Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die biochemische und strukturelle Charakterisierung eines Kohlenhydratsubstrat-bindenden Proteins aus Streptococcus pneumoniae. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsseldaten zu liefern, um didaktische Studien des substratbindenden Proteins zu unterstützen, wie z. B. die Identifizierung der Pufferstabilitätsprofile, der Oligomerisierungszustände und der atomaren Strukturen. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es Daten liefert, die die Erfolgsrate der Kristallisation und Strukturlösung für substratbindende Proteine auf robuste und einfache Weise erhöhen können.

Bereiten Sie zunächst 48 Pufferlösungen mit einem pH-Bereich von 4,0 bis 9,5 und Natriumchloridkonzentrationen von null bis 0,5 molar vor. Geben Sie 40 Mikroliter jeder Lösung in eine 96-Well-Platte. Erhalten Sie eine gereinigte Lösung des gewählten Substratbindungsproteins.

Geben Sie fünf Mikroliter der SBP-Lösung in jede Vertiefung für eine Konzentration von ein bis zwei Milligramm pro Milliliter. Geben Sie dann fünf Mikroliter eines 20-fach konzentrierten Fluoreszenzflecks in jede Vertiefung. Mischen Sie die Lösungen, indem Sie auf und ab pipettieren.

Versiegeln Sie die Platte mit transparenter Klebefolie. Die Platte wird bei 112 μg bei Raumtemperatur zwei Minuten lang zentrifugiert. Konfigurieren Sie ein Echtzeit-PCR-System so, dass es mit einer Geschwindigkeit von drei Grad pro Minute von vier auf 99 Grad Celsius mit einer Haltezeit von 10 Sekunden ansteigt.

Stellen Sie das System so ein, dass alle halben Grad Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden. Stellen Sie die Einstellung des Fluoreszenzfilters ein. und ordnen Sie die Proben zu.

Führen Sie das Experiment durch, und ermitteln Sie die Pufferbedingung mit der höchsten Schmelztemperatur. Bereiten Sie als Nächstes einen Puffer mit dem gewählten pH-Wert und der Natriumchloridkonzentration vor, die 2,5 Vol.-% Glycerin und eine TCEP-Konzentration von 0,5 Millimolar enthält. Charakterisieren Sie das gereinigte SBP mit analytischer Größenausschlusschromatographie mit Mehrwinkel-Lichtstreuung.

Identifizieren Sie die stabilsten Spezies, die für die Kristallisation geeignet sind, und verwenden Sie vorbereitende SEC, um reine Fraktionen dieser Spezies zu erhalten. Führen Sie Vorkristallisationstests durch, um die optimale Proteinkonzentration für die Kristallisation zu bestimmen. Verwenden Sie ein Kristallisationsrobotersystem, um die gewünschten kommerziellen Kristallisationslösungen in die Lösungsreservoire einer optischen 96-Well-Fallplatte zu dosieren.

Verwenden Sie dann das System, um 100 Nanoliter der Proteinlösung in jede Vertiefung des Kristallisationstropfens zu dosieren. Übertragen Sie 100 Nanoliter jeder Kristallisationslösung aus den Reservoir-Wells in die entsprechenden Well-Drops. Versiegeln Sie die Platte mit optischer Klebefolie.

Verwenden Sie ein Mikroskop oder ein automatisiertes Bildgebungssystem, um die Kristallbildung und das Kristallwachstum zwei Wochen lang alle ein bis zwei Tage und danach einmal pro Woche zu bewerten. Wenn sich ausreichend große und gut geformte Kristalle gebildet haben, bereiten Sie eine Charge der Kristallisationslösung mit zusätzlichen 25 Vol.-% Glycerin vor, um als Kryoprotektivum zu dienen. Füllen Sie als Nächstes einen Schaum-Dewar mit flüssigem Stickstoff.

Tauchen Sie ein Unipuck-Probengehäuse in den flüssigen Stickstoff und lassen Sie das Gehäuse abkühlen. Schneiden Sie dann die Folie über einem Tropfen aus, der einen interessanten Kristall enthält. 0,5 Mikroliter des Kryoprotektivums auf einem Objektträger in der Nähe des Tropfens oder in der leeren Tropfkammer des gleichen Zustands ablegen, falls verfügbar.

