드로 전환하고 현미경 램프를 끕니다. 사각형 도구를 사용하여 매핑 영역을 선택합니다.

얻어진 스펙트럼의 수를 결정하기 위해 단계 크기를 변경합니다. 단계 크기는 대물렌즈의 개구수로 계산되는 스폿 직경보다 커야 합니다. 이보다 낮은 크기는 샘플링 과잉으로 이어집니다.

최적의 스펙트럼 파라미터를 설정하여 최상의 신호 대 잡음비와 스펙트럼 품질을 얻고 샘플 적합성에 따라 적절한 수집 시간을 확보합니다. 일반적으로 532나노미터의 레이저 파장, 100%의 필터, 300의 구멍, 100의 슬릿, 1840의 역센티미터의 분광계, 1200T의 홈, 60x 오일 대물렌즈 및 2초의 획득 시간을 사용하여 기기 소프트웨어에 이미징 매개변수를 입력합니다. 데이터를 처리하기 전에 스펙트럼 데이터를 저장하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행하기 전에 데이터를 범용 형식으로 변환합니다.

포플러 세포벽의 원래 라만 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다. 베이스라인 드리프트(baseline drift)와 우주 스파이크(cosmic spikes)를 포함한 두 가지 주요 잡음 신호가 실제 신호와 함께 채널로 흘러 들어옵니다. 이러한 항목은 데이터 분석 전에 제거해야 합니다.

이러한 잡음 신호를 제거하기 위해 Savitzky-Golay 알고리즘 또는 웨이블릿 알고리즘과 같은 잡음 감소 기법을 적용할 수 있습니다. 리그닌 이미징의 경우, 방향족 고리 대칭 스트레칭 진동으로 인한 약 1600 역센티미터의 스펙트럼 피크를 고려하십시오. 다당류 이미징의 경우 CH 및 CH2 스트레치로 인해 약 2889센티미터 역센티미터의 스펙트럼 피크를 사용합니다.

그러나 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 라만 이미지는 직접 생성할 수 없습니다. Delignification은 그들의 스펙트럼 특성을 노출시키는 데 필요한 절차입니다. 일반적으로 우리는 이 방법을 처음 사용합니다.

우리는 샘플 절편화와 데이터 분석의 취급 및 외관에 대한 교육이 필요하기 때문에 어려움을 겪고 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 현장 방법을 사용하여 식물 세포벽에 대한 화학 정보를 획득하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 식물 세포벽의 난치와 같은 추가 질문에 답하기 위해 화학적 전처리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 방법은 식물 세포벽 내의 내부 구조 특성과 지형 화학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 생물학적 샘플에도 적용할 수 있습니다.