Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung
December 15th, 2017
Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.
Das übergeordnete Ziel dieses zielspezifischen in vivo Bildgebungsansatzes ist es, molekulare Marker für die Krankheitsaktivität bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der entzündlichen Darmerkrankungen und der damit verbundenen therapeutischen Forschung über den Einfluss experimenteller Therapeutika oder spezifischer zellulärer Ereignisse auf Entzündungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Krankheitsaktivität longitudinal und nicht-invasiv überwacht werden kann.
Obwohl diese Methode Einblicke in entzündliche Erkrankungen geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Krankheiten wie Krebs oder immunbedingter Krankheiten angewendet werden. Um eine Kolitis auszulösen, füllen Sie den Trinkvorrat der Versuchsmäuse mit zwei Gramm Dextran-Natriumsulfat oder DSS, gelöst in 100 Millilitern autoklaviertem Trinkwasser, was fünf Millilitern Wasser pro Maus und Tag entspricht. 24 Stunden vor dem Scannen wird der gewünschte Antikörpercocktail in eine sterile, lichtgeschützte Spritze gefüllt und die Antikörper intravenös in die Schwanzvenen der Versuchstiere injiziert.
Rasieren Sie am Tag des Versuchs mit einem Elektrorasierer das Fell in der Bauchregion der Versuchstiere, um die Lichtreflexion und -absorption zu minimieren. Unter Verwendung eines gewebeimitierenden Phantoms mit definierter Dicke und Absorptionseigenschaften wird das Phantom mit einem bestimmten Volumen der interessierenden Antikörperlösung gefüllt und die Fluoreszenz auf der FMT-Vorrichtung gemessen. Klicken Sie dann auf einer veterinärmedizinischen Fluoreszenztomographie oder einem FMT-Gerät für Kleintiere auf Neue Studie und fügen Sie die relevanten Tracer in die Studienbeschreibung ein, einschließlich der Bildgebungsparameter und Dosen.
Erstellen Sie Studiengruppen entsprechend dem Versuchsdesign und statten Sie jede Gruppe mit der entsprechenden Anzahl von Tieren aus. Wenn das System für die Tracer-Konstrukte kalibriert wurde, legen Sie die erste anästhesierte Maus in Rückenlage in eine bei 42 Grad Celsius beheizbare Untersuchungskassette. Setzen Sie die Kassette in das Bildgebungssystem ein und wählen Sie die entsprechende Probe aus der entsprechenden Studiengruppe aus.
Wählen Sie den verabreichten Tracer aus, um sicherzustellen, dass die Werte der Tracerkonzentration korrekt berechnet werden, und erfassen Sie das Fluoreszenzreflexionsbild mit der entsprechenden Wellenlänge für den Scan. Klicken Sie auf Bild erfassen, um das Scanfeld zu umreißen und zu bestätigen, dass das Scanfeld als Überlagerung auf dem Fluoreszenzreflexionsbild angezeigt wird. Passen Sie das Scanfeld so an, dass es den interessierenden Bereich umgibt, und achten Sie darauf, Fehler oder Bereiche mit verbleibendem Fell zu vermeiden.
Wählen Sie je nach Bildziel eine Scanfeldauflösung aus, um die Anzahl der Bilddatenpunkte innerhalb des Scanfelds festzulegen. Klicken Sie dann auf Scannen, um die Bildaufnahme bei der ausgewählten Wellenlänge zu starten. Nehmen Sie das Tier am Ende des Scans aus der Kassette, damit sich das Tier unter Überwachung vollständig erholen kann, bevor es in seinen Käfig zurückkehrt.
Die FMT kann dann zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt werden, je nachdem, was experimentell sinnvoll ist. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, öffnen Sie die entsprechende Bildanalysesoftware und wählen Sie die Rohdaten für den ersten Scan aus. Erstellen Sie mit dem Rekonstruktionswerkzeug 3D-Karten der Fluoreszenzverteilung.
Wenn alle Scans dem entsprechenden Rekonstruktionsdatensatz hinzugefügt wurden, öffnen Sie den ersten Datensatz von Interesse. Es werden alle Scans angezeigt, die für das ausgewählte einzelne Versuchstier durchgeführt wurden. Wählen Sie den entsprechenden Scan aus und klicken Sie auf Laden.
Eine 3D-Rekonstruktion der Tracerverteilung erscheint als Überlagerung des ursprünglich aufgenommenen Fluoreszenzreflexionsbildes. Identifizieren Sie als Nächstes die Herde der unspezifischen Beschriftungsakkumulation auf den rekonstruierten 3D-Karten und verwenden Sie das Messwerkzeug, um den interessierenden Bereich auszuwählen. Die Software generiert dann eine Fluoreszenzintensität für den interessierenden Bereich sowie Messungen der Pikomolarmenge des Tracers, für den der Scan kalibriert wurde.