Befestigen Sie an einem Magnetstab eine Kryoschleife, die auf einem SPINE-Standardsockel montiert ist. Verwenden Sie die Kryoschleife, um den interessierenden Kristall auf den Tropfen Kryoprotektor zu übertragen. Verwenden Sie dann den Kryoloop, um den Kristall aus dem Kryoprotektivum in die erste leere Position des untergetauchten Unipuck-Probengehäuses zu übertragen.

Wiederhole diesen Vorgang, um weitere Kristalle zu ernten. Sobald alle interessierenden Kristalle in das Probengehäuse geladen wurden, verwenden Sie den Puckstab, um die Unipuck-Grundplatte auf das Gehäuse zu setzen. Transportieren Sie das Unipuck in flüssigem Stickstoff zur Beamline.

Verwenden Sie eine Kryo-Zange und ein Puck-Dewar-Ladewerkzeug, um den Unipuck in den Strahllinien-Probenwechsler zu laden und das Probengehäuse zu lösen. Wählen Sie dann die Probe in der Beamline-Software aus, um die Probe zu laden und automatisch im Röntgenstrahl zu zentrieren. Erfassen Sie ein Röntgenfluoreszenzspektrum und identifizieren Sie alle Elemente, die in einem anomalen Beugungsexperiment verwendet werden können.

Bestimmen Sie die optimale Wellenlänge für die Erfassung anomaler Beugungsdaten, indem Sie einen Röntgenabsorptions-Kantenenergiescan durchführen. Erfassen Sie dann drei Röntgenbeugungsmuster in 45-Grad-Intervallen im Standard-Oszillationsmodus, um die Parameter der Kristalleinheitszelle, die Symmetrie und die Beugungsgrenze automatisch zu bestimmen. Importieren Sie die empfohlenen Datenerfassungsparameter in die Beamline-Software und führen Sie je nach Bedarf ein Experiment mit einer oder mehreren Wellenlängen anomaler Beugung durch.

Die Stabilität des substratbindenden Proteins SP0092 in verschiedenen Salzpuffern wurde untersucht, um die optimale Pufferlösung zu identifizieren. Die höchsten Schmelztemperaturen wurden für Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 und Natriumchlorid-Konzentrationen von null bis 0,2 molar gefunden. Für das Verfahren wurde ein Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 molar ausgewählt.

Die verschiedenen Oligomerisierungszustände von SP0092 wurden identifiziert und mit SEC-MALS getrennt. Eine Analyse des SEC-Profils bei verschiedenen Proteinkonzentrationen zeigte, dass eine erhöhte Proteinkonzentration die Oligomerisierung auslöst, was darauf hindeutet, dass größere Oligomere bei hohen Konzentrationen stabiler sind. In Übereinstimmung damit produzierten die großen Oligomere in Kristallisationsversuchen Kristalle, während dies bei den Monomeren nicht der Fall war.

Die Röntgenfluoreszenz sowohl von nativen als auch von Selenomethionin-markierten SP0092-Kristallen zeigte an, dass Zink in beiden Formen an das Protein gebunden war. Das anomale Signal wurde maximiert, indem die einfallende Röntgenwellenlänge auf die Röntgenabsorptionskanten von Zink oder Selen abgestimmt wurde. Anschließend wurde ein vollständiger anomaler Datensatz erhalten, und die automatisierte Analyse, die durch das Vorhandensein eines anomalen Signals ausgelöst wurde, erzeugte erste Karten der Proteinstrukturen.

Die in diese ersten Karten eingebauten Modelle wurden dann verfeinert und validiert, um die endgültigen Modelle zu erstellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine umfassende strukturelle Charakterisierung eines substratbindenden Proteins oder eines potenziellen Proteinziels durchführen können. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung neuer Therapeutika für Myrocokken-Erkrankungen, da sie grundlegende Erkenntnisse für das strukturbasierte Design von Inhibitoren für diese Klasse von Proteinen liefern.

Diese Methoden können auch auf substratbindende Proteine aus anderen Organismen angewendet werden, und sie können möglicherweise für jeden Proteintyp verwendet werden.