Name: Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Erfahren Sie den Nachweis von Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie in Zelllysaten und lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von ALS-assoziierten Proteinen wie TDP25 und mutiertem SOD1.

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A.K. wurde von einer Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), durch ein Stipendium der Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, durch ein Stipendium des Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) und ein Stipendium der Hoansha Foundation unterstützt. M. K. wurde teilweise durch ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) und ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information Physics of living matters" (#20H05522) unterstützt.

1. Materialien und Reagenzien
<ol><li>Verwenden Sie pyrogene freie Lösungen und Medium für die Zellkultur (Tabelle 1).</li>
	<li>Bereiten Sie Lösungen für das biochemische Experiment mit Reinstwasser vor und verwenden Sie als DNase/RNase frei.</li>
	<li>Wählen Sie einen geeigneten FBS für die Zellkultur mit einem Chargenprüfungsprozess aus. Da sich das ausgewählte FBS-Los regelmäßig ändert, können der Katalog und die Chargennummer für FBS hier nicht dargestellt werden.</li>
	<li>Plasmid-DNA<ol>
<li>Vorbereiten von pmeGFP-N15 für eGFP-Monomerexpression; pmeGFP-C1-TDP256 für GFP-TDP25-Ausdruck; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 für SOD1-G85R-GFP-Ausdruck; und pCAGGS8 als Träger. HINWEIS: meGFP ist eine monomere Variante, die eine A206K-Mutation des verbesserten GFP (eGFP) trägt. TDP25 ist ein ALS-assoziiertes C-Terminal-Fragment von TDP-43. SOD1-G85R ist eine ALS-assoziierte Mutation von SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zellstamm<ol>
<li>Verwenden Sie das murine Neuroblastom Neuro2a Zellen. HINWEIS: Neuro2a-Zellen haben eine hohe Transfektionseffizienz und hochexpressige exogene Proteine. Für die TDP25-Expression sind Zellstämme mit hoher Expressionseffizienz erforderlich, z. B. Neuro2a- oder HEK293-Zellen. In HeLa-Zellen konnte TDP25 nicht effizient exprimiert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zellkultur und Transfektion
<ol><li>Bereiten Sie eine 100 mm Kunststoffschale, die Neuro2a-Zellen halbkonfluent in normalem Wachstumsmedium anwächst. HINWEIS: Es ist notwendig, bei 37 °C für ca. 48-72 Stunden nach der vorherigen Aussaat zu inkubieren, bis die Halbkonfluenz erreicht ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium.</li>
	<li>0,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellkulturschale geben und bei 37 °C für 1 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 9,5 ml normales Wachstumsmedium in die Schale und hängen die abgetrennten Zellen.</li>
	<li>Mit Trypan blue, um die abgestorbenen Zellen zu färben, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler oder manuell. Verdünnen Sie dann die Zellen im Kulturmedium (1,0 × 105/ml).</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml Zellsuspension in eine 35 mm Kunststoffschale für die Zelllyse oder eine Glas-Basisschale für die Live-Zell-Messung.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gericht bei 37 °C für 1 Tag.</li>
	<li>Beginnen Sie die folgenden Vorbereitungen 15 Minuten vor dem Tag der Transfektion.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei 1,5 ml-Rohre vor und fügen Sie jedem Rohr 100 l Opti-MEM I hinzu.</li>
	<li>Mischen Sie in der ersten Röhre 1,0 g Plasmid-DNA (Lösung A). Mischen Sie in der zweiten Röhre 2,5 l Lipofectamin 2000 (Lösung B). HINWEIS: Um die Transfektionseffizienz aufrechtzuerhalten, halten Sie die gesamte DNA-Menge gleich. Um den Expressionspegel für die FCS-Messung in lebenden Zellen zu reduzieren, sollte die Bruchmenge der Plasmid-DNA für die Proteinexpression abnehmen (z. B. 0,2 g pmeGFP-N1-SOD1-G85R und 0,8 g pCAGGS-Gemisch). Darüber hinaus halten Sie das gleiche Verhältnis zwischen dem Volumen von Lipofectamin 2000 und der Menge der Plasmid-DNA.</li>
