Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Fluoreszenzbilder der Expression von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren in einem orthotopen Gliom-Mausmodell zu erstellen. Dies wird erreicht, indem die linke Gehirnhälfte einer A-IIC-Maus mit grün fluoreszierendem Protein beimpft wird, das humane U2 51-Gliomzellen exprimiert. Nachdem der Tumor zwei Wochen lang gewachsen ist, wird der Maus ein Cocktail aus zwei fluoreszierenden Tracern injiziert.

Die Maus wird dann auf einem Röntgensystem für kleine Tiere abgebildet, um anatomische Daten zu sammeln, die für eine genaue Bildrekonstruktion erforderlich sind. Die Daten werden verwendet, um die Quelle anatomisch zu positionieren und die Positionen des optischen Tomographiesystems zu erkennen, und eine kundenspezifische Software wird verwendet, um die Fluoreszenzdaten zu sammeln und das endgültige Bild zu erstellen. Letztendlich kann mit dieser Methode ein Bild eines Tumors auf der Grundlage seiner Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktors sowohl unter Verwendung von Fluoreszenz- als auch von Röntgenbildgebung erstellt werden, dessen Genauigkeit mit der kontrastverstärkten Magnetresonanztomographie verglichen werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ladungskopplungs-basierten Fluoreszenztomographie für Kleintiere besteht darin, dass die Einzelphotonenzählung mit Photomultiplierröhren eine viel höhere Empfindlichkeit und einen höheren Dynamikbereich für die Lichtdetektion bietet. Diese Methode kann letztendlich verwendet werden, um den Erfolg molekularer Therapien zu überwachen, indem die Expression ihrer Ziele gemessen wird. Während subkutane Tumoren mit nicht-tomographischen Methoden unter Verwendung von Oberflächenbildgebung leicht abgebildet werden können. Dieses System ist für die Abbildung von Gewebe mit einer Dicke von bis zu mehreren Zentimetern ausgelegt und eignet sich daher besonders gut für die Bildgebung, den Kontrast, die Verabreichung von Wirkstoffen und das Austreten in Hirntumoren.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Expression von Krebs-Biomarkern geben kann, kann sie auch auf andere Studien zu Krankheiten wie Infektionen, Fettleibigkeit oder Alterungselementen wie Alzheimer angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der diffusen Natur der Lichtausbreitung in biologischem Gewebe und der Schwierigkeit, die Röntgentomographie für die Rekonstruktion des diffusen Lichts zu verwenden, Schwierigkeiten haben. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Da die Schritte der Datenerfassung und Bildrekonstruktion schwer zu erlernen sein können, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die vom Fluoreszenzsystem gesammelten Daten gut kalibriert sind. Das nahezu schnelle Softwarepaket wurde entwickelt, um optische Daten einzulesen und aus den Röntgentomographie-Bildern ein Finite-Elemente-Netz zu erstellen, das als räumliche Vorlage für die Fluoreszenzrekonstruktion verwendet wird. Legen Sie zunächst eine anästhesierte athyme Nacktmaus auf ein steriles OP-Tuch und bestätigen Sie die Narkosetiefe, bevor Sie mit der Reinigung und Desinfektion der Haut über dem Schnittbereich fortfahren.

Legen Sie mit Betadine ein steriles OP-Tuch mit einem Skalpell über die Inzisionsstelle, machen Sie einen kleinen Schnitt etwas links von der Mittellinie und 0,5 Zentimeter hinter der Intraokularlinie. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels, indem Sie jegliches Bindegewebe entfernen, damit Orientierungspunkte identifiziert werden können. Sobald der Schädel freigelegt ist, verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem sterilen Ein-Millimeter-Bohrer, um ein Loch zu bohren, das zwei Millimeter links von der Mittellinie und zwei Millimeter hinter dem bgma liegt.

Laden Sie eine Hamilton Micros Spritze mit einer stumpfen 27-Gauge-Nadel mit den zu implantierenden Zellen. Platzieren Sie als Nächstes die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen. Bestätigen Sie dann eine tiefe chirurgische und ästhetische Ebene mit einer Zehenklemme und ersetzen Sie das chirurgische Tuch auf dem Tier.

Befestigen Sie anschließend die geladene Spritze auf dem stereotaktischen Rahmen. Positionieren Sie die Spritze über dem Loch im Schädel und führen Sie die Spitze der Nadel drei Millimeter unterhalb der Schädeloberfläche ein. Ziehen Sie dann die Nadel einen Millimeter zurück, um eine Tasche zu erstellen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen über einen Zeitraum von fünf Minuten langsam in die linke Gehirnhälfte zu injizieren. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel zurück und tupfen Sie das Loch mit Betadine ab. Um zu verhindern, dass Zellen außerhalb der Injektionsstelle wachsen, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und füllen Sie das freiliegende Loch mit vorwarmem Knochenwachs.

