Name: Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging In Vivo: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Rose-Bengal-Photothrombose zur Erforschung ischämischer Schlaganfälle in vivo bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die sofortige Analyse zellulärer Reaktionen nach Thromboseinduktion im somatosensorischen Kortex.

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Die Finanzierung für diese Arbeit wurde bereitgestellt von: AG007218 und NIH F32 AG031606.
Bilder wurden in der Core Optical Imaging Facility erzeugt, die von UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC an UTHSCSA) und NIH-NIA P01AG19316 unterstützt wird.

Hinweis: Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt und wurden im Einklang mit den Leitlinien ANKOMMEN. 1. Anästhesie für Cortical Vorbereitung <ol><li> Platzieren Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 2-3% Isofluran mit Sauerstoff gemischt, um Anästhesie zu induzieren. Beachten Sie die Atemfrequenz ab, wenn die Maus induziert. Klemmen Sie die Pfote der Maus, um festzustellen, ob die Maus ist bereit, an den Nasenkegel bewegen. Hinweis: Anesthesia Ebene ist ein entscheidender Schritt in einer in vivo-Erstellung und darauf zu achten, nicht auf ein Niveau, das globale Ischämie verursachen induzieren. </li><li> Sobald die Maus ausreichend betäubt, übertragen Sie die Tier der Operation / Imaging-Plattform und legen Sie mit der Maus die Nase in der Nasenkegel und gelten 1-1,2% Isofluran, einen betäubten Zustand zu halten. Sicherzustellen, dass die Maus auf eine Temperatur co liegendenntrolled Heizkissen um die Körpertemperatur (37 ° C +/- 0,5 ° C) während der restlichen Verfahren, aufrechtzuerhalten. Zeigen vet Salbe über die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Überwachen Sie die Physiologie der Maus mit einer Pulsoximetrie-System mit dem Schwanz oder Fuß-Clip mit dem System zur Verfügung gestellt. Überprüfen Sie, ob die Atemfrequenz zwischen 50-65 Atemzüge / min gehalten. Überprüfen Sie, ob die Herzfrequenz bleibt zwischen 300 bis 450 bpm und Sauerstoffsättigung wird zwischen 97-98% gehalten, um langfristige Überleben des Tieres zu gewährleisten. </li><li> Wenn die Maus ausreichend betäubt, rasieren die Haare über der Schädeldecke mit elektrischen Haarschneider, entfernen Sie restlichen Haare und sauber und mit Betadin, gefolgt von einer Ethanol-Tupfer. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, um eine sterile OP-Umgebung zu gewährleisten. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren <ol><li> Mit der Kopfhaut vollständig gereinigt und rasiert, einen 5 mm Einschnitt in die Kopfhaut der Maus, um die Schädel fissu zeigenres und Bregma finden. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen der über dem parietalen Kortex mit den stereotaktischen Koordinaten Bregma: -1 bis -3 mm und Quer: 2-4 mm. Hinweis: Der Leim bindet normalerweise innerhalb von 2 min nach dem Aufsetzen des Ringes auf den Knochen. </li><li> Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Unter einem chirurgischer Qualität Binokular, langsam bohren Sie ein 1-2 mm Abschnitt in der Schädeldecke mit einem drehzahlgeregelten dremel artiges Werkzeug (Meisinger 3,9 mm Bohrer) und achten Sie auf den Bereich zu halten, wie es gebohrt wird. Erreichen dies unter Verwendung eines Zick-Zack-Muster. Um Hitze zu vermeiden aufzubauen, setzen Sie den Bohrer Geschwindigkeit niedrig und machen Sie regelmäßig Pausen. </li><li> Wenn der Hirnschädel wird shinny in Erscheinung, auch weiterhin die Ausdünnungdes