	<li>Mischen Sie Lösung A und B vorsichtig, indem Sie eine in eine der beiden Rohre geben, und inkubieren Sie sie dann 1 min bei Raumtemperatur (Lösung C).</li>
	<li>Fügen Sie die Lösung C zum Kulturmedium hinzu; und inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C.</li>
</ol>3. Zelllyse & Mittlerer Austausch
<ol><li>Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem Routinemikroskop.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium in der Schale.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml PBS bei 25 °C hinzu, um das Medium auszuwaschen. Entfernen Sie die PBS.</li>
	<li>Legen Sie die Schale auf eine Aluminiumplatte auf dem zerkleinerten Eis. HINWEIS: Wir verwenden eine 1 mm dicke Aluminiumplatte, die in einem Sonntagswerkzeuggeschäft geschnitten oder kommerziell erhältlich ist, als Laborausrüstung.</li>
	<li>Fügen Sie 200 L Lysepuffer bei 4 °C hinzu. Schütteln Sie die Schale leicht, so dass der Puffer gleichmäßig an der Unterseite der Schale verteilt ist.</li>
	<li>Zerkleinern Sie die Schale mit einem Zellschaber und erholen Sie das Lysat mit ungelöstem Zellabfall in einem neuen 1,5 ml Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.400 x g für 5 Minuten bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand in einem neuen 1,5 ml-Rohr wiederherstellen und bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren. HINWEIS: Lassen Sie das Lysat nicht einfrieren.</li>
	<li>Ersetzen Sie bei Live-Zellmessungen das Medium vor der Messung. Überprüfen Sie die Zellbefestigung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Bestätigen Sie die Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>4. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Kalibrierung
<ol><li>Starten Sie das System, und führen Sie die Betriebssoftware aus. Schalten Sie den Argon+ Laser ein (458/477/488/514 nm). Stabilisieren Sie das System mindestens für 30 min.</li>
	<li>Einrichten des optischen Pfads: Hauptstrahlteiler: HFT488; Dichroischer Spiegel: NFT600; Fluoreszenz-Barrierefilter: Bandpassfilter 505-540 (BP505-540); Detektor: Lawinenphotodiode (APD)).</li>
	<li>Stellen Sie die Lochgröße ein, indem Sie den Wert direkt eingeben (66 m; 1 luftige Einheit).</li>
	<li>Fügen Sie die Rhodamine 6G (Rh6G) Lösung in einen Brunnen der Abdeckung Glaskammer auf der Bühne.</li>
	<li>Fügen Sie das Tauch-Ultrareinstwasser auf das Ziel. Verwenden Sie das Tauchöl nicht.</li>
	<li>Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe. Verschieben Sie die Bühne an die entsprechende Position.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich auf die obere Glasoberfläche, indem Sie das Streulicht von der Glasoberfläche messen. Nachdem Sie die Objektivlinse nach unten gesenkt haben, drehen Sie den Fokusknopf im Uhrzeigersinn, um ihn anzupassen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Drehrichtung des Fokusknopfes, da er sich gegenüber denen aus Japan und Deutschland befindet.</li>
	<li>Heben Sie den Brennpunkt 200 m über der oberen Glasoberfläche an, um das Innere der Lösung zu beobachten.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Zählrate, und überwachen Sie die Photonenanzahl.</li>
	<li>Schrittweise erhöhen Sie den akusto-optischen Abstimmfilterwert (AOTF) (z.B. Anregungslaserübertragung), so dass der Zählratewert mehr als 10 kHz beträgt.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Pinhole-Anpassung und öffnen Sie den Pinhole-Anpassungs-Assistenten. Finden Sie die Lochposition mit der höchsten (Spitzen-) Anzahl von Photonen in der x- und y-Achse.</li>
	<li>Drehen Sie den Korrekturring der Objektivlinse so, dass die Anzahl pro Molekül (CPM) am höchsten ist. HINWEIS: Da die Dicke des Abdeckglases der hier angegebenen Kammer 0,12-0,17 mm beträgt, ist der Korrekturring um sein Minimum oder nur wenige Umdrehungen von ihm entfernt, wo der CPM sein Maximum hat.</li>
	<li>Verringern Sie den AOTF-Wert schrittweise, sodass der CPM-Wert zu 2-3 kHz wird.</li>
	<li>Erwerben Sie die Autokorrelationsfunktion (ACF) von Rh6G für 90 s.</li>
