Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

Die fluorescence-mediated Tomographie ist eine hochsensible Bildgebungstechnik zur quantitativen Beurteilung der Fluoreszenzverteilung. Bei anästhesierten Mäusen sind zahlreiche gezielte fluoreszierende Sonden verfügbar, die die Bildgebung von Angiogenese, Apoptose, Entzündungen und anderen Prozessen ermöglichen. In diesem Film zeigen wir, wie die hybride Bildgebung mit FMT und Micro City an unserem Institut durchgeführt wird.

Im ersten Kapitel werden die Geräte vorgestellt; F-M-T-F-M-T steht für Fluoreszenz-Molekular-Tomographie. Tomographie bedeutet, dass 3D-Bilder erzeugt werden. Die FMT ist hochempfindlich für die Abbildung naher inater Fluoreszenz bei Mäusen.

Jetzt ist die Frontplatte geöffnet, um das Innere des FMT zu zeigen. Unten befindet sich ein Laser, der auf einem 2D-Servomotor montiert ist. Der Laser sendet Licht in die Maus, die in einem teilweise durchsichtigen Mausbett gehalten wird.

Oberhalb des Mausbetts befindet sich ein Array von LEDs als alternative Lichtquelle, wodurch die FMT als herkömmliches Reflexionsabbildungsgerät arbeiten kann. Das Filterrad ist unterhalb des Objektivs montiert, das das Licht für den Detektor an der Oberseite des Geräts einfängt. Dies ist unser Mikro-CT.

Das Mikro-CT ist mit zwei Röntgenröhren und zwei Flachdetektoren ausgestattet, die die Aufnahme von Dual-Energy-Scans ermöglichen. Kapitel zwei, Mikro-CT-FMT-Scannenprotokoll. Sowohl FMT als auch Mikro-CT sind dafür konzipiert, Mäuse abzubilden; vor der Bildgebung werden die Mäuse mit Isofluran anästhesiert.

Für das FMT-Scannen muss das Haar der Maus entfernt werden, was gut mit der Hering-Creme funktioniert. Einige Mausstämme können durch die Enthaarungscreme Hautausschläge entwickeln. Daher wird empfohlen, die Tiere auf Hautveränderungen zu überwachen und bei Bedarf den tierärztlichen Dienst für die Versorgung hinzuzuziehen.

Testen Sie außerdem zunächst die Verträglichkeit an einer kleinen Charge neuer Mäusestämme. Um einer Hypothermie vorzubeugen, wird die Maus auf eine Heizplatte gelegt. Zur Injektion des Kontrastmittels wird aufgrund der geringen Größe ein Katheter in die Schwanzvene eingelegt.

Dies ist ziemlich schwierig und erfordert etwas Erfahrung. Wenn Blut in den Katheter zurückfließt, ist er korrekt durch den Katheter platziert. Fluoreszierende Kontrastmittel und CT-Kontrastmittel können injiziert werden, um eine Volumenüberlastung zu vermeiden.

Höchstens fünf Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht sollten injiziert werden, was 150 Mikroliter für eine 30 Gramm schwere Maus entspricht. Für die Aufnahme wird die Maus in ein multimodales Maus-Bett platziert.

Möglicherweise sind einige Symbole zur Kennung auf den Schwanz der Maus aufgezeichnet. Es ist wichtig, solche Markierungen am Rumpf zu vermeiden, da sie die optische Abtastung beeinträchtigen könnten. Die Tierliege wird geschlossen und die Tiefe angepasst, um die Maus fest in einer definierten Position zu halten.

Seien Sie vorsichtig und überwachen Sie die Atmung, da das zu starke Festzurren des Betts die Maus ersticken kann. Nacktmäuse werden häufig in der onkologischen Forschung verwendet, da sie eine Immunsuppression aufweisen. Die Tatsache, dass sie nackt sind, ist eine glückliche Nebenwirkung der genetischen Mutation.

Daher kann der zeitaufwändige Haarentfernungsprozess entfallen. Es sollte überprüft werden, ob die Maus ordnungsgemäß atmet, und gegebenenfalls sollte die Tierunterlage entsprechend angepasst werden. Anschließend wird die Tierunterlage in den Mikro-CT eingelegt.

Die Rohre, die das ISO-Fluorgas transportieren, werden umgeschaltet, um den Gasfluss innerhalb des Geräts aufrechtzuerhalten. Anschließend wird das Mikro-C geschlossen, um die Röntgenabschirmung zu ermöglichen. Das Mikro-C beginnt erst mit der Abtastung, wenn der Deckel geschlossen ist.

Mithilfe der Tasten am Mikro-CT kann die Maus in den Mikro-CT geschoben werden. Am Steuerungscomputer des Mikro-CT wird ein Topogramm aufgenommen und angezeigt; die Fensterungseinstellungen werden angepasst, um die Maus besser erkennen zu können. Ein oder mehrere ZUP-Scans können platziert werden. Ihre Position wird durch die hellblauen Bereiche angezeigt.