Schädels mit einer Skalpellklinge unter Verwendung der gleichen Zickzack-Muster, um den ausgedünnten Oberflächen Niveau zu halten, um glatte Entfernung von dünnen Schichten der Hirnschädel zu erleichtern. Mit der Spitze der Skalpellklinge machen kleine lineare Hübe mit leichtem Druck, um dünne Schichten von Knochen zu einer Zeit, zu entfernen. Fahren Sie diese bis zum Gefäßsystem ist eindeutig durch das Binokular sichtbar. </li><li> Wenn der Experimentator durchsticht oder brechen durch den Schädel in der Ausdünnungsverfahren, das Tier einschläfern aufgrund wahrscheinlich Beschädigung des darunterliegenden Kortex. Die Maus-Schädel ist etwa 300 um dick und besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen (eine äußere und eine innere Schicht) und eine Schicht aus Spongiosa zwischen den zwei Schichten aus kompaktem Knochen besteht, sandwichartig angeordnet. Die äußere Schicht kompakten Knochens und die meisten der Spongiosa innerhalb des 5 mm Bohrbereich was zu einer ungefähr 50 &amp; mgr; m-Schicht kompakten Knochens verbleibenden entfernt (siehe 2B). Visualization des Gefäßsystems wird sichergestellt, dass die endgültige verdünnte intakten Schädel ist etwa 50 &amp; mgr; m in der Dicke. Der Schädel ist also noch vorhanden ist, wenn diese Dicke ausgedünnt. </li></ol> 3. Mikroskop Set-up <ol><li> Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop-System (konventionelle konfokale oder Zwei-Photonen-Systeme), die eine Objektivwechselrichter. Anmerkung: Es ist auch möglich, einen Standard aufrechten Mikroskop zu verwenden. Der begrenzende Faktor wird der Raum zwischen der Stufe und den Zielen. Modifikationen an der Bühne kann notwendig sein, um diese Einstellung durchzuführen. </li><li> Sichern Sie die chirurgische / Imaging-Plattform, um eine maßgeschneiderte Bühne, die abgesehen von der Basis des Mikroskops befindet. Anmerkung: Die Plattform ist mit einer Laborbuchse eine Vertikalbewegung des chirurgischen / Imaging Plattform unter dem Ziel ermöglichen gemacht. Die Laborhebebühne ist mit einer Platte, um vier zylindrische Stangen befestigt montiert. (Siehe Abbildung 2). </li><li> Positionieren Sie den Ziel-Wechselrichter, die eine 20-fachZiel im Laufe des Schädelfenster. Verwenden Sie eine externe Lichtquelle, um die Schädelfenster, indem Sie durch die Okulare des Mikroskops zu finden und positionieren Sie das Ziel in der Imaging-Bereich. Hinweis: Der Abbildungsbereich wird durch die Anwesenheit des Gefäßsystems bezeichnet werden. </li><li> Für wasserbasierende Ziele künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH 2 PO 4, 200 mM NaHCO 3, 30 mM HEPES und 100 mM Glucose) als das Medium durch Potential Leckage in die Schädelhöhle während der Abbildung (Abbildung 3). </li></ol> 4. Rose Bengal Dye Vorbereitung, Verwaltung und Induktion von Stroke <ol><li> Eine frische 20 mg / ml Lösung von Rose Bengal in künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF); zu filtern und zu sterilisieren vor der Verabreichung. Nicht wiederverwenden oder lagern Sie das Rose Bengal, sobald sie gemischt hat. Machen Sie eine frische Lösung für jedes Experiment. </li><li> Geben Sie eine 0,1 ml Schwanzveneninjektion von Rose Bengal sKonserven die Schädelfenster mit einem 561-nm-Laser, um eine ausreichende Injektion der Lösung zu gewährleisten. Anmerkung: Bengalrosa wird innerhalb von 5 Sekunden nach Injektion in das Gefäßsystem des Gehirns sichtbar gemacht werden. Der gesamte Behälter sollten mit Rose Bengal gefüllt werden. </li><li> Nach ausreichender Injektion von Rose Bengal-Farbstoff