Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung
15. Dezember 2017
Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.
Das übergeordnete Ziel dieses zielspezifischen in vivo Bildgebungsansatzes ist es, molekulare Marker für die Krankheitsaktivität bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der entzündlichen Darmerkrankungen und der damit verbundenen therapeutischen Forschung über den Einfluss experimenteller Therapeutika oder spezifischer zellulärer Ereignisse auf Entzündungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Krankheitsaktivität longitudinal und nicht-invasiv überwacht werden kann.
Obwohl diese Methode Einblicke in entzündliche Erkrankungen geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Krankheiten wie Krebs oder immunbedingter Krankheiten angewendet werden. Um eine Kolitis auszulösen, füllen Sie den Trinkvorrat der Versuchsmäuse mit zwei Gramm Dextran-Natriumsulfat oder DSS, gelöst in 100 Millilitern autoklaviertem Trinkwasser, was fünf Millilitern Wasser pro Maus und Tag entspricht. 24 Stunden vor dem Scannen wird der gewünschte Antikörpercocktail in eine sterile, lichtgeschützte Spritze gefüllt und die Antikörper intravenös in die Schwanzvenen der Versuchstiere injiziert.
Rasieren Sie am Tag des Versuchs mit einem Elektrorasierer das Fell in der Bauchregion der Versuchstiere, um die Lichtreflexion und -absorption zu minimieren. Unter Verwendung eines gewebeimitierenden Phantoms mit definierter Dicke und Absorptionseigenschaften wird das Phantom mit einem bestimmten Volumen der interessierenden Antikörperlösung gefüllt und die Fluoreszenz auf der FMT-Vorrichtung gemessen. Klicken Sie dann auf einer veterinärmedizinischen Fluoreszenztomographie oder einem FMT-Gerät für Kleintiere auf Neue Studie und fügen Sie die relevanten Tracer in die Studienbeschreibung ein, einschließlich der Bildgebungsparameter und Dosen.
Erstellen Sie Studiengruppen entsprechend dem Versuchsdesign und statten Sie jede Gruppe mit der entsprechenden Anzahl von Tieren aus. Wenn das System für die Tracer-Konstrukte kalibriert wurde, legen Sie die erste anästhesierte Maus in Rückenlage in eine bei 42 Grad Celsius beheizbare Untersuchungskassette. Setzen Sie die Kassette in das Bildgebungssystem ein und wählen Sie die entsprechende Probe aus der entsprechenden Studiengruppe aus.
Wählen Sie den verabreichten Tracer aus, um sicherzustellen, dass die Werte der Tracerkonzentration korrekt berechnet werden, und erfassen Sie das Fluoreszenzreflexionsbild mit der entsprechenden Wellenlänge für den Scan. Klicken Sie auf Bild erfassen, um das Scanfeld zu umreißen und zu bestätigen, dass das Scanfeld als Überlagerung auf dem Fluoreszenzreflexionsbild angezeigt wird. Passen Sie das Scanfeld so an, dass es den interessierenden Bereich umgibt, und achten Sie darauf, Fehler oder Bereiche mit verbleibendem Fell zu vermeiden.
Wählen Sie je nach Bildziel eine Scanfeldauflösung aus, um die Anzahl der Bilddatenpunkte innerhalb des Scanfelds festzulegen. Klicken Sie dann auf Scannen, um die Bildaufnahme bei der ausgewählten Wellenlänge zu starten. Nehmen Sie das Tier am Ende des Scans aus der Kassette, damit sich das Tier unter Überwachung vollständig erholen kann, bevor es in seinen Käfig zurückkehrt.
Die FMT kann dann zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt werden, je nachdem, was experimentell sinnvoll ist. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, öffnen Sie die entsprechende Bildanalysesoftware und wählen Sie die Rohdaten für den ersten Scan aus. Erstellen Sie mit dem Rekonstruktionswerkzeug 3D-Karten der Fluoreszenzverteilung.
Wenn alle Scans dem entsprechenden Rekonstruktionsdatensatz hinzugefügt wurden, öffnen Sie den ersten Datensatz von Interesse. Es werden alle Scans angezeigt, die für das ausgewählte einzelne Versuchstier durchgeführt wurden. Wählen Sie den entsprechenden Scan aus und klicken Sie auf Laden.
Eine 3D-Rekonstruktion der Tracerverteilung erscheint als Überlagerung des ursprünglich aufgenommenen Fluoreszenzreflexionsbildes. Identifizieren Sie als Nächstes die Herde der unspezifischen Beschriftungsakkumulation auf den rekonstruierten 3D-Karten und verwenden Sie das Messwerkzeug, um den interessierenden Bereich auszuwählen. Die Software generiert dann eine Fluoreszenzintensität für den interessierenden Bereich sowie Messungen der Pikomolarmenge des Tracers, für den der Scan kalibriert wurde.
