Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, das Herz einer Maus mit induzierter Herzrhythmusstörung chemisch zu klären, um mithilfe der Fluoreszenz-Lichtscheibenmikroskopie eine Ganzorgan-Darstellung des leukozytären Herzinfiltrats zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ganzorganforschung bezüglich Prothesen und Strukturen auf zellulärer Auflösungsebene zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie sowohl die Quantifizierung als auch die Lokalisierung von Entzündungen in ganzen Organen ermöglicht.

Detaillierte Einblicke in neurologische Prothesen. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir dringend ein Visualisierungswerkzeug benötigten, um zelluläre Ursachen für Herzrhythmusstörungen im Depletionsmodul zu identifizieren. Nach der Exposition des Herzens eines acht bis zehn Wochen alten Mäuses verwenden Sie einen Katheter mit 21 Gauge und durchdringen damit das rechte Ventrikel.

Schneiden Sie die Aorta ein, um den Abfluss des Blutes zu ermöglichen, und spülen Sie dann mit fünf Milliliter PBS mit EDTA bei langsamem, konstantem Druck durch. Schließen Sie sich den PBS mit EDTA mit fünf Milliliter 4 % Paraformaldehyd an. Am Ende der Perfusion fassen Sie das fixierte Herz vorsichtig mit gezahnten Pinzetten an und ziehen das Organ leicht nach oben, um alle Gewebeverbindungen zu durchtrennen.

Unter Einbeziehung der ein- und ausströmenden Arterien und Venen. Danach das Herz vier Stunden lang in frischem 4 % PFA zur weiteren Fixierung aufbewahren. Zum Dehydrieren des Gewebes wird das Herz in einer aufsteigenden Ethanolreihe in schwarzen fünf Milliliter fassenden Polypropylen-Reaktionsgefäßen im Dunkeln unter ständigem langsamen Rühren auf einem Röhrchenrotator inkubiert, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.

Danach klären Sie das Gewebe durch eine Inkubation mit 98 % Dibenzylether unter ständiger Rotation über Nacht. Um die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen, bringen Sie zunächst dehydrierte Agaroseblöcke in den Standardprobenträger ein, um die Probe zu fixieren. Anschließend überführen Sie die Probe auf den Probenträger.

Als Nächstes überführen Sie den Probenhalter in eine passend dimensionierte Küvette, die mit Dibenzylether gefüllt ist. Verwenden Sie die geeigneten Einstellungen für Anregungs- und Emissionsfilter, um die gewünschten Fluoreszenzsignale nachzuweisen. Eine korrekte Positionierung und Fixierung der Probe ist daher entscheidend, um Abschattungseffekte während der Bildaufnahme zu minimieren.

Außerdem kann ein locker befestigtes Präparat Bewegungsartefakte verursachen, die während der Nachbearbeitung schwer zu korrigieren sind. Nachdem alle Bilder aufgenommen wurden, öffnen Sie die geeignete 3D- und 4D-Bildverarbeitungs- und Analyse-Software und wählen Sie „Surpass“. Wählen Sie „Datei“ und „Öffnen“ und selektieren Sie den Ordner, der die Daten vom zuerst aufgenommenen Kanal enthält, um die Bildstapel zu öffnen.

Wählen Sie „Bearbeiten“ und „Kanäle hinzufügen“, um die entsprechenden aufgezeichneten fluoreszierenden Kanaldaten hinzuzufügen. Klicken Sie anschließend auf „Bearbeiten“ und wählen Sie „Bildeigenschaften“, um die Voxelabmessungen in x-, y- und z-Richtung zu korrigieren. Passen Sie die Parameter im neu geöffneten Fenster an.

Um die fluoreszierenden Signale anzupassen, öffnen Sie zunächst das Bearbeitungsmenü und wählen Sie „Anzeigeanpassung anzeigen“. Ein neues Fenster zeigt alle geöffneten Kanäle an. Um den Autofluoreszenzkanal in Graustufen umzustellen, wählen Sie den Autofluoreszenzkanal aus, wählen Sie den weißen Anzeigestil und klicken Sie auf „OK“.

Danach passen Sie die Ansicht an, indem Sie das Raster entfernen. Danach zoomen Sie heran und deaktivieren einen Kanal. Danach stellen Sie den Schwarzpegel so ein, dass unerwünschte Hintergrundsignale, die keine Probenelemente, Signalintensität und Kontrast darstellen, ausgeschlossen werden.

Passt den Antikörper-Standkanal in Bezug auf das überarbeitete Signal des Autofluoreszenzkanals an. Stellt den Kanalmodus ein, um die Visualisierung des Antikörpersignals über eine Farbskala (Heatmap) festzulegen. Wählt anschließend den Mischmodus, um die Gewebestrukturen detailliert darzustellen.

Um das Organ virtuell zu öffnen, wählen Sie vor dem Export der 3D-Szene das Symbol der Schnittebene in der Objektliste aus. Ein gelber Rahmen und ein weißer Spindel-Manipulator erscheinen in der Bildansicht. Drehen Sie mit der Maus an dem dünneren Ende der Spindel, um die Ausrichtung der Schnittebene zu verändern, und verschieben Sie den dickeren mittleren Teil der Spindel, um die gewünschte Tiefe des Ausschnitts festzulegen.

Dann deaktivieren Sie die entsprechenden Kontrollkästchen, um den Rahmen und den Manipulator auszublenden, und erstellen Sie die gewünschten Momentaufnahmen. Die Aufnahme eines gesamten Bildstapels, bestehend aus zwei fluoreszierenden Kanalsignalen, erzeugt eine künstliche 3D-Darstellung, in der die Leukozytenverteilung in Form einer Wärmekartenansicht dargestellt wird. Die stark entzündeten Bereiche von Herzen eines mit Diphtherietoxin behandelten Tieres sind an ihrer rötlichen, weißlichen Erscheinung erkennbar.

Besonders in den Regionen des Herzens, die zum Reizleitungssystem gehören, wie dem atrioventrikulären Bündel und den Purkinje-Fasern. Im Gegensatz dazu zeigen die Herzen von kontrollierten, mit PBS behandelten Tieren dieses Entzündungsmuster nicht. Sobald die Technik beherrscht ist, ermöglicht sie die digitale Analyse eines Zielorgans – von der Gewinnung bis zur computergestützten Darstellung innerhalb von vier bis fünf Tagen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Emmenologie den Weg, um zelluläre Verteilungsmuster in gesamten Mausorganen zu untersuchen. Dies könnte das Alter in der Analyse und Behandlung einer Vielzahl von pathophysiologischen Krankheitszuständen beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesamte Mausorgane für die Fluoreszenz-Mikroskopie mit lichtdurchstrahlter Ebene vorbereitet und wie man 3D-Datensätze erzeugt und verarbeitet.