wählen einen geeigneten Behälter für Thrombose basierend auf Gefäßdurchmesser (40-80 um), um die Reproduzierbarkeit einer bestimmten Läsion Volumen zu gewährleisten. Differenzieren zwischen Arterien und Venen, indem man die Richtung des Blutflusses: Arterien von größerem Durchmesser zu kleinerem Durchmesser Schiffe bewegen, bewegen Adern auf einen größeren Durchmesser Gefäße. Dies wird einfach durch Visualisierung bewerkstelligt einmal Rose Bengal eingespritzt wird. </li><li> Ändern Sie den Mikroskop-Einstellung wie folgt: <ol><li> Erhöhen Sie die Verweildauer. Anmerkung: Diese wird in Abhängigkeit von der Mikroskopsystems ausgenutzt variieren. </li><li> Erhöhung der Laserleistung auf 100%. </li><li> Sammeln zeitliche Abfolge Bilder auf 1 Bild / s unter Verwendung dermaximale Scangeschwindigkeit. </li></ol></li><li> Scannen der Maus, bis eine stabile Gerinnsel innerhalb des Behälters gebildet wird. Hinweis: Diese Regel wird innerhalb von 5 min der kontinuierliche Abtastung erreicht (siehe Abbildung 4). </li><li> Im Anschluss an die Induktion der Gerinnselbildung unter Verwendung von Bengalrosa, entfernen Sie die Maus von der Bildfläche zurück in die Binokular. Die Edelstahlring vorsichtig aus der Hirnschädel zu entfernen. Untersuchen Sie die Schädelfenster für jede Blutung. Wenn die Blutung auftritt, beenden das Experiment. </li><li> Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial, um den Einschnitt über den Schädel zu schließen. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie. </li><li> Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen. </li><li> Gibt die Maus auf eine saubere Käfig für weitere Untersuchungen zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 5. Längs Imaging an den folgenden Tagen <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Methoden, um eine Längs Bildgebung bei zukünftigen Tage nach photothrombosis durchzuführen. <ol><li> Betäuben die Maus, wie in Abschnitt 1 der Methoden beschrieben. </li><li> Auf ausreichende Betäubung wieder zu öffnen, die Kopfhaut durch Entfernen alle restlichen Nähte, um die Haut über dem zuvor gebohrten Abbildungsfeld erneut zu öffnen. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen, die über der früheren Bildfeld. </li><li> Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Suchen Sie das Gefäßsystem des zuvor ausgedünnten Schädel zugrunde. Verwenden Schwanzveneninjektion von FITC-Dextran, das Vorhandensein der vorher induzierten Gerinnsel verifizieren. </li><li> Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial die in zu schließenscheidung über den Schädel. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie. </li><li> Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen. </li></ol></li></ol> 6. Prüfung von Stroke Induction (Post-mortem) <ol><li> Am Ende der Studie, überprüfen Schlagvolumen mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung wie in Abbildung 5 dargestellt. Die vollständige Methode kann in 12 gefunden werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Fähigkeit, experimentellem Schlaganfall Pathophysiologie vom Tier zum Menschen Anwendung übersetzen mit Ausfall geplagt. Jedoch ist die Verwendung von Tiermodellen, wie dem photothrombosis Modell ermöglicht ein besseres Verständnis der Pathophysiologie und der Hub der Erforschung neuer Therapieansätze für die Neuroprotektion bereitzustellen nach einem Schlaganfall. Kleine Schlaganfällen und kortikaler Mikroinfarkten durch die photothrombotic Modell produziert werden, sind klinisch relevant subklinischer oder &quot;s...