	<li>Sobald die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen.</li>
	<li>Wählen Sie ein Modell für eine Komponente dreidimensionale (3D) Diffusion mit einem Triplet-Zustand. HINWEIS: Der Rh6G ist monodisperse und einkomponentdiffierend mit einem Triplet-Zustand.</li>
	<li>Legen Sie die passende Startzeit fest, indem Sie die rote Linie verschieben. Klicken Sie auf Alle anpassen, und überprüfen Sie die Anpassungsabweichung. Stellen Sie nach der Kurvenanpassung sicher, dass die Diffusionszeit (DT) und der Strukturparameter (SP) ungefähr im Bereich von 20-30 s bzw. 4-8 liegen.</li>
	<li>Denken Sie an den Wert des strukturellen Parameters. Verwenden Sie den SP-Wert für die Kurvenanpassungsanalyse aller ACFs, die am selben Tag unter den gleichen optischen Bedingungen gemessen wurden, und verwenden Sie die gleiche Art von Glasgrundschale oder Kammerabdeckungsglas, das auf der Mikroskopbühne eingestellt ist.</li>
</ol>5. FCS-Messung im Zelllysat
<ol><li>Bereiten Sie die Zelllysate vor (siehe oben).</li>
	<li>Legen Sie das Lysat auf die Abdeckung Glaskammer. Legen Sie einen Deckel, um eine Trocknung zu vermeiden und den Bühnendeckel für die leichte Beschattung.</li>
	<li>Stellen Sie den Erfassungszustand, die Laserleistung, die Messzeit und Wiederholungen ein.</li>
	<li>Klicken Sie auf Count Rate, und passen Sie den AOTF-Wert des Lasers so an, dass der CPM-Wert mehr als 1 kHz wird.</li>
	<li>Führen Sie eine Testmessung für 1 min durch. Prüfen Sie, ob der berechnete ACF eine positive Amplitude und einen glatten Zerfall anzeigt.</li>
	<li>Führen Sie die Hauptmessung für 5 min durch. HINWEIS: Die Gesamtmesszeit wird schrittweise erhöht, bis sich die Form des ACF nicht ändert, selbst wenn die Messzeit erhöht wird.</li>
	<li>Klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen.</li>
	<li>Wählen Sie ein Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand aus. Denken Sie daran, den SP-Wert einzugeben und ändern Sie seine Einstellung in "Fixed" nicht "Free", bevor Sie auf Alle anpassen klicken.</li>
	<li>Exportieren Sie die angepasste Tabelle als durch Tabulatoren getrennte Textdatei.</li>
	<li>Exportieren Sie ggf. den ACF- und Count-Rate-Datensatz als textdatei durch Tabs.</li>
</ol>6. FCS-Messung in lebenden Zellen
<ol><li>Ersetzen Sie das Medium vor der Messung durch ein frisches Medium.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Wärmestufen-Inkubator. Stellen Sie die Zellkulturschale auf die Mikroskopbühne.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Fokus und die Position mit der konfokalen Mikrope. Wählen Sie die Messzelle aus. Vergrößern Sie die Zellenposition, und passen Sie sie an. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder einer GFP-exezierenden Zelle im langsamen Scangeschwindigkeitsmodus.</li>
	<li>Wählen Sie eine FCS-Messposition mit Position im Abschnitt "FCS" aus.</li>
	<li>Wählen Sie mindestens einen FCS-Messpunkt mit einem Fadenkreuz aus (Abbildung 1).</li>
	<li>Messen Sie den ACF für 1 min. HINWEIS: Da fluoreszierende Proteine aufgrund einer langsamen Bewegung im Vergleich zur Lösung in lebenden Zellen photobleached werden, sollte die Messzeit minimal sein. Es ist in der Regel schwierig, ACF in der Zelle so reibungslos wie Lösungsmessungen zu erhalten, da eine längere Messung zu Photobleichungen von fluoreszierenden Proteinen führt.</li>
	<li>Klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse mit einem Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand durchzuführen. HINWEIS: Bei Live-Zellmessungen wäre ein Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand besser, da es empirisch schwierig ist, den Chi-Quadratwert mit einem Einkomponenten-3D-Diffusionsmodell zu verringern, da verschiedene mobile Komponenten in der Lebenden Zelle vorhanden sind. Aber auch bei einem Modell für die Dreikomponenten-3D-Diffusion sind die Diffusionskomponenten im Vergleich zur Verwendung des Modells für Zweikomponenten in der Regel nicht getrennt.</li>
</ol>

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<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
