Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, pflanzliche Zellwandpolysaccharide zu charakterisieren. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der pflanzlichen Zellwandbiologie zu beantworten, einschließlich der Struktur und Menge von Glucomannanen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine spezielle Schulung oder teure Ausrüstung erforderlich ist.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Interpretation der Gele, daher ist die Einbeziehung und das Verständnis aller beschriebenen Kontrollen von entscheidender Bedeutung. Der Alkohol und der lösliche Rückstand (AIR) werden zuvor aus geerntetem Pflanzenmaterial hergestellt, wie im Textprotokoll beschrieben. Wiegen Sie sechs Milligramm AIR in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie Wasser bis zu einer Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter hinzu.

Vortex, um eine gleichmäßige Aufhängung zu erreichen. Aliquotieren Sie 500 Mikrogramm in Mikrofuge-Röhrchen. Trocknen Sie die Aliquote mit einer Vakuumzentrifuge bei 30 Grad Celsius über Nacht.

Die AIR einschließlich eines Aliquots für eine enzymfreie AIR-Kontrolle eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem molaren Natriumhydroxid vorbehandeln. Geben Sie nach einer Stunde 200 Mikroliter Wasser und 20 Mikroliter eines molaren Salzsäures in jedes Röhrchen, um das Natriumhydroxid zu neutralisieren. Testen Sie, ob der pH-Wert etwa sechs bis sieben beträgt, indem Sie einen Mikroliter entfernen und auf die Papier-pH-Indikatorstreifen aufbringen.

Geben Sie 50 Mikroliter eines molaren Ammoniumacetatpuffers mit einem pH-Wert von 6,0 und fügen Sie Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern in jedes Röhrchen hinzu. Um dieses Verfahren zu starten, fügen Sie eine vorgegebene Menge an Mannanasen zu den AIR-Aliquoten und dem Puffer hinzu. Geeignete Negativkontrollen sowie eine Positivkontrolle einschließen.

Vortexen und dann kurz drehen, um das Reaktionsgemisch am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren über Nacht. Stoppen Sie die Reaktion am nächsten Tag, indem Sie 20 Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubieren.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei maximaler Drehzahl. Bewahren Sie den Überstand auf und suspendieren Sie jedes Pellet in 250 Mikrolitern Wasser. Erneut zentrifugieren und den Überstand zurückhalten.

Beide Überstände vermischen und in einer Vakuumzentrifuge bei 30 Grad Celsius etwa drei Stunden trocknen. Bereiten Sie vor dem Derivatisierungsverfahren die erforderlichen Reagenzien vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Erwärmen Sie die Stammlösung von 0,2 molaren ANTS auf 60 Grad Celsius, um den Feststoff vollständig aufzulösen.

Zu jeder Probe werden fünf Mikroliter ANTS, fünf Mikroliter zwei Picoline-Boran und 10 Mikroliter Derivatisierungspuffer hinzugefügt. Schleudern Sie kurz, um sich am Boden der Röhre zu sammeln, wirbeln Sie gründlich durch und drehen Sie sich dann wieder kurz. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius lichtgeschützt.

Am Folgetag trocknen Sie die Proben in einer Vakuumzentrifuge bei 30 Grad Celsius für etwa zwei Stunden. Jede Probe wird in Oligosaccharidstandard und 100 Mikrolitern dreimolaren Harnstoff resuspendiert. Bei minus 20 Grad Celsius lichtgeschützt lagern, bis es benötigt wird.

Die Montage der Gelgussausrüstung hängt von der Marke ab. Für die in dieser Demonstration verwendeten Geräte entspricht ein Gel 50 Millilitern. Mischen Sie in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen 20,2 Milliliter Wasser, fünf Milliliter 10x PACE-Puffer, 24,6 Milliliter 40%iges Acrylamid/Bis-Acrylamid, 200 Mikroliter APS und 20 Mikroliter TEMED.

Zum Mischen vorsichtig umdrehen und darauf achten, dass keine Luftblasen entstehen. Gießen Sie das auflösende Gel mit einer serologischen oder anderen großvolumigen Pipette etwa vier Zentimeter unter die Oberseite der Glasplatten. Überziehen Sie das Gel vorsichtig mit Isopropylalkohol.

Lassen Sie das Gel 20 bis 30 Minuten lang polymerisieren. Gießen Sie die oberste Schicht ab. Trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Löschpapier ab.

Stellen Sie als Nächstes das Stapelgel her. Mischen Sie in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen 6,8 Milliliter Wasser, einen Milliliter 10x PACE-Puffer, 2,8 Milliliter Acrylamid/Bis-Acrylamid, 80 Mikroliter APS und acht Mikroliter TEMED. Zum Mischen invertieren und auf das polymerisierte Auflösungsgel auflegen.