Die beschriebene Technik ermöglicht die Visualisierung der in vivo zellulären Reaktionen unmittelbar nach der Induktion von Rose Bengal photothrombosis in einer intakten Maus. Rose Bengal (4,5,6,7-Tetrachlor-2 &#39;, 4&#39;, 5 &#39;, 7&#39;-tetraiodofluorescein) ist eine lichtempfindliche Farbstoff verwendet werden, um einen ischämischen Schlaganfall bei Tiermodellen (Maus und Ratte) induzieren. Nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließender Bestrahlung durch einen ausgedünnten Schädel mit einem 564 nm-Laserlicht wird ein Thrombus induzierte verursacht eine physiologische Takt 1. Das Verfahren wurde ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 beschrieben ist, und wurde später von Watson in der Mitte der 1980er Jahre 1,2 angepasst. Kurz gesagt wird Rose Bengal mit grünen Anregungslicht (561 nm-Laser in unserem Fall), welche die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die anschließend aktiviert Gewebefaktor, einen Initiator der Gerinnungskaskade generiert bestrahlt. Die Induktion der Koagulationskaskade erzeugt eine ischämische lesIonen, die pathologisch relevanten klinischen Schlaganfall 3 ist. Hub hat eine komplexe Pathophysiologie aufgrund des Zusammenspiels von vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Endothel und das Immunsystem. Die Auswahl der besten Technik zu studieren, ein bestimmter zellulärer Prozess erfordert mehrere Überlegungen. Experimentelle Techniken fallen grob in eine von drei Kategorien: in vitro, in vivo und in silico mit mit jeweils Vor- und Nachteile In-vitro-Studien haben den Hauptnachteil Entfernung von Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und daher nicht Effekte in einer intakten gesehen reproduzieren. lebenden Tier. In-vivo-Techniken für eine verbesserte experimentelle Replikation von Krankheitszuständen mit erhöhter Translations Bedeutung. In silico bezieht sich allgemein auf Computermodellierung von einer Erkrankung oder eines zellulären Prozess, und während zunehmend genutzt, um potenzielle Wechselwirkungen für die Prüfung lernenweise alle Informationen zusammengetragen sind immer noch in lebenden Zellen oder Gewebe getestet werden. Das ideale Modell für Schlaganfall in der Laborumgebung sollte ähnlich pathologischen Merkmale mit den in der menschlichen Bevölkerung gesehen zeigen. Zwar gibt es gemeinsame physiologische Eigenschaften von Schlaganfall in der menschlichen Bevölkerung, gibt es auch viele Unterschiede in Abhängigkeit von der Art der Verletzung erfahren. Stroke in der menschlichen Bevölkerung tritt als kleine oder große Gefäßverschlüssen, hämorrhagische Läsionen und Arterie zu Arterie oder Herz-Kreislauf-Embolien, die in vielfältigen Infarktvolumen als auch Unterschiede in Mechanismen, um jede Pathologie führen. Der Vorteil der Verwendung von Tiermodellen Schlaganfall ist die Erzeugung von reproduzierbaren Infarkten, die Eigenschaften des menschlichen Schlaganfall zu imitieren. Die häufigsten Tiertaktmodelle umfassen Arterienverschluss mit: A. cerebri media Okklusion (Embolie oder endovaskuläre Filament-Verfahren), welche Modelle distalen MCAO und die photothrombosis Modell. Die Vorteile einerd Nachteile der einzelnen Modelle wurden an anderer Stelle (siehe 4 und 5). Globale ischämischen Modellen (MCAO), während relativ einfach durchzuführen sind weniger relevant für die menschliche Schlaganfall sind als Brenntaktmodelle. Darüber hinaus sind diese Verfahren sehr variabel zu induzieren reproduzierbare Hirninfarkt Läsionen. Die photothrombosis Modell ist sehr gut reproduzierbar, solange der Experimentator steuert ihre Experimente gut und bietet einen klaren Vorteil gegenüber MCAO-Modelle. Aufgrund Mikrovaskulatur Beleidigung das Modell ist beschrieben worden, um eine minimale ischämischen Penumbra, das Gebiet, in dem Zellen dachte salvageable 6,7 zu sein anzuzeigen. Zusätzlich kann ein vasogenes Ödem und zytotoxische Ödembildung auch nach einer Bestrahlung der Bildfläche induziert werden. Trotz dieser Einschränkungen ist die Technik neue Einblicke in vielen physiologischen Prozessen nach Schlaganfall 8, 9, 10, 11 vorgesehen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td></td><td>Sigma 330000</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran Anästhetikum</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>088-076</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>aCSF&nbsp;</td><td>126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM Glukose und 26 mM NaHCO3 (pH 7,4).</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Bioindustrial Products</td><td>500-410</td><td></td></tr><tr><td>Operationsschere 14 cm</td><td>Bioindustrial Products</td><td>12-055</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont High Tech #5 Style, gerade</td><td>Bioindustrial Products</td><td>TWZ-301.22</td><td></td></tr><tr><td>LabJack 132X80</td><td>Optosigma Co</td><td>123-6670</td><td></td></tr><tr><td>Plattform für Labjack 8X 8</td><td>Optosigma Co</td><td>145-1110</td><td></td></tr><tr><td>Ohrstangenhalter aus stereotaktischem Setup</td><td>Stoelting/Cyborg</td><td>51654</td><td></td></tr><tr><td>Dispomed Labvent Nagetier-Anästhesiegerät</td><td>DRE, Inc.</td><td>15001</td><td></td></tr><tr><td>Tech IV Isofluran-Verdampfer</td><td>DRE, Inc.</td><td>34001</td><td></td></tr><tr><td>F Luftbehälter</td><td>DRE, Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Beatmungsschlauch für den Wasserkreislauf</td><td>DRE, Inc</td><td>86111B</td><td></td></tr><tr><td>Nagetieradapter für Wannenschlauch</td><td>DRE, Inc</td><td>891000</td><td></td></tr><tr><td>O2 Regler für Sauerstofftanks</td><td>DRE, Inc</td><td>CE001E</td><td></td></tr><tr><td>Induktionskammer für Nagetiere</td><td>DRE, Inc</td><td>15004C</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Silk 6-0; 18 Zoll mit P-3 Nadel</td><td>Naht Express</td><td>1639G</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv Wechselrichter Optischer Adapter</td><td>LSM Technologien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorlaufbohrer Dual voltage 110/120</td><td>Foredom</td><td>134.53</td><td></td></tr><tr><td>Meisinger 3.9 mm Bohrer</td><td>Meisinger</td><td></td> <td>(Ref#310 104 001 001 009)</td></tr></tbody></table>

