Dreidimensionale Quantifizierung von Darmschleim mittels Whole-Mount Tissue Imaging

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Mechanismen der mikrobiellen Injektion in Schleimhautgewebe und betont die entscheidende Rolle des Schleims bei der Modulation dieser Wechselwirkungen. Die traditionelle 2D-Schleimquantifizierung übersieht räumliche und volumetrische Details. Unser Protokoll ermöglicht eine genaue 3D-Analyse und zeigt strukturelle und verteilungsbedingte Veränderungen durch molekulare Eingriffe auf, die in bestehenden Methoden übersehen werden.

Dieses Protokoll kombiniert Hormonbildgebung mit 3D-Quantifizierung und liefert robuste, reproduzierbare Messungen der Darmschleimarchitektur, die auf verschiedene experimentelle Bedingungen und molekulare Interventionen anwendbar sind und die konventionelle 2D-Bewertung übertreffen. Zu Beginn legen Sie eine betäubte sechs bis acht Wochen alte Maus auf ein Wärmepad, um ihre Körpertemperatur zu halten. Desinfizieren Sie die Hautoberfläche der Maus mit Alkohol und machen Sie einen Schnitt im linken Unterbauch, um das Äxenum freizulegen und dabei die Anästhesie aufrechtzuerhalten.

Identifizieren Sie nun das Ileum oder den proximalen Dickdarm. Lege die Darmschleife auf sterile Mullbinde. Spülen Sie mit sterilem PBS und sichern Sie beide Enden mit arteriellen Klemmen, um einen drei Zentimeter langen geschlossenen Kreislauf zu schaffen.

Unter Narkose wird nicht mehr als 200 Mikroliter steriles PBS oder Carbamoylcholinchlorid-Reagenz in den ligatierten Darmkreislauf injiziert. Nach 30 Minuten Behandlung entnehmen Sie die Darmschleife vom eingeschläferten Tier. Mit einer Pinzette halten Sie die Darmschleife fest und spülen Sie sie vorsichtig mit sterilem PBS ab.

Schneide die Darmschleife längs auf, mit einem kleinen unbeschnittenen Teil, und spüle das Gewebe erneut mit sterilem PBS aus. Glätten Sie das Gewebe in einer sechs Zentimeter großen Schale und schneiden Sie den restlichen Teil auf. Verwenden Sie Kupferdrahtsegmente, um es an der Agarosebasis zu verankern.

Gib nun 10 Milliliter 4%-Paraformaldehydlösung in die Schale, um das Gewebe für 12 bis 24 Stunden zu fixieren. Nach der Inkubation werden die Paraformaldehydlösung entfernt und das Gewebe mindestens dreimal mit PBS gewaschen, um eventuelle Reste von Paraformaldehyd zu entfernen. Als Nächstes tauchen Sie das Gewebe in 10 Milliliter Blockpuffer, bestehend aus PBS, ergänzt mit 0,4 % Triton X-100 und 3 % BSA, und bei vier Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden gelagert.

Entferne den Blockpuffer. Färben Sie das Gewebe mit einer Farblösung, die Weizenkeim, Agglutinin und Phalloidin enthält. In PBS-behandelten Dünndarm- und Darmgeweben war WGA-positiver Schleim überwiegend in Becherzellen an der Epitheloberfläche lokalisiert.

Nach der Behandlung mit Carbamoylcholinchlorid nahm die Menge des WGA-positiven Schleims im Darmlumen sowohl im Dünndarm als auch im Dickdarm deutlich zu, aber der Schleim verteilte sich sporadisch statt eine durchgehende Schicht zu bilden. Das Volumen des becherzellassoziierten WGA-positiven Schleims wurde nach der Carbamoylcholinchloridbehandlung sowohl im Dünndarm als auch im Dickdarm signifikant reduziert, was auf aktive Sekretion hinweist. Alle Becherzellschleimvolumen in PBS-behandelten Geweben lagen unter 1.000 Kubikmikrometern.

WGA-positive Objekte mit einer Menge von mehr als 1.000 Kubikmikrometern wurden als sekretierter Schleim im Lumen klassifiziert. Die Behandlung mit Carbamoylcholinchlorid erhöhte das Gesamtvolumen des ausgeschiedenen Schleims sowohl im Dünndarm als auch im Darm um etwa das Fünf- bis Zwanzigfache.