Name: Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltraten im Herzen mithilfe der Licht-Blatt-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Analyse von Entzündungen in ganzen Organen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Forschung im Labor von Gunzer wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Stipendium Nr. 0315590 n.Chr.) Und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) unterstützt. Wir danken dem IMCES für technische Unterstützung und Sebastian Kubat für die Hilfe bei der 3D-Karikaturmodellierung.

Alle Tierversuche wurden gemäß den EU-Richtlinien durchgeführt und wurden von den zuständigen örtlichen Behörden in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Deutschland) genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten pathogenfreien (SPF) Bedingungen verwendet und untergebracht. 1. Induktion der Myokarditis durch Diphtherie Toxin (DTX) <ol><li> Bereiten Sie die DTX-Lösung für die Induktion von Myokarditis vor, indem Sie die DTX-Stammlösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine 1 μg / ml Arbeitslösung verdünnen. </li><li> Tragen Sie 100 μl dieser Lösung intratracheal (it) in 8 bis 10 Wochen alte CD11c.DTR-Mäuse ( ca. 5 ng / g Körpergewicht (bw)), wie von Hasenberg et al. Für die Anwendung einer Pilzsporen-Suspension 20 . HINWEIS: Die intraperitoneale Anwendung des Toxins kann zu einer ähnlichen Induktion führenTödliche Myokarditis Dieser Ansatz müsste aber zunächst validiert werden. <ol><li> Für sie Anwendung, betäubt die Tiere durch eine intraperitoneale (ip) Injektion von 100 mg / kg bw Ketamin und 10 mg / kg bw Xylazin. </li><li> Nach dem Erreichen einer tiefen Narkose (Zehen-Prise-Test), intubieren Sie die Tiere mit einem 22 G Indwelt Venenkatheter durch die Mundhöhle. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung des Objektivrohres, indem Sie die Tiere mit einem kleinen Atemschutzgerät mit einer Rate von 250 Atemnoten pro Minute und einem Inhalationsvolumen von 250 μl pro Atem belüften, auch von Hasenberg et. Al. 20 HINWEIS: Wenn Sie richtig positioniert sind, ändert sich die Atemfrequenz der Tiere entsprechend den angelegten Belüftungseinstellungen. </li><li> Trennen Sie das Belüftungssystem und trennen Sie die 100 μl DTX-Lösung oder eine gleiche Menge PBS als Kontrolle durch den Katheter in die Lunge und belüften Sie die Tiere für 1 zusätzliche Min. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen und überwachen Sie den allgemeinen Gesundheitszustand und die Körpergewichtsänderung für 4 Tage. HINWEIS: Je nach genetischem Hintergrund, Mäusestamm oder Anfangsgewicht kann die Schwere und der Beginn der Myokarditis variieren und sollte zuerst bestimmt werden. </li></ol> 2. Probenvorbereitung für die Lichtbogenmikroskopie <ol><li> 4 Tage nach Toxin-Applikation die Mäuse durch Spülen einer Induktionskammer mit einer verdampften 2% Isofluran / Sauerstoff-Mischung anästhesieren. In etwa 50 μl eines direkt markierten Anti-CD45-Antikörpers (Klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μl PBS intravenös (iv) unter Verwendung des retro-orbitalen Applikationsweges injizieren, was eine sehr schnelle und hochgenaue Applikation der Korrekte Menge an Antikörper. HINWEIS: Die gewünschte Tiefe der Narkose wurde erreicht, wenn die Mäuse liegend sind und nicht auf Zehenstichprüfung reagieren. </li><li> Nach 2 h Inkubation, opfer die Mäuse durch zervikale Versetzung anD dauert die Herzen in situ mit 5 ml PBS / EDTA (5 mM). <ol><li> Das Herz aussetzen und die Perfusionslösung mit einem 21 G-Katheter in den rechten Ventrikel einspritzen. Perfund mit langsamem, konstantem Druck und stellen Sie sicher, dass das Blut nach dem Schneiden der Aorta entleert werden kann. HINWEIS: Diese transkardiale Perfusion kann zu kleinen Vorbereitungsartefakten führen, die die endgültige 3D-Visualisierung des Organs stören könnten. Daher konnten fortgeschrittene Tierversucher die Perfusion durch die untere Hohlvene durchführen und die Bauchaorta ausgleichen. </li></ol></li><li> Zur chemischen Fixierung wird das Herz durch die gleiche Vertiefung mit 5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) perfundiert. Halten Sie den Katheter an Ort und legen Sie einfach eine neue Spritze mit PFA gefüllt. Perfund mit langsamem