Zum Schluss verschließen Sie die Inzisionsstelle mit sterilem Fünf-Oh-Nylon-Nahtmaterial. Setzen Sie die Maus wieder in einen beheizten Käfig und überwachen Sie sie, bis sie sich nach der Genesung erholt hat, injizieren Sie der Maus 130 Mikroliter 0,1 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin IP und lassen Sie den Tumor 14 Tage lang wachsen, bevor die Bildgebung beginnt. Starten Sie am Tag der Mausbildgebung das System, damit sich die Laser und Lichtdetektoren etwa 20 Minuten lang erwärmen können.

Um Drifts und Systemempfindlichkeit zu vermeiden, platzieren Sie einen 100 Grad mal vier Grad großen Liniendiffusor in der direkten Mitte der Bildgebungsgantry, um die Anregungslaser mit gleicher Intensität auf die Detektionskanäle des Systems zu verteilen. Stellen Sie den Winkel des Diffusors von Hand ein, um die von allen fünf Lichtsammelkanälen erfasste Signalmenge zu maximieren. Als nächstes kommt die optische Dichte.

Zwei Neutraldichtefilter vor allen Fluoreszenzdetektions-Photomultiplier-Röhren, die als PMTs und optische Dichte bezeichnet werden. Ein Neutraldichtefilter vor der Transmissionserkennung. PMTs erfassen 100 zeitliche Pulsausbreitungsfunktionen oder T psfs des Lasers mit einer Integrationszeit von jeweils einer Sekunde für jeden Laser nacheinander, normalisieren jede TPSF anhand der Laserreferenz, korrigieren die zeitliche Drift in der Laserreferenz und mitteln über alle Iterationen für jeden Detektor und jeden Laser separat.

Diese durchschnittlichen TPS sind die detektorspezifischen Instrumentenreaktionsfunktionen, die bei der optischen Bildrekonstruktion 12 Stunden vor dem Bildgebungsverfahren verwendet werden. Injizieren Sie der Testmaus einen Cocktail aus fluoreszierenden Tracern. Die genaue Kalibrierung des Fluoreszenztomographie-Systems und die Einschränkung der Bewegung der Tiere sind die schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens.

Die Rekonstruktion der Bilder ist so schlecht gestellt, dass schon kleine Fehler bei der Datenerfassung zu erheblichen Fehlern im rekonstruierten Bild führen können. Um sicherzustellen, dass genaue Daten gesammelt werden, legen wir die Maus so gut wie möglich still und wiederholen die Kalibrierung vor und nach dem Scannen, um die Chance auf eine genaue Kalibrierung zu verbessern. Legen Sie das anästhesierte Tier auf die Glasfaserstützen des Bildgebungsbettes.

Nachdem Sie den Kopf für die kontinuierliche Gasanästhesie in den Nasenkonus positioniert haben, befestigen Sie die Zähne auf der Beißstange und kleben Sie das Tier fest. Die Maus sollte ungefähr in der Mitte der Bildgebungsgantry platziert werden. Diese Positionierung kann durch Drehen des Anregungslasers um 180 Grad um die Maus gesteuert werden, wodurch sichergestellt wird, dass der Brennpunkt des Lasers einen Punkt ungefähr in der Mitte der Maus aus der Perspektive des Lasers aus allen Winkeln beleuchtet.

Sobald Sie richtig positioniert sind, übertragen Sie das Bildgebungsbett und die Maus vorsichtig auf den Mikro-CT-Scanner und sammeln Sie anatomische Informationen mit einer Auflösung von 93 Mikrometern isotrop für den gesamten Kopf der Maus. Visualisieren Sie den CT-Bildstapel und wählen Sie die Schichten aus, die mit dem Fluoreszenztomographie-System abgebildet werden sollen. Übertragen Sie das Bildgebungsbett und die Maus vorsichtig zurück in das Fluoreszenztomographie-System.

Wählen Sie die Anzahl der Quellpositionen für jeden Imaging-Slice, die Integrationszeit für jede TPSF-Messung, die Anzahl der Iterationen für jede Quellposition sowie die Position und Anzahl der gewünschten Imaging-Slices aus dem zuvor erstellten CT-Image-Stack aus. Platzieren Sie als Nächstes Filter vor den Fluoreszenzdetektions-PMTs, um das gesamte Anregungslicht und die optische Dichte auf Neutraldichtefilter vor den Transmissionsdetektions-PMTs zu blockieren. Um eine Sättigung dieser Detektoren zu vermeiden, führen Sie die Datenerfassungssoftware aus, die Fluoreszenz- und Transmissionskanäle t psfs an jeder definierten Position des Quelldetektors bei beiden Anregungswellenlängen erfasst.

