Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging In Vivo: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe einer semi-invasiven optischen Mikroskopie ein photothrombotisches Gerinnsel im somatosensorischen Kortex einer Maus zu induzieren. Dies wird erreicht, indem die Maus betäubt und ein dünnes Schädelschädelfenster für die Bildgebung vorbereitet wird. Als nächstes wird die Bengalrose injiziert und mit einem Laser eine Photothrombose induziert.

Letztendlich können die Auswirkungen des Gerinnsels, das durch die Bengal-Photothrombose der Rose gebildet wird, sofort nach der Genesung aus der Narkose analysiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, zelluläre Reaktionen in vivo unmittelbar nach der Induktion einer bengalischen Photothrombose zu sehen. Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, das dünne Schädelschädelfenster zu erstellen, da dies schwierig und zeitaufwändig ist.

Zu Beginn betäuben Sie die Maus mit zwei bis 3% Fluor, gemischt mit Sauerstoff. Achten Sie auf eine Abnahme der Atmung, wenn die Maus induziert wird. Kneifen Sie dann die Pfote der Maus zusammen.

Um den Narkosezustand zu bestätigen, verwenden Sie ein Heizkissen und einen Temperaturfühler, um die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs innerhalb eines halben Grades von 37 Grad Celsius zu halten. Tragen Sie dann eine Augensalbe auf, um die Vitalwerte des Tieres zu überwachen. Befestigen Sie ein Oximetriesystem am Schwanz oder Fuß.

Stellen Sie das Anästhetikum so ein, dass 50 bis 65 Atemzüge pro Minute und eine Herzfrequenz zwischen 300 und 450 Schlägen pro Minute aufrechterhalten werden. Die Sauerstoffsättigung wird idealerweise bei 97 bis 98 % gehalten, wenn alle diese Parameter eingehalten werden, ist ein langfristiges Überleben möglich. Bereiten Sie zum Schluss die Haut auf die Operation vor.

Rasieren Sie das Haar vom Schädel und schrubben Sie wiederholt Betadine, gefolgt von Ethanol, um die Haut zu reinigen. Beginnen Sie die Operation mit einem fünf Millimeter großen Schnitt in die Kopfhaut, um die Schädelfissur freizulegen. Entfernen Sie die darüber liegende Faszie mit einem Wattestäbchen und lokalisieren Sie das bgma.

Nächster Kleber. Ein maßgefertigter Ring aus Edelstahl am Knochen, der über der parietalen Rinde liegt. Bilden Sie diese Position vom bma aus ab, indem Sie sich horizontal um ein bis drei Millimeter negativ und zwei bis vier Millimeter lateral positiv bewegen.

Nach zwei Minuten ist der Kleber ausgehärtet. Befestigen Sie dann den Ring an einer stereotaktischen Halterung, um das Tier zu stabilisieren. Bohren Sie nun unter einem chirurgischen Präpariermikroskop langsam einen ein bis zwei Millimeter großen Schnitt in den Schädel über dem somatosensorischen Kortex. Achten Sie bei einem Zick-Sag-Bohrmuster darauf, den Schädel beim Ausbohren waagerecht zu halten, um einen Hitzestau zu vermeiden.

Verwenden Sie den Bohrer bei niedriger Geschwindigkeit und machen Sie häufige Pausen, wenn der Knochen zu glänzen beginnt. Bohren Sie weiter mit dem Zickzackmuster, um den Schädel auszudünnen. Ein dünnes Schädelfenster ist entscheidend dafür, dass der Laser das mit Rosenbengalen gefüllte Gefäß erreicht und das Gerinnsel induziert.

Wenn das Fenster dünn genug ist, machen Sie mit einem Skalpell kleine lineare Striche mit leichtem Druck, um dünne Knochenschichten zu entfernen, bis das Gefäßsystem durch das Okular deutlich sichtbar ist. Um das Gehirn abzubilden, verwenden Sie ein Mikroskop, das zwischen dem Objektiv und dem Tisch genügend Platz hat, um das Tier auf seine Plattform zu setzen. Ein invertiertes Zielfernrohr ist eine gute Wahl.

Die Plattform ist so konzipiert, dass sie in eine kundenspezifische Bühne passt, die aus einer Buchse besteht, die an einer vierpoligen Platte montiert ist. Nachdem die Maus auf dem Tisch positioniert wurde, positionieren Sie den Objektivwechselrichter über dem Schädelfenster und beleuchten Sie den Schädel mit einer externen Lichtquelle. Wenn ein Objektiv auf Wasserbasis verwendet wird, sollte künstlicher Liquor auf die Schädelfensterhöhle aufgetragen werden, in die das Objektiv abgesenkt werden kann.