und konstantem Druck HINWEIS: Paraformaldehyd stark toxisch; Vermeiden Sie Kontakt mit der Haut, Augen und anderen Schleimhaut. <ol><li> Vorsichtig das Herz mit gezackter Pinzette ergreifen; PuLl es etwas nach oben; Und schneiden alle Gewebeverbindungen, einschließlich der eingehenden und ausgehenden Arterien und Venen. Die Orgel für weitere 4 h in 4% PFA zur weiteren Fixierung aufbewahren. </li></ol></li><li> Um das Organ zu dehydrieren, das Herz in einer aufsteigenden Ethanolreihe mit 50%, 70% und zweimal bei 100%, jeweils für 12 h, bei 4 ° C im Dunkeln zu inkubieren. Verwenden Sie hier schwarze 5-ml-Polypropylen-Reaktionsrohre, so dass sie sich ständig in einem Rohrrotator mit einer langsamen Drehzahl drehen können, um eine Luftblasenbildung zu verhindern. </li><li> Komplette Probenvorbereitung durch chemisches Clearing. Um die Herzen transparent zu machen, inkubieren sie sie in 98% Dibenzylether (DBE), während sie sich ständig über Nacht drehen. HINWEIS: DBE reizt Augen, Haut und Atemwege. </li></ol> 3. Lichtbogen-Mikroskopie <ol><li> LSFM mit dem Lichtbogenmikroskop durchführen (siehe Materialliste). Legen Sie die Probe auf den Standardprobenhalter des Mikroskops in die DBE-gefüllte cuVette, die für Proben bis 30 mm x 30 mm x 15 mm geeignet ist. </li><li> Halten Sie die Probe während der Bildaufnahme mit dehydrierten und gelöschten Agaroseblöcken fest. <ol><li> Zur Herstellung der Agaroseblöcke 2% geschmolzene Agarose in eine Form geben (15 mm x 15 mm x 5 mm). Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis sie erstarrt. </li><li> Dehydrieren Sie es in einer aufsteigenden Ethanol-Serie (50%, 70% und zweimal bei 100%). Inkubieren Sie die Agaroseblöcke über Nacht in 98% DBE. Lagern Sie die Agarose in DBE, bis sie verwendet wird. HINWEIS: Da die Agarose hauptsächlich aus Wasser besteht, können die Inkubationszeiten für jeden Dehydratisierungsschritt je nach Größe des Blocks verlängert werden. HINWEIS: DBE reizt die Augen, die Haut und die Atemwege. </li><li> Wenn nötig, schneide den vorbereiteten Agarose-Block auf die gewünschte Form mit einem scharfen Skalpell. Typischerweise schneiden sie prisma- oder keilförmige Formen, um an den Kanten des Probenadapters zu platzieren. HINWEIS: Da die Agarose-Blöcke elastisch sind,Die Probe bleibt bei einer geringen Kraft an Ort und Stelle. </li></ol></li><li> Erfassen Sie die interessierenden Fluoreszenzsignale (hier Autofluoreszenz- und Anti-CD45-Antikörper-Färbung) mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfilter-Einstellungen. <ol><li> Für den Nachweis des Bindegewebs-abgeleiteten Autofluoreszenzsignals verwenden Sie ein 525/50 nm Bandpassfilter bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm (OPSL: 50 mW); Die CD45-Färbung mit einem AF647-gekoppelten Antikörper wird bei 668 nm (Bandpassfilter: 680/30 nm) und bei einer Anregungswellenlänge von 647 nm (Diodenlaser: 50 mW) nachgewiesen. </li><li> Wählen Sie 4 μm als Abstand zwischen den beiden einzelnen Z-Ebenen. </li></ol></li></ol> 4. Bild Nachbearbeitung HINWEIS: Die erfassten digitalen Bilddaten wurden mit einer wissenschaftlichen 3D / 4D Bildverarbeitungs- und Analysesoftware weiterverarbeitet (siehe Tabelle). <ol><li> Öffnen und Voreinstellung der Datendateien. </stRong&gt; <ol><li> Nach dem Start der Analysesoftware wählen Sie die &quot;Surpass&quot; -Taste in der oberen linken Ecke. Um die Bildstapel zu öffnen, wählen Sie &quot;Datei&quot;, &quot;Öffnen&quot; und wählen Sie einen Ordner aus, der die Daten aus dem ersten erworbenen Kanal enthält. Wählen Sie &quot;Bearbeiten&quot; und &quot;Hinzufügen von Kanälen&quot;, um weitere erworbene Kanäle hinzuzufügen. HINWEIS: Abhängig von der Datengröße und dem Computersystem kann dieser Vorgang einige Minuten dauern. Das vorgestellte Protokoll zeigt alle Schritte für 2 Erfassungskanäle (Autofluoreszenz und AF647). </li><li> Korrigieren Sie die x-, y- und z-Voxel-Maße, indem Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; klicken und &quot;Bildeigenschaften&quot; auswählen. Wenn das neue Fenster öffnet, passen Sie die Parameter an. HINWEIS: Dieser Schritt hängt vom eingesetzten Mikroskopsystem und dem jeweiligen Datenformat ab. Richtige xyz-Werte sind für die nachfolgende Größe und die entfernten Messungen kritisch. In