Überwachen und zeichnen Sie für jeden gesammelten Satz von T-PSFS die Laserintensität mit einem Referenz-PMT-Kanal auf. Bestimmen Sie die äußere Oberfläche der Maus und die Position des Bildgebungsbetts. Stützen Sie Stäbe aus den CT-Bildern und erstellen Sie Masken, die die Grenzen der Maus und des Bildstabs abdecken.

Verwenden Sie separat die Mausmaske, um mit der nahezu schnellen Software ein Finite-Elemente-Netz des Tieres zu erstellen. Lokalisieren Sie die Positionen der Quelle und des Detektors aus dem Fluoreszenztomographie-System auf der Oberfläche des Netzes auf der Grundlage von Mikro-CT- und Fluoreszenz-Raumregistrierungskoordinaten. Entfernen Sie optische Datenpunkte, die mit Quellen- oder Detektorpositionen verknüpft sind und mit der Position des Bildgebungsbetts interagieren.

Stützstäbe normalisieren die Daten, die an jeder Position des Detektors an der Quelle durch die Laserreferenz gesammelt wurden, korrigieren die zeitliche Drift in der Laserreferenz und korrigieren die Filterempfindlichkeiten, die zum Zeitpunkt des Kaufs durch experimentelle Tests bestimmt wurden. Nehmen Sie das born-Verhältnis der Daten für jede Position des Detektors der Quelle und multiplizieren Sie es mit einer Vorwärtsmodellsimulation des Transmissionsgrads, die auf dem Finite-Elemente-Tiernetz basiert, um einheitliche optische Eigenschaften zu erzielen. Dies geschieht, um Fehler im Zusammenhang mit der Kopplung von Quell- oder Detektorgewebe zu mildern, die Daten auf das Modell zu kalibrieren und die Daten für andere Aspekte der Modelldaten-Mismatch anzupassen. Konstruieren Sie einen Datenvektor, der aus der skalierten Differenz der bei beiden Wellenlängen gesammelten Daten des Born-Verhältnisses besteht.

Der Skalierungsfaktor wird gewählt, um den EGFR-Bindungskontrast zu maximieren, eine Bildrekonstruktion im Zeitbereich mit den kalibrierten Differenzdaten unter Verwendung der TPSF für jeden Detektionskanal als Eingabe durchzuführen und Fluoreszenzkarten des kontrastverstärkten Zieltracers zu erstellen. Hier ist ein Beispiel für eine Fluoreszenzrekonstruktion, die mit einem co-registrierten anatomischen CT-Bild einer Maus mit einem orthotopen Gliomtumor U2 51 überlagert ist. Der durch die Fluoreszenzrekonstruktion bestimmte Schwerpunkt des Glioms lag innerhalb eines Millimeters vom Massenschwerpunkt des Tumors, bestimmt durch kontrastmittelverstärkte Magnetresonanztomographie

Die Software für die Datenerfassung wurde speziell für dieses Gerät entwickelt, aber die meisten Bildverarbeitungstechniken können mit der Near-Fasts-Software available@nearfasts.org durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es daher wichtig, sicherzustellen, dass sowohl das System als auch die Daten vor der Bildrekonstruktion genau kalibriert sind. Diese Kalibrierung erfordert, dass die Empfindlichkeit und die zeitlichen Unterschiede zwischen den Detektoren berücksichtigt werden. Nach der Bildrekonstruktion eines Biomarkers wurde ein zielgerichteter Tracer verwendet.

Eine ähnliche Bildgebung eines ungezielten Tracers bietet ein Mittel zur Korrektur einer nicht rezeptorvermittelten Aufnahme. Dies ermöglicht es, die Menge der Tracerbindung sowie die in vivo Rezeptordichte nach seiner Entwicklung zu quantifizieren. Diese Technik inspirierte andere Forscher zur Entwicklung von Röntgenbildgebungs-gesteuerten Fluoreszenztomographie-Systemen und ebnete den Weg für die Ganzkörperbildgebung größerer Tiere.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein diffuses Fluoreszenztomographie-Experiment durchführt, das anatomische Röntgenbildgebung und optische Bildgebungssysteme für die Bildgebung von Krebsbiomarkern kombiniert.