Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das Herz einer Maus chemisch zu reinigen, mit einer induzierten Herzrhythmusstörung für eine Ganzorganvisualisierung des leukozytären kardialen Infiltrats mittels Fluoreszenzlichtblattmikroskopie. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Ganzorganforschung zu Prothesen und Strukturen auf zellulärer Auflösungsebene zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl die Quantifizierung als auch die Lokalisierung von Entzündungen in ganzen Organen ermöglicht.

Detaillierte Einblicke in neurologische Prothesen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir dringend ein Visualisierungstool benötigten, um zelluläre Erklärungen für Herzrhythmusstörungen im Depletion-Modul zu identifizieren. Nach der Exposition des Herzens von einer acht bis 10 Wochen alten Maus verwenden Sie einen 21-Gauge-Katheter und dringen Sie in den rechten Ventrikel ein.

Inzinzieren Sie die Aorta, um eine Blutdrainage zu ermöglichen, und perfundieren Sie dann mit fünf Millilitern PBS plus EDTA bei langsamem, konstantem Druck. Befolgen Sie die PBS EDTA mit fünf Millilitern 4%Paraformaldehyd. Fassen Sie am Ende der Perfusion mit einer gezackten Pinzette sanft das fixierte Herz und ziehen Sie das Organ leicht nach oben, um alle Gewebeverbindungen zu durchtrennen.

Einschließlich der ein- und ausgehenden Arterien und Venen. Lagern Sie das Herz dann vier Stunden lang in frischem 4%igem PFA zur weiteren Fixierung. Um das Gewebe zu dehydrieren, inkubieren Sie das Herz in einer aufsteigenden Ethanolreihe, in schwarzen Fünf-Milliliter-Polypropylen-Reaktionsröhrchen im Dunkeln, mit ständiger langsamer Drehung auf einem Röhrchenrotator, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.

Reinigen Sie dann das Gewebe mit einer 98%igen Dibenzylether-Inkubation mit konstanter Rotation über Nacht. Um die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen, legen Sie zuerst dehydrierte Agaroseblöcke in den Standard-Probenhalter, um die Probe an Ort und Stelle zu halten. Übertragen Sie dann die Probe auf den Probenhalter.

Übertragen Sie anschließend den Probenhalter in eine mit Dibenzylether gefüllte Küvette geeigneter Größe. Verwenden Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltereinstellungen, um die interessierenden Fluoreszenzsignale zu erfassen. Daher ist die korrekte Positionierung und Fixierung der Probe von grundlegender Bedeutung, um Abschattungseffekte während der Bildgebung zu minimieren.

Darüber hinaus kann eine lose Probe bewegliche Artefakte verursachen, die während der Nachbearbeitung schwer zu beleuchten sind. Nachdem Sie alle Bilder angefordert haben, öffnen Sie die entsprechende 3D- und 4D-Bildverarbeitungsanalysesoftware und wählen Sie Übertreffen. Wählen Sie Datei und öffnen aus, und wählen Sie den Ordner aus, der die Daten aus dem ersten erfassten Kanal enthält, um die Bildstapel zu öffnen.

Wählen Sie Bearbeiten und Kanäle hinzufügen, um die entsprechenden erfassten Fluoreszenzkanaldaten hinzuzufügen. Klicken Sie anschließend auf Bearbeiten und wählen Sie Bildeigenschaften aus, um die Voxelabmessungen von x, y und z zu korrigieren. Anpassen der Parameter im neu geöffneten Fenster.

Um die Leuchtstoffsignale anzupassen, öffnen Sie zunächst das Bearbeiten-Menü und wählen Sie, Anzeigeanpassung anzeigen. Ein neues Fenster zeigt alle offenen Kanäle an. Um den Autofluoreszenzkanal in Graustufen zu ändern, wählen Sie den Autofluoreszenzkanal aus, wählen Sie den weißen Anzeigestil und klicken Sie auf OK.

Passen Sie dann die Ansicht an, indem Sie das Raster entfernen. Vergrößern Sie dann die Ansicht und deaktivieren Sie einen Kanal. Passen Sie dann den Schwarzwertwert an, um unerwünschte Hintergrundsignale auszuschließen, die nicht die Sample-Strukturen, die Signalintensität und den Kontrast darstellen.

Passen Sie den stehenden Antikörperkanal in Bezug auf das überarbeitete Autofluoreszenzkanalsignal an. Festlegen des Kanalmodus, fire, um die Visualisierung des Antikörpersignals auf eine Heatmap-Farbnachschlagetabelle festzulegen. Wählen Sie dann den Mischmodus, um die Gewebestrukturen im Detail zu visualisieren.

Um die Orgel virtuell aufzuschneiden, wählen Sie vor dem Export der 3D-Szene das Symbol für die Schnittebene in der Objektliste aus. In der Bildansicht erscheinen ein gelber Rahmen und ein weißer Spindelmanipulator. Verwenden Sie die Maus, um die Spindel am dünneren Ende zu drehen, um die Ausrichtung der Schnittebene zu ändern, und verschieben Sie den dickeren mittleren Teil der Spindel, um die gewünschte Schnitttiefe auszuwählen.

Deaktivieren Sie dann die entsprechenden Kontrollkästchen, um den Rahmen und den Manipulator auszublenden und die gewünschten Schnappschüsse zu erstellen. Die Erfassung eines gesamten Bildstapels, bestehend aus zwei Fluoreszenzkanalsignalen, löst ein künstliches 3D-Rendering aus, in dem die Leukozytenverteilung in einer Heatmap-Ansicht dargestellt wird. Die stark entzündeten Stellen des Herzens eines mit Diphtherietoxin behandelten Tieres sind an ihrem rötlichen, weißlichen Aussehen zu erkennen.

Insbesondere in den Regionen des kardialen Reizleitungssystems, wie dem atrialen Ventrikelbündel und den Purkinje-Fasern. Im Gegensatz dazu zeigen die Herzen von kontrollierten PBS-behandelten Tieren dieses Entzündungsmuster nicht. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik die digitale Analyse eines Zielorgans, von der Entnahme bis zur computergestützten Rendifikation in vier bis fünf Tagen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Emmenologie, um zelluläre Verteilungsmuster in ganzen Mausorganen zu erforschen. Dies kann bei der Analyse und Behandlung einer Vielzahl von pathophysiologischen Krankheitsprothesen altern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ganze Mausorgane für die Fluoreszenzlichtblattmikroskopie vorbereitet und wie man 3D-Datenstapel generiert und verarbeitet.