Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Beginnen wir mit genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Diese Gehirne exprimieren ein rot fluoreszierend markiertes mutiertes Protein im Neuron, das sich auf die umgebende Gliazelle ausbreiten kann, wobei es das gelb fluoreszierend markierte normale Protein exprimiert, was zu deren Aggregation führt.

Fügen Sie eine Fixierlösung hinzu, die die zelluläre Integrität bewahrt.

Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie es mit einem Puffer.

Fügen Sie ein Antifading-Reagenz hinzu und inkubieren Sie, um das Verblassen von Fluoreszenzsignalen zu verhindern.

Übertragen Sie das Gehirn auf einen Objektträger und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.

Lassen Sie das Gehirn an der Folie haften.

Verwenden Sie kleine Stücke eines Deckglases als Abstandshalter und legen Sie ein Deckglas darauf. Fügen Sie ein Antifading-Reagenz hinzu und versiegeln Sie es.

Nehmen Sie unter einem konfokalen Mikroskop Bilder mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen für rote und gelbe Fluoreszenz auf.

Quantifizieren Sie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware die Proteinaggregate.

Die Kolokalisation von roter und gelber Fluoreszenz deutet auf die Ausbreitung mutierter Proteine hin.

Sobald alle Gehirne präpariert sind, überführen Sie das Entnahmeröhrchen in einen Nussator bei Raumtemperatur und wiegen Sie es etwa 5 Minuten lang. Entfernen Sie nach der Fixierzeit den größten Teil der Fixierlösung mit einer P1000-Pipette und entsorgen Sie sie, wobei Sie sehr vorsichtig darauf achten sollten, das Gehirn in den Röhrchen zu belassen. Dies erfordert ein sanftes Absaugen und eine sorgfältige Beobachtung.

Geben Sie als nächstes 1 Milliliter frisches PBST in das Gehirn. Decken Sie die Tube ab und lassen Sie sie etwa eine Minute lang auf dem Nutator schaukeln, um das restliche Fixiermittel abzuwaschen. Entfernen Sie dann die Lösung und wiederholen Sie diesen kurzen Waschschritt.

Nach den beiden kurzen Wäschen folgt eine 5-minütige Wäsche, dann drei 20-minütige Wäschen und schließlich eine einmalige 1-stündige Wäsche. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche vorsichtig den größten Teil des PBST und tauchen Sie das Gehirn in 30 Mikroliter Anti-Fade-Reagenz auf Glycerinbasis. Dann inkubieren Sie die Gehirne bei 4 Grad Celsius im Dunkeln ohne Bewegung für 1 bis 24 Stunden.

Später nehmen Sie die Gehirne mit einer abgestumpften Pipettenspitze aus dem Entnahmeröhrchen und übertragen sie auf einen Objektträger. Richten Sie dann das Gehirn vorsichtig aus, wie es für die Bildgebung mit einer Pinzette erforderlich ist. Mehrere Proben können in getrennten Reihen auf denselben Objektträger montiert werden.

Entfernen Sie anschließend das überschüssige Anti-Fade-Reagenz mit der Ecke eines gefalteten Laborgewebes vom Objektträger. Lassen Sie das Gewebe nicht mit dem Gehirn in Berührung kommen. Lassen Sie die Proben dann 5 bis 10 Minuten lang im Dunkeln, damit das Gehirn am Objektträger haften kann.

Nehmen Sie als Nächstes kleine Stücke zerbrochenes Deckglas und positionieren Sie sie um das Gehirn herum, so dass eine Fläche von etwa 19 Quadratmillimetern bedeckt ist. Senken Sie dann vorsichtig ein 22 Quadratmillimeter großes Deckglas über das Mosaik aus Gehirn und Glas, um eine Brückenhalterung zu erstellen. Geben Sie anschließend langsam frisches Anti-Fade-Reagenz unter das Deckglas, damit es die leeren Stellen ausfüllt. Tun Sie dies sehr vorsichtig, damit das Gehirn und das Glas an Ort und Stelle bleiben. Versiegeln Sie dann das Deckglas mit Nagellack. Zuerst einfach an den Ecken auftragen. Lasse die Ecktupfer 5 bis 10 Minuten trocknen, bevor Du die Versiegelung an den Rändern vervollständigst. Das Gehirn sollte so schnell wie möglich abgebildet werden.

Bilden Sie die montierten Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop ab, das mit einem 40x- oder 63x-Ölobjektiv ausgestattet ist, um Z-Scheiben in der Region des Gehirns zu sammeln, in der die Transgene exprimiert werden. Analysieren Sie dann die Daten, indem Sie die Punktzahl in den einzelnen Z-Segmenten quantifizieren oder alternativ die Segmente in drei Dimensionen rendern.

Um mutierte Huntington-Aggregate zu quantifizieren, die gut voneinander getrennt sind und wenig Hintergrundsignal aufweisen, öffnen Sie die konfokale z-Serie im 3D-Betrachtungsmodus . Verwenden Sie dann den Analyse-Assistenten, um einzelne Stellen in einem ausgewählten Kanal zu identifizieren.

Passen Sie in den Einstellungen die Schwellenwerte und Filter an, um alle heterogen großen Aggregate als einzelne Objekte im Bild genau darzustellen. Aktivieren Sie dann die Option Objekte unter Vorfilter für die binäre Verarbeitung teilen, um eng verknüpfte Aggregate zu trennen. Quantitative Informationen über die von der Software identifizierten Objekte werden unter Messungen ausgewiesen.

Nachdem Sie die Puncta gezählt haben, charakterisieren Sie sie in einer Bildanalysesoftware weiter. Nehmen Sie beispielsweise relevante Messungen der Spots oder Oberflächen vor, um Informationen über den Gesamtdurchmesser, das Volumen oder die Intensität zu erhalten. Einige Wildtyp-Huntington-Aggregate können quantifiziert werden, indem man sich manuell durch den z-Stapel bewegt und grüne Punkte zählt, die vom umgebenden diffusen Signal unterscheidbar sind.

Achten Sie darauf, dass einzelne Aggregate nicht doppelt gezählt werden, wenn sie in mehr als einem Segment vorkommen. Eine weitere interessante Analyse ist die Bestimmung der Häufigkeit der Co-Lokalisierung zwischen Huntington Q25-YFP und Huntington Q91-mCherry-Aggregaten. Tun Sie dies mit manueller Zählung, indem Sie Schicht für Schicht durch einen konfokalen Z-Stapel bewegen.