Name: Hierbei leiten Ablation der Ratte auditorischen Kortex und der Lokalisation der Läsion im Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie die stereotaktisch geführte Ablation des auditorischen Kortex bei Ratten zur Untersuchung kortikaler Funktionen in der Schallwahrnehmung. Diese Methode ermöglicht präzise Läsionslokalisierung durch Koordinatenkarten.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (MINECO) der spanischen Regierung, SAF2016-78898-C2-2-R.

dieser Studie erfolgte in strikter Übereinstimmung mit beiden spanischen Vorschriften (Königliche Dekret 53/2013 - Gesetz 32/2007) und EU-Richtlinien (Richtlinie 2010/63/EU) auf die Pflege und Verwendung von Tieren in der biomedizinischen Forschung.
 1. Vorbereitung der Ratte Hinweis: die Experimente führten wir bei männlichen Ratten hormonellen Veränderungen zu vermeiden.
<ol><li>Anesthetize das Tier mit einem Mix von Ketamin Hydrochlorid (30 mg/kg) und Xylazin-Hydrochlorid (5 mg/kg) intramuskulär injiziert; mit dieser Dosis, die Ratte tief für ca. 1 h. betäubt werden sollte</li>
	<li>Kneifen die Ratte &#39; s Zehe; Abwesenheit eines Rückzugs Reflex zeigt an, dass das Tier völlig unbewusst ist. Wenn die Ratte auf die Prise antwortet, geben zusätzliche Narkose bei einem Drittel der Anfangsdosis.</li>
	<li>Die Kopfhaut rasieren und desinfizieren Sie den OP-Bereich mit Povidon-Jod.</li>
	<li>Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen zu eine Temperatur von 38 ° C erhalten und stabilisieren das Tier &#39; Kopf in einem stereotaktischen Rahmen mit zwei Ohr-Bars und eine Snack-Bar. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden das Trommelfell mit dem Ohr piercing.</li>
	<li>Die Augen schützen, indem Sie jedes Auge einen Tropfen ophthalmologischen Gel oder Serum Kochsalzlösung zuweisen.</li>
</ol> 2. Lage des AC in das Felsenbein der Ratte <ol><li>mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels aussetzen und zurückziehen der Knochenhaut auf der Oberfläche des Schädels machen.</li>
	<li>Einer sterilen Wattetupfer verwenden, um entfernen vorsichtig alle Blut bedecken die Oberfläche des Schädels, Bregma, Lambda und interaural 0 nach der Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn 22 zu visualisieren.</li>
	Einen Einschnitt machen <li>im zeitlichen Muskel in der Nähe seiner dorsalen einfügen auf den Schädel mit einem Skalpell. Ziehen Sie den Muskel mit einer Nadel und Faden Material und beheben Sie Nahtmaterial der stereotaktische Rahmen zu; Dadurch wird das Felsenbein ausgesetzt. Wenn Blutungen auftreten, mit kalten sterilen Kochsalzlösung spülen.</li>
	<li>Legen Sie eine sterile Nadel direkte in die stereotaktische Mikromanipulator, um sicherzustellen, dass es vollständig gesichert ist.</li>
	<li>Senken Sie langsam die Nadel bis es über der Oberfläche des Schädels, stimmt, so dass die Spitze der Nadel auf interaural 0 gesetzt ist. Legen Sie diesen Punkt als Null und Koordinaten ab diesem Zeitpunkt bestimmen.</li>
	<li>Je nach Interessengebiet Gehirn variieren die stereotaktischen Koordinaten. Bestimmen Sie durch die Nutzung des Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn 22 diese Koordinaten. Sobald die Koordinaten bestimmt sind, bewegen Sie die Nadel um diese Koordinaten entsprechen.</li>