In diesem Experiment wurde ein fluoreszenzkonjugierter Antikörper gegen murines F4/80 verwendet, um die aktivierten Makrophagen direkt sichtbar zu machen. Eine signifikant erhöhte Akkumulation von fluoreszierendem Tracer wurde mittels Fluoreszenz-vermittelter Tomographie im Dickdarm der kolitischen Mäuse im Vergleich zu den nicht-kolitischen Kontrolltieren gemessen, was auf eine Zunahme der Monozyteninfiltration und Differenzierung in aktive Makrophagen bei den kolitischen Tieren hinweist. Umgekehrt führte die Anwendung eines unspezifischen fluoreszenzkonjugierten IgG-Antikörpers weder in der kolitischen noch in der nicht-kolitischen Kontrollgruppe zu einer nachweisbaren Fluoreszenzreaktion im Abdomen oder Darm, was die Spezifität der Sonden-Ziel-Interaktion des F4/80-Antikörpers zeigt.
Ex-vivo-Messungen der F4/80-gerichteten Tracerakkumulation in explantierten Dickdarmen verifizieren den kolonischen Ursprung der in vivo nachgewiesenen Akkumulation des F4/80-Tracersignals. Tatsächlich korrelieren die berechneten Mengen an gebundenen Antikörpern gut mit der histologisch bestimmten Anzahl infiltrierender Makrophagen, was bestätigt, dass die In-vivo-Bildgebung mit spezifischen Tracern auf eine lokale Krankheitsaktivität hinweisen kann. Einmal gemeistert, kann dies innerhalb weniger Minuten durchgeführt und analysiert werden, wenn es richtig ausgeführt wird.
Die Vorbereitungsschritte, einschließlich der Herstellung spezifischer antikörperbasierter Tracer, dauern in der Regel zwei bis drei Tage. Bei der Planung eines experimentellen Verfahrens wie diesem ist es wichtig, geeignete und zuverlässige Kontrollen einzubeziehen, sowohl für den Antikörper als auch für das Tierseuchenmodell. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Koloskopie oder Durchflusszytometrie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten und die Daten zu validieren und zu quantifizieren.
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Übersicht
Diese Studie stellt einen zielgerichteten Ansatz für die in vivo-Bildgebung vor, um molekulare Marker der Krankheitsaktivität bei entzündlichen Darmerkrankungen sichtbar zu machen. Mithilfe einer quantitativen dreidimensionalen tomographischen Beurteilung konzentriert sich die Forschung auf die Infiltration von intestinalen Makrophagen in einem murinen Kolitis-Modell.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Entzündliche Darmerkrankung
Hintergrund
- Zielspezifische Sonden sind innovative Werkzeuge zur Analyse molekularer Mechanismen.
- Sie können zur Untersuchung der Proteinexpression bei verschiedenen Erkrankungen eingesetzt werden.
- Diese Methode ermöglicht eine longitudinale und nichtinvasive Überwachung der Krankheitsaktivität.
- Sie ist auf entzündliche Erkrankungen, Krebs und immunbedingte Störungen anwendbar.
Zweck der Studie
- Molekulare Marker der Krankheitsaktivität bei entzündlichen Darmerkrankungen sichtbar machen.
- Zentrale Fragen der therapeutischen Forschung im Zusammenhang mit Entzündungen beantworten.
- Den Einfluss experimenteller Therapeutika auf Entzündungen bewerten.
Verwendete Methoden
- Induktion einer Kolitis mittels Dextran-Natriumsulfat (DSS).
- Intravenöse Verabreichung eines Antikörpercocktails an experimentelle Mäuse.
- Fluoreszenzmarkierte Tomographie zur Abbildung der Makrophageninfiltration.
- Langzeitüberwachung der Krankheitsaktivität in vivo.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Infiltration von Darmmakrophagen.
- Nachweis der Fähigkeit, die Krankheitsaktivität nichtinvasiv zu überwachen.
- Gewonnene Erkenntnisse über die Dynamik der Entzündung bei Colitis.
- Potentielle Anwendungen zur Untersuchung anderer Erkrankungen wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Der zielgerichtete Bildgebungsansatz eignet sich gut zur Untersuchung des entzündlichen Darmsyndroms.