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<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Diese Autoren haben keine Interessenkonflikte.

In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müssen ex...

Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter1 sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte2. Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregation Toxizität ausübt, schwer fassbar. Daher ist es zur Förderung von Forschungsprojekten im Zusammenhang mit der Proteinaggregation wichtig, Verfahren mit hohem Durchsatz einzuführen, um die Proteinaggregation einfach zu erkennen. Der Proteinaggregationsnachweis mit Antikörpern, die die Konformation von Proteinaggregation und aggregationsspezifischem Fluoreszenzfarbstoff erkennen, wurde weit verbreitet3. Es ist jedoch schwierig, die Aggregation zu erkennen, insbesondere in lebenden Zellen mit solchen klassischen Verfahren. 
Förster Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein Verfahren zur Erkennung von Proteinaggregation und Strukturwandel. FRET ist jedoch nicht in der Lage, die Proteindynamik zu analysieren (z. B. Diffusion und Oligomerisierung von Proteinen in lebenden Zellen)3. Daher führen wir hier ein einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinaggregation in Lösung (z.B. Zelllysat) und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ein, das die Diffusionseigenschaft und Helligkeit fluoreszierender Moleküle mit einzelmolekularer Empfindlichkeit4misst. FCS ist eine Photonenzählmethode mit einem Laserscan-Konfokalmikroskop (LSM). Mit Hilfe eines hochempfindlichen Photonendetektors und der Berechnung der Autokorrelationsfunktion (ACF) der Photonenankunftszeit wird der Durchlauf von Zeit und Helligkeit der Fluoreszenzmoleküle im Nachweisvolumen gemessen. Die Diffusion verlangsamt sich mit einer Erhöhung des Molekulargewichts; daher kann die intermolekulare Interaktion mit FCS geschätzt werden. Noch stärker ist, dass eine Erhöhung der Helligkeit des fluoreszierenden Moleküls auf eine Homo-Oligomerisierung der Moleküle hindeutet. Daher ist FCS ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine solche Proteinaggregation zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>0,25 % (w/v) Trypsin-1 mmol / l EDTA & Middot; 4Na-Lösung mit Phenolrot (Trypsin-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-Kunststoffschalen</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Glasbodenschale</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Für die Messung von lebenden Zellen</td></tr><tr><td>35-mm-Kunststoffschalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumplatte</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1,2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Objektiver</td></tr><tr><td>Zellenabstreifer</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Celluloseacetat-Filtermembran (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaskammer 8-Wells</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Für die Lösungsmessung</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Basalmedium</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biosere</td><td></td><td>Chargenprüfung erforderlich</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS-System</td></tr><tr><td>Maus-Neuroblastom Neuro2a-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>Plasmid-DNA für den Transfektionsträger</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung (&mal; 100 )</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>Plasmid-DNA für TDP25, markiert mit monomerem eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>Plasmid-DNA für die eGFP-Monomer-Expression</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>Plasmid-DNA für ALS-verknüpfte G85R-Mutante von SOD1, markiert mit monomerem</td>eGFP-Protease-Inhibitor-Cocktail</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis der proteinaggregation mittels fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.