Normalerweise sind ein bis drei ZUP-Scans ausreichend. Nach dem Start des Scans wird der Fortschritt mit dunkelblauen Fortschrittsbalken angezeigt. Unser Flachdetektor-Mikro-CT führt die ZUP-Scans nacheinander durch, was sich von einem klinischen Spiral-CT unterscheidet.

Mithilfe der Tasten wird die Mausbett vorne positioniert. Erneut wird der Abschirmdeckel geöffnet und die Anästhesieschläuche umgeschaltet. Der Halter wird vorsichtig vom Mausbett entfernt und der Anästhesieschlauch herausgezogen.

Das ist notwendig, weil das AN und das FMT nicht von diesem kleinen Schlauch abhängen. Stattdessen wird die kleine Kammer im Inneren des FMT mit Anästhetikum-Gas geflutet. Nun wird das Mäusebett mit der Maus über das FMT gebracht und am FMT-Steuerungscomputer eingefügt.

Das Abtast-Sichtfeld wird ebenso wie die Abtastdichte angepasst. Üblicherweise werden etwa 120 Punkte verwendet. Der Scan beginnt nach dem Drücken einer Taste.

Der erste Durchlauf der FMT erfasst ein Durchlicht- oder Anregungsbild für jeden Laserquellenpunkt. In diesem Film wird er im Schnellvorlauf gezeigt. Normalerweise dauert es etwa fünf Minuten.

Sie können sehen, dass im Vergleich zum unteren Körper deutlich weniger Licht durch den oberen Körper hindurchtritt. Dies liegt daran, dass Organe mit einem höheren relativen Blutvolumen, wie Herz, Leber und Nieren, hauptsächlich im oberen Körperbereich liegen. Blut ist der Hauptabsorber für nahinfrarotes Licht.

Die zweiten Durchläufe derselben Quellpunkte erfolgen mit einem anderen Filter, der nur das fluoreszierende Licht passieren lässt, Kapitel drei, interaktives Öl und Segmentierung. Um die Daten beider Geräte zu fusionieren, werden Marker verwendet, die in die Mausbett eingebaut sind.

Die Marker sind ebenfalls in einem Reflexionsbild sichtbar, das mit dem FMT aufgenommen wurde. Die Marker sind eigentlich einfache Löcher und müssen nicht mit einem Fluoreszenz- oder CT-Kontrastmittel gefüllt werden. An unserem Institut haben wir ein Softwareprogramm entwickelt, das die Markererkennung und -fusion automatisch durchführt.

Die Form der Maus sowie heterogene Absorptions- und Streukarten werden automatisch unter Verwendung der Mikro-CT-Daten geschätzt, wie in unserer kürzlich erschienenen Veröffentlichung in Theranostics beschrieben. Diese Parameter sind wichtig für die quantitative Fluoreszenzrekonstruktion. Zur Messung der Biodistribution der Fluoreszenz ist eine Organsegmentierung erforderlich.

Wir erzeugen eine solche Segmentierung interaktiv mithilfe einer Software namens imulitic preclinical, die an unserem Institut entwickelt wurde, wie im Folgenden beschrieben. Eine solche Segmentierung wird im Schnellvorlauf gezeigt, und eine erfahrene Person kann sie in etwa 10 bis 20 Minuten durchführen. Zunächst wird der CT-Datensatz geladen.

Es kann mithilfe einer ISO-Flächen-Darstellung in 3D untersucht werden. Durch Anpassen der Fensterungseinstellungen kann der ISO-Wert geändert werden. Um beispielsweise die Knochen des gesamten Mauskörpers zusammen mit der Mausebettung zu visualisieren, wird die Überlagerung geladen.

Das Signal für dieses Beispiel erscheint in der Harnblase. Nun wird die Überlagerungsvisualisierung deaktiviert, um sich auf die anatomische Segmentierung zu konzentrieren.

Bei nativen Mikro-CT-Scans ist die Lunge aufgrund des starken negativen Kontrasts zu anderen Weichteilen leicht zu erkennen. Die große Struktur innerhalb der Lunge ist das Herz. Beginnen wir damit, die Lunge zu segmentieren.

Alle Voxel unterhalb eines bestimmten Werts werden mithilfe einer Schwellwertbestimmung segmentiert. Dies erscheint grün. Die Lunge ist ein zusammenhängender Bereich, der durch eine Fülloperation getrennt werden kann.

Ähnlich wie der Farbeimer in einem Zeichenprogramm kann die Trennung von der Lunge durch Ausschneiden und Auffüllen erfolgen. Konvexe Organe wie die Harnblase können segmentiert werden, indem Gekritzel gezeichnet wird, um die Grenzen des Organs abzugrenzen.