den meisten Fällen werden diese Parameter als Metadaten in den Mikrographen-Dateien gespeichert. Allerdings, wenn die Datei foRmat kann von der Analysesoftware nicht korrekt interpretiert werden, es ist wichtig, die Pixelgröße manuell einzugeben. Die Pixelgröße in den x- und y-Dimensionen hängt von der Kamerapixelgröße, dem potentiell angewandten Binning und der Linse und der Objektivvergrößerung ab. Die Pixelgröße in z entspricht der selbst definierten z-Schrittgröße ( zB 4 μm). </li></ol></li><li> Kanalanpassungen <ol><li> Zuerst das Autofluoreszenzsignal in Graustufen umwandeln, indem du die &quot;Display-Einstellung&quot; (&quot;Edit&quot; und &quot;Show Display Adjustment&quot;) öffnest. Ein neues Fenster listet alle geöffneten Kanäle und die Anzeigeeinstellungen für alle von ihnen auf; Um die Standardfarbe zu ändern, den Autofluoreszenzkanal auszuwählen und den &quot;weißen&quot; Displaystil auszuwählen. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um sich zu bewerben. </li><li> Für die Schwarzpegel-Einstellung gehen Sie zurück auf &quot;Display-Einstellung&quot; und stellen Sie den Schwarzpegelwert ein, um unerwünschte Hintergrundsignale auszuschließen, die keine Musterstruktur darstellenS. <ol><li> Verwenden Sie dazu das obere linke Dreieck auf der Kanalleiste und ziehen Sie es von links nach rechts. HINWEIS: Änderungen werden sofort visualisiert. Achten Sie darauf, nur Signale zu unterdrücken, die nicht aus dem Sample stammen. Minimalwerte im Hintergrund sollten niemals &quot;0&quot; sein, um pechschwarze Pixel zu vermeiden, da die Rauschsignale für zusätzliche Berechnungen benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Schwarzniveauänderungen nach der Bilderfassung durchgeführt werden. Andernfalls können wertvolle Beispielinformationen verloren gehen. Die Black-Level-Einstellung dient nur repräsentativen Zwecken. Um die gleichen Anzeigeeinstellungen über verschiedene Samples zu verwenden, können präzise Werte in das &quot;min&quot; numerische Feld unterhalb der Kanalliste eingegeben werden. Das ist sehr hilfreich für quantitative Analysen. </li></ol></li><li> Führen Sie die Intensitätseinstellung durch, indem Sie das obere rechte Dreieck verwenden, um die jeweilige Kanalintensität einzustellen oder indem Sie präzise Werte in das &quot;max&quot; numerische Feld unterhalb der Channe eingebenL Liste. </li><li> Führen Sie die Kontrasteinstellung durch, indem Sie das untere Dreieck in der Mitte der Kanalleiste ziehen, um den Gamma-Wert zu erhöhen oder zu verringern oder indem Sie die genauen Werte eingeben. </li><li> Stellen Sie den AF647-Kanal entsprechend dem Autofluoreszenzkanal ein. Als Differenz setzen Sie die Visualisierung des AF647-Signals auf eine Hitzekarte-Farb-Nachschlagetabelle. Tun Sie dies, indem Sie den Kanalmodus &quot;Feuer&quot; in einem ähnlichen Ansatz wie in Schritt 4.2.1 wählen. HINWEIS: Da die Gesamtsignalintensitäten im Vergleich zum Autofluoreszenzkanal deutlich niedriger sind, werden die Schwarzpegel in der Regel auf viel niedrigere Werte eingestellt. Für den Autofluoreszenzkanal wird die Helligkeit dieses Kanals gewöhnlich erhöht. </li><li> Wählen Sie den &quot;Blend-Modus&quot;, um Gewebestrukturen im Detail zu visualisieren. Analysiere alle Samples aus einer Serie mit den gleichen Parameterwerten. </li></ol></li><li> Virtueller Ausschnitt <ol><li> Um die Orgel vor der 3D-Szene explizit zu schneidenRt, eine Clipping-Ebene auf das gerenderte 3D-Objekt anwenden. <ol><li> Klicken Sie in der Objektliste auf das Symbol &quot;Clipping Plane&quot; (Schere). Innerhalb der Bildansicht erscheint ein gelber Rahmen und ein Manipulator (weiße Spindel). Drehen Sie die Spindel am dünneren Ende mit der Maus, indem Sie die Ausrichtung der Clipping-Ebene ändern und bewegen Sie den dickeren Mittelteil der Spindel, um die gewünschte Tiefe des Clips auszuwählen. </li><li> Verbergen Sie den Rahmen und den Manipulator, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen unterhalb der Objektliste deaktivieren und die gewünschten Schnappschüsse erstellen. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229473459_Uber_Sichtbarmachung_und_Grossenbestimmung_ultramikoskopischer_Teilchen_mit_besonderer_Anwendung_auf_Goldrubinglaser">Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser.</a> Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%281%2C2%2C3%29%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3).</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+building+units+and+properties+of+a+fluorescence+single+plane+illumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705(2007).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3D+reconstruction+of+large+microscopical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens.</a> J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+bacterial-animal+symbioses+with+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy.</a> Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 2207(2013).</li>
<li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Clarifying+Tissue+Clearing">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Maruyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide+field+intravital+imaging+by+two-photon-excitation+digital-scanned+light-sheet+microscopy+%282p-DSLM%29+with+a+high-pulse+energy+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser.</a> Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).</li>
<li>Mann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11c.DTR+mice+develop+a+fatal+fulminant+myocarditis+after+local+or+systemic+treatment+with+diphtheria+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin.</a> Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+depletion+of+CD11c%2B+dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8%2B+T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).</li>
<li>Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11c+integrin+gene+promoter+activity+during+myeloid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation.</a> Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).</li>
<li>Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11chigh+dendritic+cell+ablation+impairs+lymphopenia-driven+proliferation+of+naive+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).</li>
<li>Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+maximize+the+memory+CD8+T+cell+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection.</a> Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).</li>
<li>Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+phagocytosis+and+NET-formation+by+neutrophils+in+infected+lungs+using+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+axial+resolution+in+fluorescence+microscopy+by+standing-wave+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation.</a> Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).</li>
<li>Göppert-Mayer, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228051231_Uber_Elementarakte_mit_zwei_Quantensprungen">Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen.</a> Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Männ, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11c.DTR+mice+develop+a+fatal+fulminant+myocarditis+after+local+or+systemic+treatment+with+diphtheria+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin.</a> Eur. J. Immunol. , in press (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+of+tissue+measured+with+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Refractive index of tissue measured with confocal microscopy.</a> J Biomed Opt. 10 (4), 44014(2005).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+tooth+model+system.+An+aid+in+the+study+of+root+canal+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy.</a> Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).</li>
<li>Karreman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+targeting+of+single+tumor+cells+in+vivo+by+multimodal+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy.</a> J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In der modernen Life Science spielt die mikroskopische Visualisierung biologischer Prozesse eine immer wichtigere Rolle. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten zwei Jahrhunderten viele Entwicklungen erreicht, die helfen, Fragen zu beantworten, die bis zu diesem Punkt nicht adressierbar sind. Erstens hat es eine deutliche Tendenz gegeben, die Auflösungsfähigkeit von Lichtmikroskopen grundsätzlich zu erhöhen. Mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) 21 , 2...