In diesem Experiment wurde ein fluoreszenzkonjugierter Antikörper gegen murines F4/80 verwendet, um die aktivierten Makrophagen direkt sichtbar zu machen. Eine signifikant erhöhte Akkumulation von fluoreszierendem Tracer wurde mittels Fluoreszenz-vermittelter Tomographie im Dickdarm der kolitischen Mäuse im Vergleich zu den nicht-kolitischen Kontrolltieren gemessen, was auf eine Zunahme der Monozyteninfiltration und Differenzierung in aktive Makrophagen bei den kolitischen Tieren hinweist. Umgekehrt führte die Anwendung eines unspezifischen fluoreszenzkonjugierten IgG-Antikörpers weder in der kolitischen noch in der nicht-kolitischen Kontrollgruppe zu einer nachweisbaren Fluoreszenzreaktion im Abdomen oder Darm, was die Spezifität der Sonden-Ziel-Interaktion des F4/80-Antikörpers zeigt.
Ex-vivo-Messungen der F4/80-gerichteten Tracerakkumulation in explantierten Dickdarmen verifizieren den kolonischen Ursprung der in vivo nachgewiesenen Akkumulation des F4/80-Tracersignals. Tatsächlich korrelieren die berechneten Mengen an gebundenen Antikörpern gut mit der histologisch bestimmten Anzahl infiltrierender Makrophagen, was bestätigt, dass die In-vivo-Bildgebung mit spezifischen Tracern auf eine lokale Krankheitsaktivität hinweisen kann. Einmal gemeistert, kann dies innerhalb weniger Minuten durchgeführt und analysiert werden, wenn es richtig ausgeführt wird.
Die Vorbereitungsschritte, einschließlich der Herstellung spezifischer antikörperbasierter Tracer, dauern in der Regel zwei bis drei Tage. Bei der Planung eines experimentellen Verfahrens wie diesem ist es wichtig, geeignete und zuverlässige Kontrollen einzubeziehen, sowohl für den Antikörper als auch für das Tierseuchenmodell. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Koloskopie oder Durchflusszytometrie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten und die Daten zu validieren und zu quantifizieren.
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Überblick
Diese Studie präsentiert einen zielspezifischen in-vivo-Bildgebungsansatz zur Visualisierung molekularer Marker der Krankheitsaktivität bei entzündlichen Darmerkrankungen. Unter Verwendung einer quantitativen dreidimensionalen tomographischen Bewertung konzentriert sich die Forschung auf die intestinale Makrophageninfiltration in einem murinen Modell der Kolitis.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Entzündliche Darmerkrankungen
Hintergrund
- Zielspezifische Sonden sind innovative Werkzeuge zur Analyse molekularer Mechanismen.
- Sie können zur Untersuchung der Proteinexpression bei verschiedenen Krankheiten eingesetzt werden.
- Diese Methode ermöglicht eine longitudinale und nichtinvasive Überwachung der Krankheitsaktivität.
- Sie kann auf entzündliche Erkrankungen, Krebs und immunbezogene Krankheiten angewendet werden.
Zweck der Studie
- Zur Visualisierung molekularer Marker der Krankheitsaktivität bei entzündlichen Darmerkrankungen.
- Um Schlüsselfragen in der therapeutischen Forschung im Zusammenhang mit Entzündungen zu beantworten.
- Um den Einfluss experimenteller Therapeutika auf Entzündungen zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Induktion von Kolitis mittels Dextran-Natriumsulfat (DSS).
- Intravenöse Verabreichung eines Antikörper-Cocktails an experimentelle Mäuse.
- Fluoreszenz-vermittelte Tomographie zur Bildgebung der Makrophageninfiltration.
- Longitudinale Überwachung der Krankheitsaktivität in vivo.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der intestinalen Makrophageninfiltration.
- Nachweis der Fähigkeit, die Krankheitsaktivität nichtinvasiv zu überwachen.
- Erkenntnisse über die Dynamik der Entzündung bei Kolitis.
- Potenzielle Anwendungen für die Untersuchung anderer Krankheiten wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Der zielspezifische Bildgebungsansatz ist effektiv für die Untersuchung entzündlicher Darmerkrankungen.
- Diese Methode kann das Verständnis von Krankheitsmechanismen und therapeutischen Wirkungen verbessern.
- Zukünftige Forschung kann deren Anwendung auf andere entzündliche und immunbezogene Krankheiten erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