rose bengal photothrombosis von konfokalen optischen imaging<em&gt; in vivo</em&gt;: ein modell des einzelfahrzeug stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo Bildgebungsverfahren haben aufgrund der jüngsten Fortschritte bei bildgebenden Farbstoffen und optischen Technologien zugenommen, die die Möglichkeit ermöglichen, zelluläre Ereignisse in einem intakten Tier abzubilden. Darüber hinaus erhöht die Fähigkeit, physiologische Krankheitszustände wie Schlaganfall in vivo zu induzieren, deren Nutzen. Die hierin beschriebene Technik ermöglicht eine physiologische Beurteilung der zellulären Reaktionen innerhalb des ZNS nach einem Schlaganfall und kann für andere pathologische Zustände, die untersucht werden, angepasst werden. Die vorgestellte Technik verwendet die Laseranregung des lichtempfindlichen Farbstoffs Rose Bengal in vivo, um ein fokales ischämisches Ereignis in einem einzelnen Blutgefäß zu induzieren. 
Das Videoprotokoll zeigt die Vorbereitung eines dünnschädeligen Schädelfensters über dem somatosensorischen Kortex bei einer Maus für die Induktion eines photothrombotischen Ereignisses in Rose Bengal, wodurch die Schädigung der zugrunde liegenden Dura-Materie und des Gehirns auf ein Minimum reduziert wird. Die chirurgische Vorbereitung wird zunächst unter einem Präpariermikroskop mit einer speziell angefertigten chirurgischen/bildgebenden Plattform durchgeführt, die dann auf ein konfokales Mikroskop übertragen wird, das mit einem inversen Objektivadapter ausgestattet ist. Repräsentative Bilder, die mit diesem Protokoll aufgenommen wurden, werden ebenso präsentiert wie Zeitraffersequenzen der Schlaganfallinduktion. Diese Technik ist insofern leistungsfähig, als derselbe Bereich an den folgenden Tagen wiederholt abgebildet werden kann, was longitudinale In-vivo-Studien zu pathologischen Prozessen nach einem Schlaganfall erleichtert.

