In Vivo Darstellung der Cx3cr1^GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit Hilfe der optischen Kohärenztomographie im Spektralbereich und der Scanning-Laser-Ophthalmoskopie Informationen über die Dicke der Netzhaut bzw. die Zellverteilung der Mikroglia zu erhalten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der experimentellen Ophthalmologie über den Zusammenhang zwischen Netzhautanomalien und der Akkumulation von Mikrogliazellen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass diese Informationen in Echtzeit auf nicht-invasive Weise abgerufen werden können.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf den Hornhautabstrich reagieren, platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf der linken Seite der Plattform, wobei die rechte Augenhöhle zur Linse zeigt. Tragen Sie einen Tropfen Hydroxypropylmethylcellulose in einer starren, gasdurchlässigen Kontaktlinse mit mehr als vier Dioptrien auf das rechte Auge auf und starten Sie das Erfassungsmodul. Wählen Sie für B-Scans die Option Infrarot plus optische Kohärenztomographie Wählen Sie unter Anwendung und Struktur die Option Retina und bewegen Sie die Linse mit dem Mikromanipulator in Richtung Mausauge.

Bevor Sie auf die Netzhaut fokussieren, vergewissern Sie sich, dass die Oculus-Dexter-Anzeige ausgewählt ist, und verwenden Sie dann den Fokusknopf, um in die Netzhaut zu zoomen, bis die großen Gefäße im Fundusbild auf der linken Seite des Monitorbildschirms deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Position der Kamera nach Bedarf anzupassen, und drehen Sie den Empfindlichkeitsknopf, um die Helligkeit des Fundusbildes je nach Bedarf zu verringern oder zu erhöhen. Wählen Sie im Menü "Muster" den Zeilen-Scan aus und verschieben Sie den B-Scan mit dem Mikromanipulator zwischen der oberen und unteren Ecke des Scanfensters der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich.

Legen Sie den Wert für Automatische Echtzeit auf mindestens neun fest, um eine hohe Bildqualität zu erzielen, und klicken Sie auf Erfassen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, geben Sie die Kontaktlinse aus dem Auge in eine frisch ausbalancierte Salzlösung und hydratisieren Sie die Hornhaut mit einem frischen Tropfen Hydroxypropylmethylcellulose. Nachdem das linke Auge abgebildet wurde, drehen Sie die Standard-30-Grad-Optik gegen den Uhrzeigersinn, um sie zu entfernen, und montieren Sie das 55-Grad-Objektiv für eine zweite Bildgebungsrunde.

Um die Autofluoreszenz zu beurteilen, ohne die Maus zu bewegen, wählen Sie Infrarot auf dem Bedienfeld und fokussieren Sie auf die großen Netzhautgefäße. Wählen Sie die automatische Fluoreszenzbildgebung und verwenden Sie den Empfindlichkeitsknopf, um die Bildhelligkeit nach Bedarf anzupassen. Drücken Sie den Empfindlichkeitsknopf einmal und stellen Sie den automatischen Echtzeitwert auf mindestens 67 ein.

Wenn der automatische Echtzeitwert erreicht ist, nehmen Sie das Bild auf und drücken Sie den Empfindlichkeitsknopf ein zweites Mal, um die Mittelwertbildung zu stoppen. Passen Sie den Fokus an, um die verschiedenen Netzhautschichten zu visualisieren, wie es experimentell angemessen ist. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, setzen Sie das 102-Grad-Weitwinkelobjektiv auf die Optik und bilden Sie die Autofluoreszenz in jedem Auge ab, wie gerade gezeigt.

Um die manuelle Dicke der Netzhaut in jedem Bild zu messen, doppelklicken Sie auf den Namen im ersten Versuchstier, um den OCT-Scan zu öffnen. Öffnen Sie einen B-Scan, der mit dem 30- oder 55-Grad-Objektiv aufgenommen wurde, und wählen Sie das Dickenprofil aus. Klicken Sie auf das Symbol Ebenensegmentierungen bearbeiten.

Die Software identifiziert automatisch die inneren Begrenzungs- und Basismembranen. Um die Position der Membranen manuell zu korrigieren, wählen Sie die zu ändernde Ebene sowie die Option für den roten Kreis aus. Halten Sie die Maustaste gedrückt, verschieben Sie den Kreis, um die Linie zu ändern, bis die entsprechende Ebene korrekt positioniert ist, und klicken Sie auf Speichern und schließen, um das Fenster zu schließen.

Wählen Sie unter der Option Ebene die Option Netzhaut aus und klicken Sie auf eine andere Position im Diagramm, um die Netzhautdicke für die ausgewählte Position anzuzeigen. Messen Sie dann die Netzhautdicke und den gewünschten Abstand zum Sehnervenkopf und exportieren Sie die Werte in eine Tabelle. In diesen repräsentativen SD-OCT-Einzelscans einer Maus, die homozygot für die Expression von gfp unter dem Cx3cr1-Promotor ist, ist die retinale Architektur sowohl in den 30-Grad- als auch in den 55-Grad-Linsenbildern deutlich sichtbar.

Bei den Scans, die mit der 30-Grad-Linse aufgenommen wurden, wird jedoch ein hohes Reflexionsvermögen der Aderhaut beobachtet. Nach der SD-OCT ermöglicht die Scanning-Laser-Ophthalmoskopie die Visualisierung der einzelnen gfp-positiven Mikrogliazellen in der Netzhaut mit einer 55-Grad- oder einer 102-Grad-Linse mit einer größeren Fundusflächenabdeckung, die mit der 102-Grad-Linse erzielt wird. In den SD-OCT-Scans wird nach manueller Korrektur der inneren Begrenzung und der Basismembran der Netzhautgrenzen typischerweise eine gute Korrelation der Netzhautdickenmessung zwischen den 30- und 55-Grad-Linsen beobachtet, wenn der gleiche Abstand zum Sehnervenkopf gemessen wird.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als fünfzig Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der experimentellen Ophthalmologie, um die Netzhautpathologie bei kleinen Nagetieren in vivo zu erforschen.