Während der Evolution der Lichtmikroskopie erschienen viele spezialisierte Formen, die alle entwickelt wurden, um Einschränkungen im Visualisierungsprozess für bestimmte Exemplare zu minimieren. Ein solches Verfahren ist die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM). Erstmals im Jahre 1903 von Siedentopf und Zsigmondy 1 entwickelt und Anfang der 90er Jahre 2 erste biologische Grundanwendungen gefunden, ist LSFM bis heute zum leistungsstärksten mikroskopischen Werkzeug für die Visualisierung von großen Exemplaren wie intakten Mausorganen mit Fluoreszenzsignalauflösung geworden Bis auf zellulare Ebene. Aufgrund dieser Vorteile, in Kombination mit seinem Potenzial für Live-Zell-Bildgebung, Nature Methods namens LSFM die &quot;Methode des Jahres 2014 3 &quot;. Wie der Name schon sagt, wird die Probenbeleuchtung in einem LSFM durch leichte Blätter durchgeführt, die senkrecht zur Achse des verwendeten Objektivs orientiert sindOder Emissionslicht-Sammlung und anschließende Bilderzeugung. Das Lichtbogen wird gewöhnlich entweder durch Fokussieren von breiten, kollimierten Laserstrahlen mit einer zylindrischen Linse oder durch die schnelle Seitwärtsbewegung von schmalen, fokussierten Laserstrahlen in nur einer horizontalen oder vertikalen Ebene 4 , 5 erzeugt . Auf diese Weise wird nur die Brennebene der Abbildungsoptik beleuchtet, typischerweise mit einer Dicke von 1-4 μm. Folglich werden für eine in der Beleuchtungsebene platzierte Fluoreszenzprobe sowohl die Erzeugung von Streulicht als auch die Effekte des Photobleichens aus Bereichen oberhalb oder unterhalb der Brennebene eliminiert oder stark unterdrückt 6 , 7 . Da alle Out-of-Focus-Flugzeuge nicht beleuchtet sind, werden in diesen Bereichen Photobleicheffekte weggelassen. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie sind die Wege des beleuchteten und emittierten Lichts voneinander getrennt, so dass das endgültige Bild qual<html> Nicht von der perfekten Fokussierung des Anregungslichtstrahls durch die Ziele abhängt. Abhängig von der zugrundeliegenden Frage ist es daher möglich, Ziele mit einem enormen Sichtfeld (FOV) zu verwenden, so dass die größtmögliche Fläche der beleuchteten Ebene ohne irgendwelche in xy-Richtung bewegenden Bauteile abgebildet werden kann. In modernen LSFM-Systemen wird ein Fluoreszenzbild des erzeugten optischen Abschnitts auf einer hochempfindlichen ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) oder komplementären Metalloxid-Halbleiter- (CMOS-) Kameras erfasst, die in der Lage sind, das gesamte Sichtfeld (FOV) zu erfassen, In Mikrosekunden. Daher ist es möglich, durch Bewegen der Probe durch das Lichtblatt und durch Erfassen von Bildern in definierten z-Schritten die vollständige 3D-Information einer Probe in einer angemessenen Zeitspanne 8 , 9 zu erhalten , wodurch diese Technik für die lebende Zelle anwendbar ist Studien 10 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Dennoch, obwohl LSFM eine schnelle, empfindliche und fluoreszenzfreundliche Methode anbietet, ist die Lichtdurchlässigkeit durch die Probe immer noch ein wichtiges Thema, besonders wenn große biologische Proben das Ziel für eine 3D-Analyse sind. Die Lichtdurchlässigkeit wird durch physikalische Aspekte der Absorption und durch Lichtstreuung an Grenzflächen von Strukturen mit unterschiedlichen Brechungsindizes kritisch modifiziert 13 . Wenn daher Proben mehrere Millimeter groß sind, wird LSFM meist mit Clearing-Protokollen kombiniert, um die Proben optisch transparent zu machen. Diese Techniken basieren auf der Idee, Wasser aus dem jeweiligen biologischen Gewebe zu entfernen und es mit wasser- oder (organischen) lösemittelbasierten Immersionsmedien auszutauschen, die so gewählt sind, dass sie die Brechungsindizes der jeweiligen Zielgewebekomponenten eng anpassen. Als Ergebnis wird die laterale Lichtstreuung minimiert und alle Wellenlängen werden minimiertVon Licht kann viel effizienter durch das Gewebe 13 gehen . In vielen Fällen erscheinen die so behandelten biologischen Proben makroskopisch kristallklar, was es ermöglicht, dass LSFM auch auf ganzen Mausorganen mit langen Arbeitsabständen mit geringem Vergrößerungsgrad durchgeführt wird. Hier stellen wir ein Vorbereitungsprotokoll für die Großprobenabbildung in einem Lichtbogenmikroskop vor (siehe Tabelle der Materialien), das wir zur Untersuchung des zellulären Herzinfiltrums in einem Mausmodell der Myokarditis 15 etabliert haben. CD11c.DTR-Mäuse exprimieren den Primaten-Diphtherie-Toxinrezeptor (DTR) unter der Kontrolle des CD11c-Promotors 16 . Folglich werden Zellen in diesen Mäusen, die CD11c zusammen mit dem DTR exprimieren, gegenüber dem Exotoxin von Corynebacterium diphtheria (Diphtherietoxin, DTX) empfindlich gemacht ; Die systemische Behandlung dieser Tiere mit DTX führt zu einer Erschöpfung aller CD11c + ceLl CD11c ist ein Integrin und ist als Zelloberflächenrezeptor für eine Vielzahl unterschiedlicher löslicher Faktoren in Aktivierungs- und Reifungsprozessen vor allem in Zellen der monozytischen Linie 17 involviert. Folglich wurde das CD11c.DTR-Mausmodell intensiv verwendet, um die Rolle der dendritischen Zellen und Makrophagen-Teilmengen im Kontext vieler verschiedener immunologischer Fragen zu untersuchen. Im Laufe der Zeit wurde berichtet, dass CD11c.DTR-Mäuse, die systemisch mit DTX behandelt wurden, nachteilige Nebenwirkungen entwickeln und stark erhöhte Mortalitätsraten aufweisen können 18 , 19 . In letzter Zeit konnten wir die zugrunde liegende Todesursache 15 identifizieren, die die Entwicklung einer fulminanten Myokarditis nach intratrachealer DTX-Anwendung bei diesen Tieren beschreibt. Die Toxin-Herausforderung verursachte zelluläre Zerstörung, auch in zentralen Teilen des Stimulus-Übertragungssystems im Herzen. Dies wurde von massiven CD45 begleitet+ Leukozyten infiltrieren, schließlich führt zu tödlichen Herzrhythmusstörungen. In diesem Fall war nicht nur das Aussehen der Leukozytenpopulation wichtig, sondern auch ihre räumliche Verteilung im Herzen. Diese experimentelle Frage stellt eine Herausforderung für die moderne mikroskopische Bildgebung dar, die wir durch einen Lichtbogenmikroskopieansatz gelöst haben, der durch intravitale Antikörperfärbung und ein organisches Lösemittelbasiertes optisches Clearingprotokoll unterstützt wird.