Das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Schlaganfall in Tiermodellen (Maus und Ratte) nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließende Beleuchtung einer dünnt Schädel mit einem 561 nm Laserlicht zu induzieren. Die Bilder in Figur 4 zeigen den Verlauf der Gerinnselbildung in einem einzigen Gefäß nach Bestrahlung des Bereichs auf 0, 1, 1,5 und 2 min. Vor der Gerinnselbildung der gesamte Behälter ist weiß aufgrund fließt Rose Bengal zu befreien. Nach der Induktion der Bestrahlung de...

Hier beschreiben wir einen semi-invasiven optischen Mikroskopie-Ansatz zur Induktion eines photothrombotischen Gerinnsels in der somatosensorischen Hirnrinde einer Maus in vivo. Es werden die technischen Aspekte des bildgebenden Verfahrens von der Induktion eines photothrombotischen Ereignisses über die Anwendung bis hin zur Datenerhebung beschrieben.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines halb invasiven optischen Mikroskopieansatzes einen Rose-Bengal-basierten Fotothrombus im somatosensorischen Kortex einer Maus zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem die Maus anästhesiert und ein dünner Schädelknochenfenster für die Bildgebung präpariert wird. Anschließend wird Rose Bengal injiziert und mittels eines Lasers eine Fotothrombose induziert.Schließlich können die Auswirkungen des durch die Rose-Bengal-Photothrombose erzeugten Gerinnsels unmittelbar nach der Erholung von der Anästhesie analysiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass unmittelbar nach Induktion der Rose-Bengal-Photothrombose die zellulären Reaktionen in vivo beobachtet werden können. Personen, die mit dieser Technik neu sind, könnten Schwierigkeiten haben, das dünne Schädelknochen-Fenster anzulegen, da dies schwierig und zeitaufwändig ist.Betäuben Sie die Maus zunächst mit zwei bis 3 % Isofluran, das mit Sauerstoff gemischt ist. Achten Sie auf eine Abnahme der Atmung, während die Maus eingeleitet wird. Danach quetschen Sie die Pfote der Maus. Um den Narkosezustand zu bestätigen, verwenden Sie eine Heizplatte und eine Temperatursonde, um die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs innerhalb eines halben Grades von 37 °C zu halten. Tragen Sie dann einen Augensalbe auf, um die Vitalfunktionen des Tieres zu überwachen. Befestigen Sie ein Oximetriesystem am Schwanz oder Fuß. Pasen Sie das Anästhetikum so an, dass 50 bis 65 Atemzüge pro Minute und eine Herzfrequenz zwischen 300 und 450 Schlägen pro Minute aufrechterhalten werden. Die Sauerstoffsättigung sollte idealerweise bei 97 bis 98 % liegen. Wenn alle diese Parameter eingehalten werden, ist ein Langzeitüberleben möglich. Bereiten Sie abschließend die Haut für den chirurgischen Eingriff vor.Rasieren Sie das Haar vom Schädel ab und reinigen Sie die Haut durch wiederholtes Abreiben mit Betadine, gefolgt von Ethanol. Beginnen Sie die Operation mit einem fünf Millimeter langen Schnitt in die Kopfhaut, um die Schädelnaht freizulegen. Entfernen Sie die darüberliegende Faszie mit einem Wattestäbchen und lokalisieren Sie das bgma.Nächster Schritt: Kleben Sie einen maßgefertigten Edelstahlring auf den Knochen über dem Parietalkortex. Bestimmen Sie diese Position ausgehend vom BMA, indem Sie horizontal minus ein bis drei Millimeter und lateral plus zwei bis vier Millimeter verschieben.Nach zwei Minuten ist der Kleber ausgehärtet. Befestigen Sie dann den Ring an einem stereotaktischen Halter, um das Tier zu stabilisieren. Arbeiten Sie nun unter einem Operationsmikroskop und bohren Sie langsam einen ein bis zwei Millimeter großen Bereich im Schädel über dem somatosensorischen Kortex aus. Verwenden Sie dabei ein Zick-Zack-Bohrmuster, und achten Sie darauf, den Schädel während des Bohrens eben zu halten, um eine Wärmeansammlung zu verhindern.Verwenden Sie den Bohrer mit geringer Geschwindigkeit und machen Sie häufig Pausen, sobald der Knochen zu glänzen beginnt. Setzen Sie das Bohren mit dem Zickzackmuster fort, um den Schädel zu verdünnen. Ein dünnes Schädel Fenster ist entscheidend, damit der Laser das mit Rose Bengal gefüllte Gefäß erreicht und den Gerinnsel auslöst.Wenn das Fenster dünn genug ist, verwenden Sie ein Skalpell, um mit leichtem Druck kleine lineare Striche anzubringen und dünne Knochenlagen zu entfernen, bis die Gefäße durch das Okular deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie ein Mikroskop mit ausreichendem Abstand zwischen Objektiv und Objekttisch, um das Tier auf seiner Plattform abbilden zu können. Ein umgekehrtes Mikroskop ist eine gute Wahl.Die Plattform ist so konzipiert, dass sie in eine angepasste Halterung