	<li>Ziel der AC unter Verwendung der Koordinaten für die folgenden vier Punkte: A: A / P =-5,80 mm, M/L = + / 6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + / 6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + / 8,67 mm. unten die Nadel nach rechts oberhalb des Schläfenbeins, jeder dieser vier Punkte zu visualisieren. Mit einem Filzstift, markieren Sie die Punkte auf dem Felsenbein und verbinden sie zu, um ein Rechteck zu zeichnen; das Rechteck dient als eine Anleitung zum Öffnen eines Fensters im Knochen ( Abbildung 1).</li>
</ol> 3. Chirurgische Exposition des AC <ol><li>öffnen das Fenster mithilfe einer elektrischen Bohrmaschine und einem kleinen Bohrer bit (0,6 mm Ø). Bohren Sie den Umfang des Rechtecks bei 8.000 u/min, bis die Knochen verschenkt. Cool Bohrfläche durch Spülen mit kaltem sterile Kochsalzlösung zu subkortikalen Strukturen verhindern. Wenn die Knochen weicht, kann ein Tropfen im Widerstand erkannt werden. Seien Sie vorsichtig, nicht das Gehirn bohren.</li>
	<li>Wenn die Grenzen locker sind, Hochziehen der Bedeckung Knochen mit feinen Zangen und im kalte sterile Kochsalzlösung aufbewahren.</li>
</ol> 4. Abtragen des AC <ol><li>mit einem Operationsmikroskop (10 X), sanft die Hirnhaut mit einem mikrochirurgischen Messer schneiden und entfernen Sie diese mit zwei feinen Spitzen Pinzette. Wenn Blutungen auftreten, mit kalten sterilen Kochsalzlösung spülen.</li>
	<li>Aspirieren Sie sanft die AC mit einer chirurgischen Saugvorrichtung (-0.24 Druckbalken) gekoppelt mit einer sterilen 20 G stumpfe Spitze Nadel. Dieser Punkt ist von entscheidender Bedeutung und muss sehr sorgfältig durchgeführt werden: aspirieren Sie nur die sechs kortikalen Schichten und nicht die zugrunde liegende weiße Substanz.</li>
	<li>Aspirieren Sie bis die perforierende Arterien Blutung zu stoppen.</li>
	<li>Nach Abschluss die Aspiration decken Sie den verletzten Bereich mit dem extrahierten Knochen und beantragen eine resorbierbare blutstillende Gaze.</li>
	<li>Lassen Sie den zeitlichen Muskel wieder seine ursprüngliche Position, und dann Naht der Haut mit Wunde Clips (9 mm). Antibiotische Salbe (siehe die Tabelle der Materialien). Salbe auf die Wunde zweimal täglich für drei Tage gelten weiterhin. 
	Hinweis: Jede Anwendung besteht aus einer dünnen Schicht auf die Wunde aufgebracht.</li>
	<li>Inject Buprenorphin subkutan im hinteren Teil der Ratte (0,05 mg/kg) als eine analgetische 1 h nach dem Eingriff und dann alle 8 Std. bei 72 h.</li>
	<li>Das Heizkissen das Tier behalten, bis er aufwacht, und senden Sie es an seinem Gehäuse Käfig zu erholen.</li>
	<li>Haus Tiere einzeln zu verhindern, dass Käfig Kumpels Berührung genähten und bieten einige Bereicherung Gegenstände. Das Sägemehl täglich ändern, um Infektionen zu verhindern, und vergewissern Sie sich, dass das Tier richtig erholt und keine Anzeichen von Unbehagen zeigt.</li>
</ol> 5. Gewebe-Sammlung Vorsicht: beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA), festen und wässrigen tragen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) und verwenden Sie ein Sicherheitsschrank.
 Hinweis: bereiten Sie 750 mL Formaldehyd-Lösung durch Auflösen von 4 % (w/V) PFA in 1 x Phosphat gepufferte Lösung (PBS) mit Wärme (55 ° C). Filtern Sie die Formaldehyd-Lösung mit Filterpapier. Bereiten Sie Ringer &#39; s Lösung von 8,5 g NaCl, 0,25 g KCl und 0,2 g Nahco3 3 in 1.000 mL Wasser auflösen (Lösung pH = 6,9).