Fokussieren Sie sich nun auf den bildgebenden Bereich mit sichtbaren Gefäßen. Nachdem die Maus am Mikroskop aufgestellt wurde, bereiten Sie frische Rose Bengal in künstlichem Liquor bei 20 Milligramm pro Milliliter Filter vor, sterilisieren Sie die Mischung und entsorgen Sie sie nach Abschluss des Experiments. Es muss immer frisch verwendet werden.

Beim Scannen des Schädelfensters mit einem 561 Nanometer großen Laser werden nun 0,1 Milliliter des Gemisches über die Schwanzvene injiziert. Innerhalb von fünf Sekunden sollte der Farbstoff im kranialen Gefäßsystem gut sichtbar sein. Nachdem ausreichend Farbstoff injiziert wurde, wählen Sie ein 40 bis 80 Mikron großes Gefäß für die Thrombose.

Arterien können von Venen anhand des Flusses von größeren zu kleineren Gefäßen und umgekehrt unterschieden werden. Bereiten Sie nun das Lasern des ausgewählten Gefäßes vor. Erhöhen Sie die Verweilzeit auf das für das verwendete System geeignete Maß.

Erhöhen Sie die Laserleistung auf 100 % und stellen Sie die Bildsammlung auf ein Bild pro Sekunde ein. Scannen Sie die Maus bei maximaler Scangeschwindigkeit, bis sich ein Klammergerinnsel gebildet hat. In der Regel dauert dies etwa fünf Minuten.

Idealerweise sollte nur ein Sichtfeld gescannt werden, um das Gerinnsel zu erzeugen, wählen Sie das Objektiv entsprechend. Wenn sich kein Gerinnsel bildet, versuchen Sie, mehr Farbe zu verwenden, sobald sich das Gerinnsel gebildet hat. Entfernen Sie die Maus aus dem Bildgebungsbereich und bereiten Sie sich auf den Abschluss der Operation unter dem Präpariermikroskop vor.

Entfernen Sie zuerst vorsichtig den Ring, während Sie ihn auf Blutungen prüfen. Tritt eine Blutung auf, muss der Versuch abgebrochen werden. Schließen Sie anschließend mit einer Naht von sechs oh den Schnitt und tragen Sie dann ein Antibiotikum zur Schmerzlinderung auf die Schnittlinie auf.

Geben Sie drei Tage lang nach der ersten Injektion von bnx subkutane Injektionen von bup printex. Legen Sie die Maus in eine Auffangkammer und überwachen Sie sie, bis sie ambulant ist. Bringen Sie es dann in seinen Heimatkäfig zurück, der gereinigt werden sollte.

Die longitudinale Bildgebung ist im Textprotokoll detailliert beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden Schlaganfälle durch Bildung von Gerinnseln mit Schädelgefäßen induziert. Die Gerinnselbildung schritt über mehrere Minuten fort.

Anfangs war das Gefäß komplett weiß mit frei fließender Rose Bengalen. Nach und nach erzeugte die Bestrahlung des Farbstoffs reaktive Sauerstoffspezies und aktivierte so eine Immunantwort, die die Gerinnselbildung induzierte. Ein vollständiger Verschluss des Gefäßes wurde durch eine Akkumulation von Rose Bengal im Gefäß stromaufwärts des Gerinnsels festgestellt. Zur Bestätigung, dass ein ischämischer Schlaganfall durch das Blutgerinnsel ausgelöst wurde.

Die TTC-Färbung wurde verwendet, um einen Hirninfarkt zu erkennen. Gesundes Gewebe bildet rote Form auf Produkten. Während infarktierte Bereiche nicht reagieren und weiß bleiben, waren die Anzeichen eines Schlaganfalls fünf Tage nach dem Eingriff deutlich erkennbar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Maus vorbereitet und eine rosafarbene bengalische Photothrombose bei einer intakten Maus nach diesem Verfahren induziert. Andere Methoden, wie z. B. das Beladen des Gehirns mit anderen bildgebenden Farbstoffen, wie z. B. Flow vier, könnten helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Wie reagiert Kalzium auf ein ischämisches Ereignis?