passt, die aus einem über eine Platte mit vier Stangen befestigten Hubzylinder besteht. Nachdem die Maus auf der Halterung positioniert wurde, platzieren Sie den Objektivinverter über dem Schädel-Fenster und beleuchten Sie den Schädel mithilfe einer externen Lichtquelle. Falls ein wasserbasiertes Objektiv verwendet wird, sollte künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) in den Hohlraum des Schädel-Fensters appliziert werden, in den das Objektiv abgesenkt werden kann.Konzentrieren Sie sich nun auf den Bildgebungsarea mit sichtbarer Gefäßstruktur. Nachdem die Maus am Mikroskop positioniert wurde, bereiten Sie frisches Rosenbengal in künstlichem CSF mit 20 Milligramm pro Milliliter frisch zu, sterilisieren die Mischung und entsorgen sie nach Abschluss des Experiments. Es muss stets frisch verwendet werden.Scannen Sie nun mit einem 561-Nanometer-Laser das Schädel-Fenster ab und injizieren Sie 0,1 Milliliter der Mischung über die Schwanzvene. Innerhalb von fünf Sekunden sollte der Farbstoff in der Schädelgefäßen leicht sichtbar sein. Nach ausreichender Injektion des Farbstoffs wählen Sie ein 40 bis 80 Mikrometer großes Gefäß für die Thrombose aus.Arterien können anhand des Flusses von größeren zu kleineren Gefäßen und umgekehrt von Venen unterschieden werden. Bereiten Sie nun das Beschießen des ausgewählten Gefäßes mit dem Laser vor. Erhöhen Sie die Belichtungszeit entsprechend dem verwendeten System.Erhöhen Sie die Laserleistung auf 100 % und stellen Sie die Bildaufnahme auf einen Frame pro Sekunde ein. Scannen Sie die Maus mit maximaler Scan-Geschwindigkeit, bis ein Harnstoff-Gerinnsel entsteht. Dies dauert gewöhnlich etwa fünf Minuten.Im Idealfall sollte nur ein Sichtfeld gescannt werden, um den Gerinnsel zu erzeugen; wählen Sie das Objektiv entsprechend aus. Falls kein Gerinnsel entsteht, versuchen Sie, nach der Bildung des Gerinnsels mehr Farbstoff zu verwenden. Entfernen Sie die Maus aus dem Bildgebungsarea und bereiten Sie sich darauf vor, die Operation unter dem Stereomikroskop abzuschließen.Entfernen Sie zunächst vorsichtig den Ring, wobei auf Blutungen geachtet werden muss. Tritt eine Blutung auf, muss das Experiment beendet werden. Schließen Sie anschließend die Inzision mit einer Sechser-Naht, und tragen Sie dann ein Antibiotikum auf die Inzisionsstelle zur Schmerzlinderung auf.Verabreichen Sie drei Tage lang subkutane Injektionen von bup printex, nachdem die erste Injektion von bnx verabreicht wurde. Stellen Sie die Maus in eine Erholungskammer und überwachen Sie sie, bis sie wieder mobil ist. Anschließend kehren Sie sie in ihren Heimkäfig zurück, der gereinigt werden sollte.Die longitudinale Bildgebung ist im Textprotokoll ausführlich beschrieben. Mithilfe dieses Protokolls wurden Schlaganfälle durch Bildung von Gerinnseln in den Hirngefäßen ausgelöst. Die Gerinnselbildung setzte sich über mehrere Minuten fort.Anfangs war das Gefäß vollständig weiß, wobei frei fließendes Rosenrot B allmählich bestrahlt wurde; die Bestrahlung des Farbstoffs erzeugte reaktive Sauerstoffspezies und aktivierte dadurch eine Immunantwort, die zur Bildung eines Gerinnsels führte. Eine vollständige Okklusion des Gefäßes wurde durch die Ansammlung von Rosenrot B im Gefäßabschnitt vor dem Gerinnsel festgestellt. Um zu bestätigen, dass durch das Blutgerinnsel ein ischämischer Schlaganfall ausgelöst wurde.Die TTC-Färbung wurde verwendet, um eine zerebrale Infarktion nachzuweisen. Gesundes Gewebe bildet rote Formazanprodukte. Während infarzierte Bereiche nicht reagieren und weiß bleiben, war der Nachweis eines Schlaganfalls fünf Tage nach dem Eingriff deutlich sichtbar.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Maus vorbereitet und eine Rose-Bengal-Photothrombose in einer intakten Maus gemäß diesem Verfahren induziert. Andere Methoden, wie das Beladen des Gehirns mit weiteren Bildgebungsfarbstoffen wie beispielsweise Flow Four, könnten dabei helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa: Wie reagiert Kalzium auf ein ischämisches Ereignis?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Talley Watts, L., et al. Rose Bengal Photothrombose durch konfokale optische Bildgebung In vivo: Ein Modell des Schlaganfalls mit einem Gefäß. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt eine Technik, um die Bildung von Blutgerinnseln in einem Mäusegehirn zu induzieren. Eine anästhesierte Maus mit einem Schädelfenster und einem ausgedünnten Schädel erleidet eine Photothrombose durch die Aktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoffs unter Verwendung von hochintensivem Licht. Dieser Prozess...