Wir führten die FCS-Messung von GFP-TDP25 in Zelllysat und SOD1-G85R-GFP in lebenden Zellen durch. In beiden Fällen konnten eine positive Amplitude und glatte ACFs erworben werden. Wir haben gezeigt, dass ein Teil von GFP-TDP25, ausgedrückt in Neuro2a-Zellen, in der löslichen Fraktion unter der angegebenen Bedingung6zurückgewonnen wurde. Im löslichen Anteil des Zelllysats wurden extrem helle Fluoreszenzmoleküle im Photonenzählratenrekord mit FCS nachgewiesen(Abbildung 2A</stro...

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Das beste Prinzip der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, FCS, wurde ursprünglich in den 1970er Jahren erfunden. In den 1990er Jahren wurden wichtige und viele Verbesserungen für FCS durch die Kombination mit einer konfokalen Apparatmikroskopie etabliert. Seitdem wird FCS für viele chemische und Virusheilanwendungen eingesetzt, wie z. B. molekulare Wechselwirkungen und Proteinaggregationsanalysen.Die Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen. Fluoreszenzhelligkeit sind einzelne Partikel in Aktion molekularer Größen, die durch Diffusionseigenschaften erklärt werden. Es ist sehr wichtig bei der Messung von Proteinaggregationen, weil es projizierte Lebenszyklen von Molekülen bestimmen kann, aber auch die Homo- oder Heteropolymerisation unterscheiden kann.Hier führen wir ein Verfahren zur Messung der Diffusion von amyotropher Lateralsklerose im Zusammenhang mit aggregiertem Formprotein mit FCS in Zelllysaten und lebenden Zellen ein. Bereiten Sie 100 Millimeter Kunststoffschale wachsen Neuro2a Zelle bequem sitzend im normalen Wachstumsmedium. Bestätigen Sie die Zellkonfluenk.Entfernen Sie das Medium. Fügen Sie 3,5 Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung in die dritte Patronenschale und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für eine Minute. Fügen Sie 9,5 Milliliter normales Wachstumsmedium in die Schale und suspendieren Sie sie.Die Zellsuspension wird mit Trypanblau gemischt, um die abgestorbenen Zellen zu färben. Fügen Sie der Zellzählfolie eine Suspension hinzu. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Zellenzähler verwenden, oder manuell.Überprüfen Sie die Live-Zellennummer und ihre Lebensfähigkeit. Verdünnen Sie die Zelle im gezählten Medium mit 1,0 mal 10 auf die Leistung von 5 pro Milliliter. Fügen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in die 35-Millimeter-Kunststoffschale für Zelllyse oder Wachstumsraumschale für die Live-Zellmessung ein.Bebrüte das Gericht bei 37 Grad Celsius für einen Tag. Am nächsten Tag die Mischung aus Plasmid-DNA und den Transfektionsreagenzien zubereiten. Fügen Sie die Transfektionsmischung dem zellgezählten Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.Einen Tag später. Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem Routinemikroskop. Sie können die sehr hellen TDP25 Zutat Körper in Zellen zu sehen.Die Zelllyse sollte an der biochemischen Bank durchgeführt werden. Entfernen Sie das Medium in der Schale. Fügen Sie zwei Milliliter PBS bei 25 Grad Celsius als Medium zu waschen.Entfernen Sie die PBS. Legen Sie die Schale auf eine Aluminiumplatte auf der Oberseite des zerkleinerten Eises. Sofort den 200 Mikroliter-Lysepuffer in die Schale geben.Scrape die Schale mit einem Zellschaber. Das Lysat mit ungelöstem Zellmüll in einem neuen 1,5-Millimeter-Rohr