- Diese Methode kann das Verständnis der Krankheitsmechanismen und therapeutischen Wirkungen verbessern.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können die Anwendung auf andere entzündliche und immunbedingte Erkrankungen ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die nichtinvasive longitudinale Bildgebung der Makrophageninfiltration ermöglicht die frühe Erkennung entzündlicher Reaktionen in präklinischen Modellen, verringert die Abhängigkeit von terminalen Endpunkten und unterstützt die mechanistische Entwederung entzündungshemmender Therapeutika. Die quantitative 3D-Fluoreszenzmittels Tomographie liefert eine vorhersagbare Sicherheit bezüglich der Zielstrukturenbindung und krankheitsmodifizierenden Wirkungen und unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in Programmen zu entzündlichen Darmerkrankungen und immunvermittelten Erkrankungen. Dieser Ansatz verbessert die translationale Kontinuität, indem in-vivo-Bildgebungsergebnisse mit histopathologischen Validierungen abgeglichen werden, wodurch die Portfolioauswahl und Ressourcenallokation in Entdeckungsprozessen optimiert wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung der Anreicherung F4/80-positiver Makrophagen als funktionellen Parameter für intestinale Entzündung.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch spezifische Wechselwirkungen von Sonden mit ihrem Zielmolekül, belegt durch das Fehlen eines Signals bei unspezifischen IgG-Kontrollen.
- Prädiktiver Wert: Korreliert die in-vivo-Anreicherung des Tracers mit der ex-vivo-Antikörperbindung und den histologischen Makrophagenzahlen, wodurch die Zuverlässigkeit des Targets für die Bildschirmung von Immunmodulatoren gestärkt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative 3D-Fluoreszenzdarstellungen und Messungen von Tracern im Pikomolarbereich und ermöglicht so reproduzierbare Substanzscreener in Kolitis-Modellen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die longitudinale Überwachung über verschiedene Zeitpunkte hinweg, reduziert den Tierversuchseinsatz und erhöht die statistische Aussagekraft in Studien zur therapeutischen Wirksamkeit.
- Plattformwiederverwendung: Kompatibel mit nachgeschalteten Validierungen mittels Koloskopie oder Durchflusszytometrie und unterstützt integrierte Arbeitsabläufe für die Zielstrukturvalidierung sowie die Abstimmung von Biomarkern.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert intestinale Entzündungen mittels DSS-induzierter Kolitis, einem weit verbreiteten System zur Untersuchung der Pathogenese von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und der therapeutischen Wirkungsweise.
- Translationale Kontinuität: Verbindet nicht-invasive Bildgebung mit histologischen Endpunkten und ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf übereinstimmenden in-vivo- und ex-vivo-Daten.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verfolgt die Infiltration von Monozyten und die Dynamik der Differenzierung von Makrophagen und liefert Einblicke in die zellulären Wirkmechanismen experimenteller Therapeutika.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die fluoreszenzbasierte Tomographie fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Identifizierung von Wirkstoffen bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere für immunmodulierende Substanzen bei entzündlichen Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung der Makrophageninfiltration als pharmakodynamische Messgröße der Signalwegmodulation in Kolitis-Modellen.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Ergebnisse (Fluoreszenzintensität, Tracerkonzentration), die den Vergleich zwischen Behandlungsgruppen und Zeitpunkten ermöglichen.
- Analytik: Stellt rekonstruierbare 3D-Datensätze und Messungen im interessierenden Bereich bereit, die die statistische Analyse der Behandlungseffekte auf die Lokalisation von Immunzellen erleichtern.
- Translationale Forschung: Verbindet In-vivo-Bildgebung mit Ex-vivo-Validierung und stärkt so die Biomarkerabstimmung sowie die präklinische Kohärenz für IBD-gerichtete Wirkstoffkandidaten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Bildgebungsmethode dar, die über die intestinale Entzündung hinaus in der Verfolgung von Immunzellen, Stammzellstudien und Onkologie-Modellen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten durch spezifische, quantifizierbare Abbildung der Makrophagenaktivität verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch kalibrierte Tracer-Quantifizierung und longitudinales, individueninterne Monitoring.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalwirtschaftlichkeit, indem frühzeitige Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage der nichtinvasiven Überwachung der Krankheitsaktivität ermöglicht werden und damit das biologische Risiko in späteren Entwicklungsstadien reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch übereinstimmende bildgebende und histologische Daten und schärft so die Kriterien für die Weiterentwicklung in Immunmodulator-Pipelines.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenzbildgebung, der Herstellung von Tracern sowie im Umgang mit kleinen Tieren für intravenöse Injektionen und Anästhesieprotokolle.
- Setzt den Zugang zu einem Fluoreszenz-Tomographiesystem für Kleintiere mit geeigneter Wellenlängenwahl und Rekonstruktionssoftware voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Bildgebungsprotokolle, der Tracer-Dosierung und der Analyse von interessierenden Regionen, um eine konsistente Dateninterpretation zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Modellsysteme, einschließlich der Enthaarung und der Optimierung der Bauchbildgebung, um Signalstörungen zu minimieren.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die 2–3-tägige Vorbereitungszeit für Tracer sowie die Notwendigkeit geeigneter Isotyp- und Krankheitskontrollen, um die Spezifität sicherzustellen.