 Induktion der Bildung von Blutgerinnseln im Gehirn von Mäusen mit einem lichtempfindlichen Farbstoff

Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Traditionelle photothrombotische Schlaganfallmodelle (PTS) induzieren hauptsächlich dichte Thrombozytenaggregate mit einer hohen Resistenz gegen eine lytische Behandlung mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA). Hier wird ein modifiziertes murines PTS-Modell durch Co-Injektion von Thrombin und lichtempfindlichem Farbstoff zur Photoaktivierung eingeführt. Das Thrombin-verstärkte PTS-Modell erzeugt gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel und ist hochempfindlich gegenüber tPA-Thrombolyse.

Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell

Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für den retinalen Venenverschluss unter Verwendung von Rose Bengal und einem lasergesteuerten retinalen Bildgebungsmikroskopsystem mit Empfehlungen zur Maximierung der Reproduzierbarkeit in gentechnisch veränderten Stämmen.

Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

Diese Arbeit demonstriert den Einsatz einer multimodalen ultraschallbasierten Bildgebungsplattform für die nicht-invasive Bildgebung des ischämischen Schlaganfalls. Dieses System ermöglicht die Quantifizierung der Sauerstoffsättigung des Blutes durch photoakustische Bildgebung und die Beeinträchtigung der Durchblutung im Gehirn durch akustische Angiographie.

Integrierte photoakustische, Ultraschall- und Angiographietomographie (PAUSAT) für die nicht-invasive Ganzhirnbildgebung des ischämischen Schlaganfalls

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Unter Verwendung eines rein optischen Ansatzes wird ein ischämischer Schlaganfall induziert, während gleichzeitig die neuronaleCa2+ -Aktivität mit einem fluoreszierenden Biosensor im entstehenden Schlaganfallkern einer wachen, sich verhaltenden Maus aufgezeichnet wird.

Gleichzeitige Photothrombose und Faserphotometrie zur Induktion und Überwachung eines ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen, die sich verhalten

Dieses Protokoll bietet eine integrierte Methode, die virale Abgabe, Optrodenimplantation, photothrombotische Induktion, gleichzeitige Aufzeichnung der Astrozyten- und neuronalen Aktivität sowie optogenetische Stimulation von Astrozyten umfasst. Diese integrierte Methode zielt darauf ab, eine parallele Untersuchung der Astrozyten-Neuron-Beziehung über die akuten bis chronischen Stadien des ischämischen Schlaganfalls zu ermöglichen.

Eine integrierte Methode zur photothrombotischen Schlaganfallmodellierung und zur in-vivo-Optrodenerfassung neuronaler und astrozytischer Aktivität bei sich wirkenden Mäusen

Erfahren Sie die Rose-Bengal-Photothrombose zur Erforschung ischämischer Schlaganfälle in vivo bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die sofortige Analyse zellulärer Reaktionen nach Thromboseinduktion im somatosensorischen Kortex.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging

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