Weitere Striche werden hinzugefügt, bis eine ausreichende Genauigkeit erreicht ist. Nicht konvexe Organe wie der Darm können Stück für Stück segmentiert werden. Die Leber erscheint als homogene Region und weist eine komplexere Struktur auf.

Da es aus mehreren Lappen besteht, kann die Segmentierung auf der Festplatte gespeichert und in das Programm geladen werden. Mithilfe einer solchen Segmentierung können die fluoreszierenden Signale den Organen zugeordnet werden. Das Programm berechnet diese Mengen und speichert sie als zusätzliches Blatt. Bei Längsschnittaufnahmen muss die Segmentierung für jeden Zeitpunkt erneut durchgeführt werden, da die Intervalle in der Regel zu lang sind, um die Maus in einer festen Position narkotisiert zu halten.

Daher ist die Segmentierung eine zeitaufwändige Aufgabe, wenn viele Mäuse und viele Zeitpunkte beteiligt sind. Um die Ergebnisse zu quantifizieren, laden Sie eine Überlagerung und eine Segmentierung. Klicken Sie auf Batch-Einstellungen festlegen, damit das Programm die aktuellen Einstellungen speichert.

Klicken Sie nun auf „Batch-Statistik“, damit das Programm die Werte für alle Bereiche in allen Mikro-CT-FMT-Scans berechnet. Dies dauert einige Sekunden. Anschließend werden die Statistiken in einer Tabellenkalkulationsdatei gespeichert.

Dies ist praktisch, da der Benutzer nicht selbst Dutzende von Dateien zusammenführen muss. Anhand dieser Datei können die Organ-Kurven berechnet werden. Kapitel vier, repräsentative Ergebnisse.

Um zu überprüfen, ob die Fusion ordnungsgemäß funktioniert, verwendeten wir einen AROS-Phantom. Zur Streuung wurde etwas Titandioxidpulver hinzugefügt. Um eine unregelmäßige Form zu erzielen, wurden einige Teile abgeschnitten.

Mehrere kleine Einschlüsse, die mit Fluoreszenz- und CT-Kontrastmittel gefüllt waren, wurden in den Phantom eingebaut. Da die FMT die tatsächliche Form des Objekts nicht kennt und von einer vereinfachten Form ausgeht, ist die Rekonstruktion bei Objekten mit unregelmäßigen Formen ungenau. Daher haben wir eine weitere Rekonstruktion implementiert, die die aus den Mikro-CT-Daten abgeleitete Form verwendet.

Wie Sie sehen können, ist die Signallokalisation im Phantom deutlich besser. Um die In-vivo-Daten zu untersuchen, gehen wir die Bildgebungszeitpunkte durch. Dies ist die Voraufnahme.

Was wir sehen, ist im Wesentlichen nur Rauschen und Artefakte. Wenn wir zum nächsten Zeitpunkt, dem nach der Injektion, wechseln, erkennen wir viel mehr Signal, aber die Fensterungseinstellungen sind viel zu hart. Mithilfe des Fensterungsdialogfelds können Sie die Fensterungseinstellungen anpassen.

Wir sehen das meiste Signal in der Blase. Wenn wir zur nächsten Zeit, 0,2 Stunden nach der Injektion, übergehen, erkennen wir ein Signal außerhalb der Maus. Dies liegt daran, dass die Maus die Fluoreszenz auf das Mausbett ausgeschieden hat.

Durch weitere Anpassung der Fensterung können wir nun ein Signal an der Wirbelsäule und an den Knien erkennen. Gehen wir nun zur Zeit 0,4 Stunden nach der Injektion: Das Signal aus dem Urin ist nun verschwunden, und wir sehen Fluoreszenz an der Wirbelsäule und an den Knien für die folgenden Zeitpunkte sechs Stunden und 24 Stunden nach der Injektion. Das Gleiche beobachten wir.

Kommen wir nun zur nächsten Nase. Die Vorscan-Aufnahme zeigt bei diesen Fenstereinstellungen nichts. Die Aufnahme 15 Minuten nach der Injektion zeigt ein starkes Signal in der Harnblase und so weiter.

In dieser Studie fanden wir hohe Konzentrationen in der Harnblase kurz nach der Injektion, als Folge der schnellen renal exkretion dieses Probes. Außerdem steigt das Signal in der Wirbelsäule schnell an und bleibt während der späteren Bildgebungszeitpunkte relativ stabil. Kapitel fünf, Schlussfolgerung.

Zusammenfassend zeigen wir ein multimodales Bildgebungsprotokoll, das die Stärken der Fluoreszenz-, Molekulartomographie und Mikrocomputertomographie kombiniert. Die anatomischen Mikro-CT-Daten ermöglichen eine verbesserte Fluoreszenzrekonstruktion durch Nutzung der Mausform. Darüber hinaus eignen sie sich zur Erzeugung von Organsegmentierungen, die erforderlich sind, um quantitative Messungen aus den Bilddaten zu extrahieren.