wiederherstellen. Zentrifugieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius.Ersetzen Sie bei Live-Zellmessungen das Medium vor der Messung durch ein frisches Medium. Überprüfen Sie die Zellbefestigung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Überprüfen Sie auch die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop.Verwenden Sie ein konfokales, mit Mikroskop kombiniertes FCS-System. Schalten Sie den 488-Nanometer-Laser ein. Stabilisieren Sie das System mindestens 30 Minuten lang.Richten Sie den optischen Pfad ein. Verwenden Sie einen 488 Nanometer Laser für das sofortige Licht. Verwenden Sie einen geeigneten Strahlsplitter und dichroitische Zähler.Und auch Fluoreszenz-Fuser. Normalerweise verwenden wir Deckglaskammern für Kalibrierungen und Lösungsmessungen. Nehmen Sie vorsichtig die AbdeckungGlaskammer.Legen Sie die Glasoberfläche auf das Linsensiebpapier. Gießen Sie die FCS-Kalibrierung. Fügen Sie auch die Rhodamine 6G Lösung hinzu.Fügen Sie das reines Wasser auf das Ziel. Verwenden Sie das Öl nicht. Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe.Verschieben Sie die Bühne an die entsprechende Position. Erstellen Sie die Lochanpassung und öffnen Sie den Lochanpassungsassistenten. Überwachen Sie die Photonenanzahl als grobe Bewegung des Lochs für die x-Richtung.Die hellste Position wurde zu Recht bestimmt. Überwachen Sie als Nächstes die Photonenanzahl als feine Bewegung. Die hellste Position wurde erfolgreich ermittelt Dies ist die Lochposition für x-Richtung.Suchen Sie auf die gleiche Weise die hellste Position des Lochs nach y-Richtung. Die hellste Position für y-Richtung wurde ebenfalls erfolgreich ermittelt. Die x- und y-Position des Lochs verdichten.Es ist besser, die Lochposition vor der Messung eines jeden Tages einzustellen. Wenn der Live-Pfad geändert wird, muss die Lochposition erneut angepasst werden. Erstellen Sie eine Zählrate und überwachen Sie die Telefonanzahl.Wechseln Sie in den CPM-Überwachungsmodus. Zählen Sie den Korrekturring des ausgeführten Objekts, sodass der CPM-Wert der höchste ist. Schließen Sie das Fenster mit der Zählrate.Beginnen Sie mit der Rhodamine 6G Lösungsmessung. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Anpassung, um die Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen. Wählen Sie ein Modell zum Anpassen der alten Korrelationsfunktion aus.Wählen Sie für Rhodamine 6G das Modell für die 1-Komponenten-, 3-dimensionale Diffusion mit einem Triplet-Zustand aus. Legen Sie die passende Startzeit fest, indem Sie die rote Linie verschieben. Klicken Sie auf Alle anpassen, um die Anpassungsberechnung zu starten.Überprüfen Sie die Anpassungsabweichung. Stellen Sie sicher, dass die Seiten gebucht und negativ sind, um Null. Überprüfen Sie die angepassten Werte.Stellen Sie sicher, dass die Diffusionszeit ungefähr im Bereich von 20-30 Mikrosekunden liegt. Darüber hinaus sind die strukturellen Parameter von vier bis acht. Öffnen Sie das Anpassungspanel, und wählen Sie ein Modell für die Messung aus.Geben Sie denselben strukturellen Parameterwert in das Modell für das Beispiel im Anpassungsbereich ein. Stellen Sie sicher, dass der Typ als "Fest" festgelegt werden soll. GFP-TDP25-Messung im Zelllysat.Legen Sie das Lysat in die Deckglaskammer. Legen Sie den Deckel, um das Austrocknen des Lysats zu vermeiden. Stellen Sie den