<table><tbody><tr><td>Diphtherietoxin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Biochrom</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin [50 mg/ml]</td><td>Inresa</td><td>PZN 4089014</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin [2 %]</td><td>Ceva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Braun</td><td>REF 9161502</td><td>Braun Omincan F&nbsp;</td></tr><tr><td>verweilter venöser Katheter&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 381923</td><td>BD Insyte Autoguard</td></tr><tr><td>Beatmungsgerät für Kleintiere</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0044</td><td>MiniVent</td></tr><tr><td>anit-CD45 Antikörper (AF647)</td><td>BioLegend</td><td>103124</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Dinatriumsalzdihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Katheter (21 G)</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 387455</td><td>BD valu-set</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PE Röhrchen (5 mL)</td><td>Carl Roth</td><td>EKY9.1</td><td>Rotilabo</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchenrotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>MACSmix</td></tr><tr><td>Agarose (niedrig gelierend)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>Form (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Tissue Tek</td><td>4566</td><td>Cryomold&nbsp;</td></tr><tr><td>Lichtblattmikroskop-System</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td>Ultramikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>Gehäuse für Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>MVX10&nbsp;</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td></td><td>0.5&nbsp; NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera 5,5 MP</td><td>Andor-Technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm OPSL (50 mW) Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>647 nm&nbsp; Diodenlaser (50 mW)</td><td>Kohärente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D-Bildverarbeitungs- und Analysesoftware</td><td>Bitplane</td><td></td><td>IMARIS Ver. 8.3</td></tr><tr><td>transgener Mausstamm</td><td>Steffen Jung et al.</td><td></td><td>CD11c.DTR</td></tr><tr><td>wt Mausstamm</td><td>Envigo</td><td></td><td>Balb/c Ola Hsd J</td></tr><tr><td>Lasermodul</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MVPLAPO 2XC Objektiv</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative visualisierung von leukozyten-infiltrat in einem murin-modell der fulminant-myokarditis durch licht-blatt-mikroskopie

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist in Kombination mit chemischen Clearing-Protokollen zum Goldstandard für die Analyse fluoreszenzmarkierter Strukturen in großen biologischen Proben geworden und liegt in der zellulären Auflösung. Mittlerweile ermöglichen die ständige Verfeinerung der zugrunde liegenden Protokolle und die erweiterte Verfügbarkeit von spezialisierten kommerziellen Systemen die Untersuchung der Mikrostruktur ganzer Mausorgane und ermöglichen sogar die Charakterisierung des zellularen Verhaltens in verschiedenen lebenszykologischen Bildgebungsansätzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die räumliche Vollmontage Visualisierung und Quantifizierung der CD45 + Leukozytenpopulation in entzündeten Mausherzen. Das Verfahren verwendet einen transgenen Mausstamm (CD11c.DTR), der vor kurzem als ein robustes, induzierbares Modell für die Untersuchung der Entwicklung einer fulminanten tödlichen Myokarditis, gekennzeichnet durch tödliche Herzrhythmusstörungen, gezeigt wurde. Dieses Protokoll enthält Myokarditis Induktion, intravitAl-Antikörper-vermittelte Zellfärbung, Organpräparation und LSFM mit anschließender computergestützter Bildnachbearbeitung. Obwohl es als hoch angepasstes Verfahren für unsere besondere wissenschaftliche Frage dargestellt ist, stellt das Protokoll die Blaupause eines leicht einstellbaren Systems dar, das auch ganz andere fluoreszierende Strukturen in anderen Organen und sogar in anderen Spezies ansprechen kann.