Führen Sie den Kamm vorsichtig ein und vermeiden Sie es, Luftblasen unter den Kammzähnen einzuschließen. Nachdem das Gel polymerisiert ist, wickeln Sie es in feuchtes Tuch und dann in Plastikfolie und lagern Sie es bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Um den Überblick über die Ladereihenfolge zu behalten und zu erkennen, wo sich die Vertiefungen befinden, nachdem der Kamm entfernt wurde, verwenden Sie einen Permanentmarker, um die Positionen der Vertiefungen auf dem Glas zu beschriften.

Den Kamm entfernen. Füllen Sie die Vertiefungen mit einem X PACE-Puffer. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Mikrospritze, um zwei Mikroliter Standards und Proben in die Vertiefungen zu laden.

Vermeiden Sie die Verwendung der äußersten Spuren, die dazu neigen, Samples schlecht abzuleiten, und lassen Sie eine leere Spur zwischen den Samples. Montieren Sie die obere Kammer des Gel-Laufgeräts und geben Sie das Gel in einen gekühlten Lauftank mit one-X PACE-Puffer. Füllen Sie die obere Kammer mit one-X PACE Puffer.

Schalten Sie das Gerät ein und lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 200 Volt laufen. Erhöhen Sie nach 30 Minuten die Spannung für eine Stunde und 40 Minuten auf 1.000 Volt. Schützen Sie das Gel vor Licht.

Wischen Sie zunächst das Gel-Imaging-System mit feuchtem, fusselfreiem Tuch ab, um sicherzustellen, dass es staubfrei ist. Nehmen Sie das Gel aus dem PACE-Tank und betrachten Sie es kurz, während sich das Gel noch in den Glasplatten befindet, um festzustellen, ob sich die Farbstofffront noch auf dem Gel befindet. Verwenden Sie ein Keilwerkzeug, um das Gel zu öffnen, und während sich das Gel noch auf einer Glasplatte befindet, verwenden Sie einen Pizzaschneider, um sowohl das Stapelgel als auch den Boden des Gels zu entfernen, wenn sich die Farbstofffront noch auf dem Gel befindet.

Geben Sie etwa fünf Milliliter Wasser auf die Oberfläche des Transilluminators und übertragen Sie das Gel dann direkt auf den Transilluminator. Stellen Sie mit der Software den Filter auf UV 605 ein und schalten Sie den langwelligen UV-Transilluminator ein. Nehmen Sie mehrere Bilder mit unterschiedlichen Belichtungszeiten auf und achten Sie darauf, das UV-Licht zwischen den Bildern auszuschalten, um eine Verschlechterung der Fluoreszenz zu vermeiden.

Stellen Sie sicher, dass mindestens zwei der Bilder keine gesättigten Bänder aufweisen. Speichern Sie die Dateien als hochauflösende TIFF-Bilder. Gezeigt wird ein repräsentatives Gel eines Standard-PACE-Assays für den Mannangehalt an der Zellwand.

Die Bahnen eins, zwei und drei zeigen eine Leiter von kommerziell gekauften Oligosacchariden mit einer Konzentration von fünf, 10 bzw. 50 Picomolen. Spur vier zeigt einen Mannanase-Verdau von Konjak-Glucomannan, der als Positivkontrolle sowohl für den enzymatischen Aufschluss als auch für die Derivatisierungsreaktion in Gegenwart des Enzyms und der Puffersalze dient. Bahn fünf zeigt den PACE-Fingerabdruck eines Wildtyp-Arabidopsis-Stammes.

Spur sechs zeigt den PACE-Fingerabdruck des Stängels einer Arabidopsis-Pflanze, der die Mannan-Synthase des Hauptstamms fehlt. Im Vergleich zum Wildtyp ist nur eine geringe Menge an Mannan vorhanden, was durch die reduzierten Bandenintensitäten für alle Mannanase-abgeleiteten Oligosaccharide belegt wird. Spur 10 zeigt den PACE-Fingerabdruck von Kiefernholz, das Galactoglucomannan enthält und ein Muster an freigesetzten Oligosacchariden aufweist, das sich deutlich von dem von Arabidopsis unterscheidet.

Spur sieben, acht, neun und 11 sind verschiedene Negativkontrollen, die unspezifische Banden aufweisen, die mit Sternchen gekennzeichnet sind und von der Analyse ausgeschlossen werden sollten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Struktur von Mannan mit PACE analysieren können. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie unter Verwendung verschiedener Glykosylhydrolasen auf andere Polysaccharide von Interesse angewendet werden.

Wir haben diese Technik erfolgreich auf viele andere Pflanzenarten neben Arabidopsis sowie auf andere Nicht-Pflanzenarten wie Hefemannan angewendet.