Bühnendeckel für die leichte Schattierung auf.Legen Sie im Erfassungspanel die Laserleistung, die Messzeit und ihre Wiederholungen fest. Starten Sie die Erfassung. Es wurde eine Spitze beobachtet.Erneut wurde eine Spitze beobachtet. Die Spitze zeigt helle Moleküle an, die durch den Nachweiskörper geleitet werden. Spikes zeigen lösliche Oligomere oder Aggregate an.Erstellen Sie eine Anpassung, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen. Wählen Sie das Modell für die 2-Komponenten- 3-dimensionale Diffusion mit Triplet-Zustand aus. Legen Sie die Anfangszeit des Fittings fest.Klicken Sie auf "Alle anpassen". Überprüfen Sie die angepassten Werte. SOD1-G85R mit GFP-Messung in einer Lebenden Zelle markiert.Im Gegensatz zur Lösungsmessung empfehle ich die Verwendung des Wärmestufen-Inkubators. Stellen Sie die zellkultivierende Schale auf die Mikroskopstufe. Bestätigen Sie den Fokus und die Position mit dem Okular.Wählen Sie eine Messzelle aus. Zoomen Sie ein und passen Sie die Zellenposition mithilfe eines schnellen Scanmodus an. Erfassen Sie den Snapshot der Zellen mithilfe des langsamen Scangeschwindigkeitsmodus.Wählen Sie mit dem Positionswerkzeug eine FCS-Messposition aus. Das Fadenkreuz zeigt die Messposition an. Starten Sie die Messung.Der leichte Rückgang der Photonenzählung deutet auf photobleaching von GFP hin. Führen Sie die Kurvenanpassung aus. Repräsentative Ergebnisse von GFP-TDP25 in Zelllysat werden gezeigt.Das obere Diagramm zeigt die Photonenanzahl auf. Wo es Pfeile gibt, ist eine Spitze, die auf lösliche Oligomere und Aggregate hindeutet. Das mittlere Diagramm stellt die alte Korrelationsfunktion dar.Die graue Linie zeigt die niedrige, alte Korrelationsfunktion. Die Magenta-Linie zeigt die angepasste Funktion an. Die gepunkteten Linien geben die Anfangs- und Endzeiten für die Anpassung an.Die untere Tabelle zeigt den angepassten Wert. Als nächstes werden repräsentative Ergebnisse von SOD1-G85R-GFP in einer Livezelle gezeigt. Das obere Diagramm stellt einen Datensatz unserer Photonenanzahl dar.Der allmähliche Rückgang der aufgezeichneten Photonenzahl wurde beobachtet, was auf photobleichendes GFP-Wachstum für verschiedene Messungen hindeutet. Dies ist aufgrund der langsamen Diffusionsgeschwindigkeit in lebenden Zellen. Das mittlere Diagramm stellt die alte Korrelationsfunktion von SOD1 dar.Die graue Linie zeigt die niedrige, alte Korrelationsfunktion. Die Magenta-Linie zeigt die angepasste Funktion. Die gepunkteten Linien geben die Anfangs- und Endzeiten mit Fitting an.Die untere Tabelle zeigt angepasste Werte. Hier zeigen wir Ihnen dieses Verfahren zur Messung der Diffusion aus jeder Zell assoziierten TDP-25 in Zelllysat und alles Mutant von SOD1 in lebenden Zellen mit FCS. Die löslichen Oligomere und die Aggregation im Zelllysat können oft als Spitzen oder Ausbrüche beobachtet werden.Andererseits werden solche Spitzen in lebenden Zellen selten beobachtet, mit Ausnahme möglicherweise offensichtlicher Lebendstrukturen. Eine langsam diffundierende Art von mutierten SOD1 fügt mittlere Helligkeit für einzelne Partikel wie SOD1 Homopolymerisation im Inneren für uns hinzu. Das hier gezeigte Verfahren ist einfach und lohnend.FCS enthält keine Strahlung;direkt ruhender Zustand. Es ist nur Ihre und unsere Vorstellungskraft Empathie.

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