Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Beginnen wir mit genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Diese Gehirne exprimieren ein rot fluoreszierend markiertes mutiertes Protein im Neuron, das sich auf die umgebende Gliazelle ausbreiten kann, wobei es das gelb fluoreszierend markierte normale Protein exprimiert, was zu deren Aggregation führt.

Fügen Sie eine Fixierlösung hinzu, die die zelluläre Integrität bewahrt.

Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie es mit einem Puffer.

Fügen Sie ein Antifading-Reagenz hinzu und inkubieren Sie, um das Verblassen von Fluoreszenzsignalen zu verhindern.

Übertragen Sie das Gehirn auf einen Objektträger und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.

Lassen Sie das Gehirn an der Folie haften.

Verwenden Sie kleine Stücke eines Deckglases als Abstandshalter und legen Sie ein Deckglas darauf. Fügen Sie ein Antifading-Reagenz hinzu und versiegeln Sie es.

Nehmen Sie unter einem konfokalen Mikroskop Bilder mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen für rote und gelbe Fluoreszenz auf.

Quantifizieren Sie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware die Proteinaggregate.

Die Kolokalisation von roter und gelber Fluoreszenz deutet auf die Ausbreitung mutierter Proteine hin.

Sobald alle Gehirne präparie