Der vorgestellte LSFM-Ansatz analysiert die Leukozytenverteilung und die Menge in murinen Herzen bei der Induktion einer schweren Myokarditis. Abbildung 1A erklärt das Vorbehandlungsprotokoll für die transgenen CD11c.DTR-Mäuse zur Myokarditis-Induktion. Dieser Schritt stellt den notwendigen Auslöser für die Rekrutierung von Leukozyten zum Myokard dar. Nach erfolgreicher DTX-Anwendung entwickeln die Tiere schwere Krankheitssymptome wie allgemeine Schwäche, Anorexie und Ge...

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, das Herz einer Maus mit induzierter Herzrhythmusstörung chemisch zu klären, um mithilfe der Fluoreszenz-Lichtscheibenmikroskopie eine Ganzorgan-Darstellung des leukozytären Herzinfiltrats zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ganzorganforschung bezüglich Prothesen und Strukturen auf zellulärer Auflösungsebene zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie sowohl die Quantifizierung als auch die Lokalisierung von Entzündungen in ganzen Organen ermöglicht.Detaillierte Einblicke in neurologische Prothesen. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir dringend ein Visualisierungswerkzeug benötigten, um zelluläre Ursachen für Herzrhythmusstörungen im Depletionsmodul zu identifizieren. Nach der Exposition des Herzens eines acht bis zehn Wochen alten Mäuses verwenden Sie einen Katheter mit 21 Gauge und durchdringen damit das rechte Ventrikel.Schneiden Sie die Aorta ein, um den Abfluss des Blutes zu ermöglichen, und spülen Sie dann mit fünf Milliliter PBS mit EDTA bei langsamem, konstantem Druck durch. Schließen Sie sich den PBS mit EDTA mit fünf Milliliter 4 % Paraformaldehyd an. Am Ende der Perfusion fassen Sie das fixierte Herz vorsichtig mit gezahnten Pinzetten an und ziehen das Organ leicht nach oben, um alle Gewebeverbindungen zu durchtrennen.Unter Einbeziehung der ein- und ausströmenden Arterien und Venen. Danach das Herz vier Stunden lang in frischem 4 % PFA zur weiteren Fixierung aufbewahren. Zum Dehydrieren des Gewebes wird das Herz in einer aufsteigenden Ethanolreihe in schwarzen fünf Milliliter fassenden Polypropylen-Reaktionsgefäßen im Dunkeln unter ständigem langsamen Rühren auf einem Röhrchenrotator inkubiert, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.Danach klären Sie das Gewebe durch eine Inkubation mit 98 % Dibenzylether unter ständiger Rotation über Nacht. Um die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen, bringen Sie zunächst dehydrierte Agaroseblöcke in den Standardprobenträger ein, um die Probe zu fixieren. Anschließend überführen Sie die Probe auf den Probenträger.Als Nächstes überführen Sie den Probenhalter in eine passend dimensionierte Küvette, die mit Dibenzylether gefüllt ist. Verwenden Sie die geeigneten Einstellungen für Anregungs- und Emissionsfilter, um die gewünschten Fluoreszenzsignale nachzuweisen. Eine korrekte Positionierung und Fixierung der Probe ist daher entscheidend, um Abschattungseffekte während der Bildaufnahme zu minimieren.Außerdem kann ein locker befestigtes Präparat Bewegungsartefakte verursachen, die während der Nachbearbeitung schwer zu korrigieren sind. Nachdem alle Bilder aufgenommen wurden, öffnen Sie die geeignete 3D- und 4D-Bildverarbeitungs- und Analyse-Software und wählen Sie „Surpass“. Wählen Sie „Datei“ und „Öffnen“ und selektieren Sie den Ordner, der die Daten vom zuerst aufgenommenen Kanal enthält, um die Bildstapel zu öffnen.Wählen Sie „Bearbeiten“ und „Kanäle hinzufügen“, um die entsprechenden aufgezeichneten fluoreszierenden Kanaldaten hinzuzufügen. Klicken Sie anschließend auf „Bearbeiten“ und wählen Sie „Bildeigenschaften“, um die Voxelabmessungen in x-, y- und z-Richtung zu korrigieren. Passen Sie die Parameter im neu geöffneten Fenster an.Um die fluoreszierenden Signale anzupassen, öffnen Sie zunächst das Bearbeitungsmenü und wählen Sie „Anzeigeanpassung anzeigen“. Ein neues Fenster zeigt alle geöffneten Kanäle an. Um den Autofluoreszenzkanal in Graustufen umzustellen, wählen Sie den Autofluoreszenzkanal aus, wählen Sie den weißen Anzeigestil und klicken Sie auf „OK“.Danach passen Sie die Ansicht an, indem Sie das Raster entfernen. Danach zoomen Sie heran und deaktivieren einen Kanal. Danach stellen Sie den Schwarzpegel so ein, dass unerwünschte Hintergrundsignale, die keine Probenelemente, Signalintensität und Kontrast darstellen, ausgeschlossen werden.Passt den Antikörper-Standkanal in Bezug