Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einen Assay zu entwickeln, mit dem die Wirkung kleiner Moleküle bei der zeit- und dosisabhängigen Modulation der Aggregation fehlgefalteter Proteine untersucht werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, die Schlüsselfragen für die Entwicklung von zellulären Assays zu beantworten, und sie wird für High-Content-Screening-Techniken verwendet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, eine einfache Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation bereitzustellen, die bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen auftritt.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf eine mögliche Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS, da sie eine einfache Methode vorschlägt, die es ermöglicht, zelluläre Assays zu entwickeln und ein Screening auf niedermolekulare Moderatoren durchzuführen. Um mit der Virusproduktion zu beginnen, wurden HEK-293 T-Zellen vor der Plasmidtransfektion bei 30 bis 40 % Konfluenz in einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale und 10 Millilitern Zellkulturmedium gespalten. Inkubieren Sie die Kulturplatte über Nacht in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie am nächsten Tag eine DNA-Transfektionslösung mit Verpackungsplasmiden, einem lentiviralen Vektor, 125 Mikrolitern eines molaren Calciumchlorids vor und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 500 Mikroliter einzustellen. Geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter 0,05 molaren HEPS-Puffer hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie danach das T-Zell-Medium HEK-293 durch 10 Milliliter vorgewärmtes antibiotikafreies Frischkulturmedium, das mit einem Milliliter DNA-Transfektionslösung gemischt ist.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht. Ersetzen Sie die überschüssigen Zellen am nächsten Tag durch frisches Kulturmedium und inkubieren Sie erneut über Nacht. Zum Schluss am nächsten Tag die Überschüsse ernten und in eine 15-Milliliter-Tube umfüllen.

Um die abgestorbenen Zellen und Ablagerungen zu entfernen, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 500 mal g. Um den Überstand weiter zu reinigen, passieren Sie ihn mit einer 60-Milliliter-Spritze durch einen 0,45-Mikrometer-Filter. Geben Sie dann das gefilterte Übergewicht sofort in 300-Mikroliter-Einweg-Aliquots ab.

Um die Zellen für die Transduktion vorzubereiten, spalten Sie sie so, dass sie bei 60 % Konfluenz in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte in zwei Milliliter DMAM mit 10 % FBS infiziert werden. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator bei 5 % Kohlendioxid. Tauen Sie am nächsten Tag bei jeder Anwendung ein Aliquot des gefrorenen Lentivirus auf Eis auf.

Erwärmen Sie in der Zwischenzeit das Zellkulturmedium, das das Serum enthält, das mit der gewünschten Zelllinie kompatibel ist. Sobald das Virus vollständig aufgetaut ist, verdünnen Sie es in DMEM in neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Passen Sie dann das Volumen mit reduziertem Serummedium auf einen Milliliter an.

Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter Polybren zu einem Milliliter Virus pro Medium hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Geben Sie einen Milliliter dieser Mischung in die Zellen und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch normales DMEM, das mit 10 % FBS ergänzt ist, und stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator ein.

Überwachen Sie das Zellwachstum und wechseln Sie das Medium alle zwei Tage Wenn die Zellen den Zusammenfluss erreichen, erweitern Sie jede Vertiefung der Sechs-Well-Schale zu einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturplatte. Schieben Sie die Platten in den Inkubator. Sparen Sie schließlich 1,5 mal 10 bis 4. Zellen pro Well und 50 Mikroliter DMEM auf 384-Well-Assay-Platten.

Überprüfen Sie dann das Expressionsniveau des YFP-markierten Proteins unter dem Mikroskop. Wenn der Ausdruck ein Signal-Rausch-Verhältnis größer oder gleich drei anzeigt, bereiten Sie das Zellmaterial für die entsprechende Zelllinie vor. Für den Verbindungstransfer werden auf einer 384-Well-Lagerplatte aus Polypropylen serielle Verdünnungen von Verbindungen mit den standardmäßigen Verdünnungsreihen von ein bis drei hinzugefügt.

Verteilen Sie dann mit einem Liquid Handler, der mit einem 384-Kapillarkopf ausgestattet ist, 0,25 Mikroliter Proteasom-Inhibitoren auf leere schwarze 384-Well-Assay-Platten mit flachem Boden. Dann säen Sie 1,5 mal 10 bis zu den 4. Zellen auf diesen Platten. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Vor der Bildgebung der mit Proteasom-Inhibitoren behandelten Zelllinie werden 10 Mikroliter vorgewärmtes DMEM mit Färbelösung zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Starten Sie nach der Färbung die automatische Mikroskop-Betriebssoftware, indem Sie die Registerkarte Mikroskop auswählen. Wählen Sie zuerst die Registerkarte "Konfiguration" und dann "20-faches Ziel" im richtigen Plattentyp aus.