<ol><li>Lassen Sie das Tier überleben, solange sie für das Studium benötigt wird. Nach Abschluss der Forschungsarbeiten mit der AC abgetragene Ratte betäuben Sie es unheilbar durch Intra peritoneale Injektion von 0,1 mL Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg). Die Tiefe der Narkose durch Zeh kneifen und das Fehlen von Rückzug Reflex zu bewerten.</li>
	<li>Wenn das Tier tief betäubt ist, führen Sie eine intrakardiale Perfusion 23 von 125 mL Ringer &#39; s Lösung gefolgt von 750 mL Formaldehyd-Lösung mithilfe einer Nadelstärke von 1,8 mm Innendurchmesser.</li>
	<li>Nach Abschluss der Perfusion enthaupten die Ratte an der erste Halswirbel.</li>
	<li>Mit einer Schere entfernen die Haut und Muskeln von Kopf und setzen den Schädel. Mit einer Schere schneiden und das Foramen Magnum zu öffnen und entfernen die Rückseite des Schädels.</li>
	<li>Stellen eine transversale in den Augenhöhlenknochen mit Spencer Schere schneiden, und verwenden Sie Rongeurs, an den oberen Rändern des Schädels, das Gehirn aussetzen zu schneiden. Achten Sie darauf, dass nicht das Gehirn beschädigt.</li>
	<li>Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, entfernen Sie vorsichtig die Dura Mater mit feinen Spitzen Pinzette. Verwenden Sie einen Finger zu sanft unter schöpfen und das Gehirn zu erhöhen. Erhöhen Sie das Gehirn zu und schneiden Sie die Nerven untIl ist es kostenlos. Das Gehirn in Formaldehyd-Lösung Tauchen und speichern es bei 4 ° C für 24 h</li>
</ol> 6. Lokalisation der Läsionen AC <ol><li>nach Post-Fixierung, legen Sie sorgfältig das Gehirn in einer sagittalen Ratte Gehirn Matrix Freilegung der Mantelfläche des Gehirns.</li>
	<li>Legen Sie eine Kamera 21 cm über der Kortex-Oberfläche mit einem Kamerahalter, wählen Sie die &#34; super Makro-Aufnahmen &#34;-Modus, und nehmen Sie ein Bild von der Oberfläche des Gehirns.</li>
	<li>Das Gehirn in einen koronalen Ratte Gehirn Matrix Freilegung der dorsalen Oberfläche des Gehirns, und nehmen Sie ein anderes Bild.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilder mit einem Bildbearbeitungsprogramm, und verkleinern sie 50 % machen es einfacher, mit ihnen zu arbeiten. Identifizieren Sie der Bregma, Lambda und interaural 0 Referenzen auf dem Bild nach Paxinos und Watson Koordinaten 19, und markieren Sie ihre Position in den Bildern ( Abbildung 2). Zeichnen Sie die Kontur der Ablation über die seitlichen Bild des Gehirns. Berechnen den Umfang.</li>
	<li>Import die Koordinate Karte wo sind die primären (A1) und sekundären Regionen (dorsalen und ventralen Cortex) des AC befindet sich 18 bis die Datei des Programms Editor, wo Sie mit den Bildern arbeiten. Klicken Sie auf die Karte und ziehen sie es an den seitlichen Fotos des abgetragenen Gehirns überlagern.
	<ol><li>Machen die Bregma und Lambda-Referenzen der Koordinaten Karte übereinstimmen mit den Bregma und Lambda-Referenzen in das Bild des seitlichen Gehirns identifiziert.</li>
		<li>Den rhinal Riss als Referenz verwenden, um das Bild des Gehirns, um die Karte anzupassen, und machen sie übereinstimmen ( Abb. 2 b).</li>
	</ol></li> <li>Berechnen der Anteil der Läsion bezogen auf die Fläche der AC</li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Eine erfolgreiche Gehirnchirurgie hängt von zwei Faktoren ab: das Tier am Leben zu halten, während und nach dem Eingriff und präzise Ortung den Bereich von Interesse. Um sicherzustellen, dass die Ratte ist tief während der Operation (Prüfung des Rücknahme-Reflexes) betäubt, und erhält ausreichend Analgetika und nicht-ototoxische Antibiotika sollte überleben helfen. Darüber hinaus sollte die Ratte auf ein Heizkissen gehalten werden, bis es aus der Narkose wacht um Unterkühlung zu vermeiden. Vernähen verringert sich die Anfälligkeit für Infektionen, und richtige Technik ist wichtig: Tiere holen ihre Wunde Clips, so dass sie fest genug implantiert werden sollte, um zu entfernen ohne dabei zu viel Spannung auf die Wunde zu verhindern.