auf das überarbeitete Signal des Autofluoreszenzkanals an. Stellt den Kanalmodus ein, um die Visualisierung des Antikörpersignals über eine Farbskala (Heatmap) festzulegen. Wählt anschließend den Mischmodus, um die Gewebestrukturen detailliert darzustellen.Um das Organ virtuell zu öffnen, wählen Sie vor dem Export der 3D-Szene das Symbol der Schnittebene in der Objektliste aus. Ein gelber Rahmen und ein weißer Spindel-Manipulator erscheinen in der Bildansicht. Drehen Sie mit der Maus an dem dünneren Ende der Spindel, um die Ausrichtung der Schnittebene zu verändern, und verschieben Sie den dickeren mittleren Teil der Spindel, um die gewünschte Tiefe des Ausschnitts festzulegen.Dann deaktivieren Sie die entsprechenden Kontrollkästchen, um den Rahmen und den Manipulator auszublenden, und erstellen Sie die gewünschten Momentaufnahmen. Die Aufnahme eines gesamten Bildstapels, bestehend aus zwei fluoreszierenden Kanalsignalen, erzeugt eine künstliche 3D-Darstellung, in der die Leukozytenverteilung in Form einer Wärmekartenansicht dargestellt wird. Die stark entzündeten Bereiche von Herzen eines mit Diphtherietoxin behandelten Tieres sind an ihrer rötlichen, weißlichen Erscheinung erkennbar.Besonders in den Regionen des Herzens, die zum Reizleitungssystem gehören, wie dem atrioventrikulären Bündel und den Purkinje-Fasern. Im Gegensatz dazu zeigen die Herzen von kontrollierten, mit PBS behandelten Tieren dieses Entzündungsmuster nicht. Sobald die Technik beherrscht ist, ermöglicht sie die digitale Analyse eines Zielorgans – von der Gewinnung bis zur computergestützten Darstellung innerhalb von vier bis fünf Tagen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Emmenologie den Weg, um zelluläre Verteilungsmuster in gesamten Mausorganen zu untersuchen. Dies könnte das Alter in der Analyse und Behandlung einer Vielzahl von pathophysiologischen Krankheitszuständen beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesamte Mausorgane für die Fluoreszenz-Mikroskopie mit lichtdurchstrahlter Ebene vorbereitet und wie man 3D-Datensätze erzeugt und verarbeitet.

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Brown, A. O., et al. Visualisierung von Streptococcus pneumoniae in kardialen Mikroläsionen und anschließende kardiale Remodellierung. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video demonstriert die mikroskopische Visualisierung bakterieller Mikroläsionen im Herzgewebe der Maus. Das Herz einer mit Streptococcus pneumoniae infizierten Maus wird entnommen, gewaschen und fixiert, bevor es verarbeitet wird, um koronale Schnitte zu erhalten. Diese Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und...

Mikroskopische Visualisierung bakterieller Mikroläsionen im Herzgewebe von Mausen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen und Kapillarperfusion in Echtzeit zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Abbildung und Quantifizierung dieser Parameter im pulmonalen Mikrokreislauf mit einem vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystem.

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Das vorliegende Protokoll beschreibt Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte softwaregestützte Methoden zur Visualisierung und genauen Quantifizierung proliferierender und ruhender Trypanosoma-cruzi-Parasiten und T-Zellen in intakten, gereinigten Organen und Geweben. Diese Techniken bieten eine zuverlässige Möglichkeit, Behandlungsergebnisse zu bewerten und neue Einblicke in Parasiten-Wirt-Interaktionen zu bieten.

Quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma-cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen in intakten geklärten Organen

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Herzschäden bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt (repAMI) ermöglicht eine getreue Quantifizierung und Co-Lokalisierung von assoziierten krankheitsbeeinflussenden Mustern. Hier wird ein automatisierbarer, lichtblattgeführter Bildgebungsansatz für die gleichzeitige Messung von Herzschäden, Risikobereichen und Immunzellantworten bereitgestellt.

Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie die quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltraten im Herzen mithilfe der Licht-Blatt-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Analyse von Entzündungen in ganzen Organen.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Weitere Videos entdecken