Combinaison d'imagerie Raman et analyse multivariée pour visualiser la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans le mur de cellules végétales

L’objectif général de cette expérience est de présenter une méthode générale de visualisation de la lignine, de la cellulose et de l’hémicellulose dans la paroi cellulaire végétale par imagerie Raman et analyse multivariée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biomasse végétale, telles que la répartition des principaux composants chimiques dans la paroi cellulaire végétale. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’obtenir des informations non destructives et sans main-d’œuvre sur l’échantillon avec une préparation minimale de l’échantillon.

Pour commencer, coupez un petit bloc de tissu dans l’échantillon de plante. Plongez le mouchoir dans de l’eau bouillante désionisée pendant 30 minutes. Ensuite, transférez-le immédiatement dans de l’eau déminéralisée à température ambiante pendant 30 minutes.

Répétez cette étape jusqu’à ce que le tissu coule au fond du récipient, indiquant que l’air contenu dans le tissu a été éliminé et que le tissu s’est ramolli. Préparez 20 %50 %, 70 % et 90 % d’aliquotes de PEG et d’eau déminéralisée, ainsi que du PEG pur. Gardez les solutions à 65 degrés Celsius.

Incuber le tissu dans une série de bains de PEG gradués pour déplacer l’eau et permettre au PEG de s’infiltrer. Sécher dans 20 % de PEG pendant une heure, 50 % de PEG pendant une heure et demie, 70 % de PEG pendant deux heures, 90 % de PEG pendant deux heures et 100 % de PEG pendant 10 heures. Ensuite, préchauffez une cassette à 65 degrés Celsius dans un four.

Versez le bloc de tissu contenant du PEG dans la cassette, puis placez le bloc de tissu dans la position souhaitée à l’aide d’une pince à épiler ou d’aiguilles préchauffées. Refroidissez lentement la cassette et conservez le mouchoir à température ambiante jusqu’à utilisation. Disséquez le bloc PEG contenant le tissu cible en un petit bloc à l’aide d’une lame de rasoir tranchante.

Montez le petit bloc PEG sur le microtome et coupez de fines sections dans le bloc PEG. Ensuite, rincez les sections à l’eau déminéralisée dans une classe de montre 10 fois pour éliminer le PEG du tissu. Ensuite, immergez les sections avec du toluène et de l’éthanol pendant six heures pour éliminer les extractifs.

Préparez le liquide de réaction en mélangeant 65 ml d’eau déminéralisée, 0,5 ml d’acide acétique et 0,6 g de chlorure de sodium dans un bécher. Ajouter une section et 3 mL de liquide réactionnel dans un flacon de 5 mL. Vissez le haut du flacon.

Ensuite, chauffez le flacon dans un bain-marie à 75 degrés Celsius pendant deux heures pour éliminer la lignine du tissu. Rincez 10 fois la section à l’eau déminéralisée dans un verre de montre. Ensuite, transférez la section non traitée et délignifiée sur une lame de microscope en verre.

Dépliez soigneusement la section à l’aide de pinceaux ou d’aiguilles. Retirez l’eau déminéralisée supplémentaire avec du papier de soie. Ensuite, immergez la section dans l’oxyde de deutérium.

Recouvrez l’échantillon d’une lamelle en verre. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles pour éviter l’évaporation de l’oxyde de deutérium. Ouvrez le logiciel d’exploitation de l’instrument du microscope Raman confocal.

Allumez le laser et concentrez-vous sur le service du cristal et du silicium avec un objectif de microscope 100x. Cliquez sur le bouton d’étalonnage pour étalonner l’instrument. Passez l’instrument en mode microscope optique et allumez la lampe du microscope.

Montez la lame de microscope sur la platine, avec la lamelle de recouvrement face à l’objectif. Visualisez l’échantillon avec l’objectif du microscope 20x et localisez la zone d’intérêt. Passez à l’objectif du microscope à immersion.

Appliquez de l’huile d’immersion sur la lamelle, puis concentrez-vous sur la surface de l’échantillon. Ensuite, passez l’instrument en mode de test Raman et éteignez la lampe du microscope. Choisissez une zone de cartographie à l’aide d’un outil rectangulaire.

Modifiez la taille du pas pour déterminer le nombre de spectres obtenus. Sachez que la taille du pas doit être supérieure au diamètre du spot, calculé par l’ouverture numérique de l’objectif. Les tailles inférieures à cette taille entraîneront un suréchantillonnage.

Définissez les paramètres spectraux optimaux pour obtenir le meilleur rapport signal/bruit et la meilleure qualité spectrale, ainsi qu’un temps d’acquisition approprié en fonction de l’adéquation de l’échantillon. Généralement, entrez les paramètres d’imagerie dans le logiciel de l’instrument à l’aide d’une longueur d’onde laser de 532 nanomètres, d’un filtre de 100 %, d’un trou de 300, d’une fente de 100, d’un spectromètre de 1840 centimètres inverses, de rainures de 1200T, d’un objectif à huile 60x et d’un temps d’acquisition de deux secondes. Enregistrez les données spectrales avant le traitement des données et convertissez-les dans un format universel avant de procéder à l’analyse des données, comme décrit dans le protocole texte.

Les spectres Raman originaux de la paroi cellulaire du peuplier sont présentés ici. Deux signaux de bruit majeurs, y compris les dérives de base et les pics cosmiques, se répercutent sur les canaux en même temps que les signaux réels. Ceux-ci doivent être supprimés avant l’analyse des données.

Une technique de réduction du bruit telle que l’algorithme de Savitzky-Golay ou l’algorithme des ondelettes peut être appliquée pour éliminer ces signaux de bruit. Pour l’imagerie de la lignine, considérons le pic spectral autour de 1600 centimètres inverses en raison de la vibration d’étirement symétrique de l’anneau aromatique. Pour l’imagerie polysaccharide, utilisez le pic spectral d’environ 2889 centimètres inverses en raison des étirements CH et CH2.

Cependant, les images Raman de cellulose et d’hémicellulose ne peuvent pas être générées directement. La délignification est une procédure nécessaire pour exposer leurs caractéristiques spectrales. En général, nous sommes novices en la matière.

Nous avons du mal, car cela nécessite une formation à la manipulation et à l’apparence du sectionnement des échantillons et à l’analyse des données. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir des informations chimiques sur la paroi cellulaire de la plante à l’aide de méthodes in situ. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le prétraitement chimique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la récalcitrance de la paroi cellulaire végétale.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la nature structurelle interne et de la topochimie de la paroi cellulaire végétale, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons biologiques.