Zu den AC (oder irgendeinem anderen kortikalen Bereich), genau zu lokalisieren ist wichtig zur Positionsbestimmung von Bregma, Lambda und interaural 0 bis sie als Referenz verwenden, um die Grenzen der Region gezielt zu berechnen. Jeder Fehler bei der Berechnung der Koordinaten führt die teilweise Abtragung des AC oder unerwünschte Aspiration von anderen umliegenden Gebieten. So sollte die Nadelspitze berühren nur die Knochen bei interaural 0 und dann übersetzen die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten entsprechend, was in diesem Protokoll beschrieben ist.
In dieser Handschrift haben wir auch beschrieben, wie Sie chirurgisch freizulegen und Abtragen der AC. Es gibt drei wichtige Schritte: der Bohrvorgang, die Öffnung und Entfernung von der Hirnhaut und die Ablation durch Absaugen. Bohren sollte bei niedriger Drehzahl mit minimaler Druck durchgeführt werden, da eine hohe Bohrgeschwindigkeit Wärme erzeugt, die in der Nähe subkortikalen Strukturen beeinflussen können. Jedoch sollten Beibehaltung einer niedrigen Geschwindigkeit und Bohren Kühlbereich mit kalt sterile Kochsalzlösung eine Beschädigung vermeiden. Darüber hinaus ist Mindestdruck unbedingt zu einen plötzlichen Bruch des Schädels und spätere Verletzungen der zugrunde liegenden Kortex zu vermeiden. Die Öffnung und Entfernung von der Hirnhaut, die die AC abdecken sollte sorgfältig durchgeführt werden, um zu vermeiden, die Blutgefäße zu brechen. Wenn Blutungen auftreten, die frühe und späte Prognose ist im allgemeinen ungünstig und es ist fraglich, ob so ein Tier die Einschlusskriterien für eine zuverlässige Studie entspricht. Wir empfehlen in diesem Fall Euthanasie. Schließlich muss die Aspiration (wahrscheinlich der schwierigste Aspekt bei der Durchführung einer effektiven Läsion), auf die graue Substanz beschränkt. Es gibt zwei Indikatoren, die helfen können das Vorhandensein der weißen Substanz: (1) eine Änderung der Farbkontrast, als die weiße Substanz ist heller als die graue Substanz; (2) die Beendigung von Blutungen aus den perforierende Arterien.
Nachdem jede Manipulation im Gehirn durchgeführt, ist es notwendig, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung des Verfahrens gemacht in der Hirnrinde für die anschließende Analyse und Validierung von Daten, die vom Tier zu beurteilen. In dieser Handschrift die, ausführlich wir die Ablation durchgeführt in der Hirnrinde mit Hilfe einer Koordinaten Karte zuvor beschrieben durch unsere Gruppe18Lokalisierung. Diese Karte wurde gebaut mit anatomischen Referenzen aus seriellen Abschnitt Rekonstruktionen der histologischen Abschnitte, korreliert mit dem Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn22gewonnen. Dementsprechend unterscheidet die Karte zwischen den primären (A1) und sekundäre Rinde (Dorsal und Ventral) des AC. Der Hauptvorteil dieser Koordinaten Karte ist, dass es die schnelle Lokalisierung der Läsion ermöglicht durch die Überlagerung ein Bild aus der Mantelfläche des Gehirns in eine sagittale Gehirn Matrix platziert. Ein weiterer Vorteil ist, dass Labore mit weniger Erfahrung in der Anatomie die Karte verwenden können, durch Anpassung an ihre Tiermodelle. Es ist nur notwendig, die Abstände zwischen Bregma, Lambda und interaural 0 Referenzen in ein Steuerelement durchblutet Gehirn und Skalieren der Karte oben oder unten entsprechend. Verwenden Sie der Rhinal Riss als Referenz, das Bild des Gehirns auf der Karte anpassen. Die Tiefe der Ablation kann nicht in dieser Koordinaten Karte bestimmt werden, so dass es im Gehirn histologischen Abschnitte bestimmt werden sollte.