Um eine korrekte Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen zu ermöglichen, stellen Sie sicher, dass der Anrufer auf dem Objektiv auf den richtigen Wert eingestellt ist. Wählen Sie als Nächstes Belichtung eins aus. Stellen Sie die Fokushöhe auf null Mikrometer ein und wählen Sie dann Fokus.

Sobald sie fokussiert ist, belichten Sie Kamera eins. Um die Belichtungsebene zu optimieren, passen Sie die Fokushöhe an und klicken Sie auf Höhe nehmen. Ändern Sie die Belichtungszeiten und die Laserleistung für eine maximale Pixelintensität von ca. 3000 und speichern Sie die Belichtungsparameter.

Wählen Sie die Registerkarte "Experimentdefinition" aus, und erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout. Ziehen Sie als Nächstes die relevante Layoutbelichtung, das Referenzbild, die Zuschnittsdatei und das Unterlayout per Drag & Drop. Speichern Sie dann das Experiment.

Wählen Sie abschließend die Registerkarte "Automatisches Experiment" und erfassen Sie Bilder. Wählen Sie bei Zweikanalbildern zunächst den Softwarealgorithmus aus, um die primären Objekte wie Zellkerne, Zytosol und Aggregate zu segmentieren. Verteilen Sie zunächst 0,25 Mikroliter Proteasom-Inhibitor, gelöst in 100 % DMSO oder DMSO, auf 384-Well-Platten mit flachem Boden.

Auf derselben Platte 1,5 mal 10 bis zur 4. Zellen pro Vertiefung in 50 Mikroliter DMEM manuell aussäen. Richten Sie dann die Umgebungskontrolleinheit des Mikroskopsystems auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ein. Betreiben Sie das Mikroskop im Weitfeld-Fluoreszenzmodus und als Softwareeinstellungen, wählen Sie den nicht-konfokalen LWD-Modus mit 20-fachem Objektiv, vier Felder pro Vertiefung und ein Aufnahmeintervall von einer Stunde.

Wählen Sie dann den entsprechenden Algorithmus aus, um das primäre Objekt wie Zytosol und Aggregate zu segmentieren. Passen Sie bei Bedarf die Parameter für den Hintergrundschwellenwert und den Kontrast an. Die getesteten Zelllinien, die mit SOD-1-Wildtyp und SOD-1 A4V-Mutante transduziert wurden, blieben gesund, zeigten hohe Expressionsniveaus und eine langfristige breite phi-Markierung, unabhängig von der SOD-Form.

Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor ALLN über 24 Stunden förderte die Akkumulation von SOD-1 A4V YFP-Aggregaten in HEK-293-Zellen, nicht jedoch in SOD-1 Wild Typ YFP transduzierten Zellen. Darüber hinaus gab es sehr geringe Aggregationsniveaus in den Zelllinien U2 OS und SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP, die mit denselben Vektoren transduziert wurden. Nach der Aussaat der Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von ALLN wurden sie über einen Zeitraum von 50 Stunden auf Aggregatbildung überwacht.

Die ALLN-Aggregatbildung erreichte nach 24 Stunden ein Plateau und blieb in den nächsten 12 Stunden stabil. Darüber hinaus nahm die Zelldichte nach 28 Stunden infolge der zytotoxischen Wirkung von ALLN signifikant ab, während die Zellzahl in der DMSO-behandelten Negativkontrolle zunahm. SOD-1 A4V YFP-Zellen, die 24 Stunden lang in Gegenwart von Proteasom-Inhibitoren kultiviert wurden, wurden mit Hoechst-Lösung gefärbt.

Die relative Toxizität für drei verschiedene Proteasom-Inhibitoren wurde durch Messung der Anzahl der adhärenten Zelllinien, die in der mit Hoechst-Farbstoff markierten Vertiefung verbleiben, quantifiziert. Die Gesamtzahl der Zellen nahm als Reaktion auf eine erhöhte Dosis von Proteaseinhibitoren ab. Umgekehrt stieg der Prozentsatz der Zellen, die SOD-1 A4V-Aggregate exprimierten, mit der Konzentration des Proteaseinhibitors.

Bei diesem Vorgang ist es wichtig, daran zu denken, dass die Zellqualität Ihr Ergebnis drastisch beeinflusst. Daher ist es wichtig festzustellen, dass die Zellen frei von Mikroplasma sind und während der gesamten Schritte gesund sind. Im Anschluss an diesen Prozess kann ein weiteres bildgebendes Verfahren verwendet werden, um zusätzliche Fragen zum Abbau von Proteinen oder zur Interaktion des Proteins mit anderen durch Resonanzenergietransfer zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Werkzeuge generieren, um das Schicksal von Proteinen in mehreren lebenden Zellen mithilfe einer High-Content-Bildanalyse zu testen. Diese Methode kann also Einblicke in die Proteinaggregation geben, wie sie in einfachen zellulären Modellen abläuft. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Neuronen, die von patientenspezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert werden.