Die Kombination von stereotaktischen Methoden mit der chirurgischen Exposition des AC sind grundlegende Methoden, die leicht von jedem Ermittler angepasst werden könnte, möchte das AC bei der Ratte zu richten. Dies wäre für ein akutes Experiment oder der Implantation von permanenten Geräte erfordert. Darüber hinaus wurde die chirurgische Ablation des AC zuvor als Vorbild verwendet Studie zu den Auswirkungen der chronischen kortikalen Deprivation in Verhandlung. AC Ablationen könnte auch verwendet werden, um die Effekte zu studieren, die einseitige AC Ablationen in anderen kortikalen Bereichen ausüben, oder dienen als ein Modell eines Schlaganfalls. Die hier beschriebenen Versuchsanordnungen sind hilfreiche Methoden, die einzeln oder in Kombination mit einer Vielzahl von experimentellen Designs angewendet werden können.

Die Ratte ist eines der am häufigsten verwendeten tierischen Modelle in den auditiven Neurowissenschaften. Die Robustheit der sein Verhalten macht es für Hunderte von Studien pro Tag arbeiten. Seine Sensibilität und spektrale Schärfe für Anhörung1,2und der anatomischen und funktionellen Organisation des zentralen Systems, vergleichbar mit anderen Säugetieren3, machen der Ratte einen geeigneten Tiermodell für die Analyse von einer Vielzahl von Forschungsthemen im auditiven Neurowissenschaften. Die Ratte auditorischen Kortex (AC), wurde vor allem Gegenstand mehrere anatomische und physiologische Untersuchungen, die versucht haben, zu verstehen, seine Struktur, Organisation und Rolle bei der Tonbearbeitung3. Heute hat der AC beliebt unter Neurowissenschaftlern Erfahrung-Abhängigkeit Plastizität, auditive Wahrnehmung, die synaptischen Grundlage der rezeptiven Feldorganisation und die kortikale Kontrolle der Klangbearbeitung in die subkortikale auditive interessiert Kerne4,5,6,7,8,9. Zur Bewältigung der Herausforderungen, die diese neuen Ansätze darstellen, werden Verfahren, die genau zu lokalisieren und chirurgisch aussetzen der AC können Forschungsbemühungen beschleunigen. Stereotaktische Techniken machen es einfach, bestimmte Regionen im Gehirn ohne Physiologie Tests zu lokalisieren. Obwohl die Größe des Gehirns leicht variiert zwischen Tieren, kann von jedem Bereich des Gehirns ermittelt werden, wo mit stereotaktischen Koordinaten festlegen von Sehenswürdigkeiten auf den Schädel des Gehirns Ratte.
Die eingeschränkte Ablation des AC ist die chirurgische Entfernung der sensorischen Region der Hirnrinde, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem Gehör. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um die Aktivität des AC, wie z. B. Kühl- oder lokale Lidocain-Injektionen10,11,12, die chirurgische Ablation der AC Ergebnisse in den chronischen Verlust der Funktion blockieren. Damit eignen sich AC Ablationen mehr für das Studium, die langfristigen Auswirkungen der kortikalen Entbehrung, sowie die anschließende Phänomene der Läsion Plastizität. Die Kombination von stereotaktischen Methoden mit chirurgischen Ablationen des AC hat erfolgreich zur Untersuchung der physiologischen, Verhaltens- und molekularen Auswirkungen der kortikalen Kontrolle Entbehrung13,14,15 ,16,17,18,19. Zum Beispiel wurde einem Rattenmodell mit bilateralen AC Ablationen zur Untersuchung der Auswirkungen der kortikalen Ablation im auditiven Startle Reflex und auditory Brainstem Antworten (ABR)16. Vor kurzem haben wir die Auswirkungen, dass einseitige gegenüber bilateralen Ablationen Ratte AC Produkte in ABR Schwellen, Amplituden und Latenzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung18verglichen. Darüber hinaus hat Rattenmodell der restriktiven AC Ablation auch verwendet worden, die Wirkung der Corticofugal Weg Degeneration in den minderwertigen Collicus13,14,15 und das Innenohr17 zu studieren ,19. Nachdem eine solche Manipulation im Gehirn durchgeführt wird, ist es zu prüfen, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung der Läsionen im Kortex gemacht. Obwohl sehr nützlich, die wichtigste Einschränkung der tonotopen Karten basierend auf neuronalen Antworten20,21 sind die elektrophysiologischen Techniken erforderlich um den auditiven Bereichen im Rattengehirn zu suchen. Da nicht alle Labors haben die notwendige Ausrüstung und/oder Know-how, solche Aufnahmen zu machen, haben wir eine Koordinate Karte basierend auf die Übertragung der Cytoarchitectural Grenzen des AC zu einem Bild des Gehirns Oberfläche18. Diese Karte kann sehr nützlich, die AC ohne Physiologie Tests zu finden sein.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die hierbei geführten Lage, chirurgische Exposition und Abtragen des AC bei Ratten. Es beschreibt auch unsere Koordinaten Karte18 verwenden, um der Ausdehnung der Läsion über ein Bild von der Oberfläche der abgetragenen Köpfe leicht zu lokalisieren.

<table><tbody><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental Mikromotor</td><td>W& H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>Diamantfräser</td><td>B Braun</td><td>GD021R</td><td>0,6 mm</td></tr><tr><td>Chirurgisches Absauggerät</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod</td><td>Meda</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>steriles Kochsalzlösungsserum</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G sterile Nadel</td><td>Terumo Neolus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattespitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nahtmaterial</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotische Salbe</td><td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Nadeln</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Schere</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>Spencer Schere</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgisches Messer</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>Resorbierbare hämostatische Gaze</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital Ratte Brain Matrix</td><td>Activational systems Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Olympus 5.1 MP</td><td>C-5060 Weitwinkel-Zoomobjektiv</td><td>F2.8-4.8</td></tr><tr><td>Wundclips</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>Canvas 12</td><td>ACD Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadelstärke</td><td></td><td></td><td>Durchmesser 1,8 mm</td></tr><tr><td>Separatory Trichter</td><td>Labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GluA2 Primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 Primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td></tr><tr><td>GluA3 Primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 Primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

hierbei leiten ablation der ratte auditorischen kortex und der lokalisation der läsion im gehirn

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Die Ratte auditorischen Kortex (AC) wird immer beliebter unter auditiven Neurowissenschaften Ermittler, die Erfahrung-Abhängigkeit Plastizität, auditive Wahrnehmungs-Prozesse und kortikale Kontrolle über Sound-Bearbeitung in den subkortikalen auditiven Kernen interessiert sind. Bewältigung neuer Herausforderungen, ein Verfahren, um genau zu lokalisieren und chirurgisch Expose auditorischen Kortex würde dieser Forschungsanstrengungen zu beschleunigen. Stereotaktische Neurochirurgie wird routinemäßig in der präklinischen Forschung im Tiermodell verwendet, um weiterhin eine Nadel oder Elektrode an einer vordefinierten Position im auditorischen Kortex. In das folgende Protokoll verwenden wir stereotaktische Methoden auf neuartige Weise. Wir identifizieren vier Koordinatenpunkte über die Oberfläche des Temporal bone der Ratte ein Fenster definieren, die nach dem Öffnen genau sowohl die primäre (A1 macht) und sekundäre (Dorsal und Ventral) Cortex des AC mit dieser Methode, führen wir dann eine chirurgische Ablation der AC. Nachdem eine solche Manipulation durchgeführt wird, ist es zu prüfen, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung der Läsionen im Kortex gemacht. So beschreiben wir auch eine Methode zum Auffinden der AC Ablation Obduktion eine Koordinate Parkplan konstruiert durch die Cytoarchitectural Grenzen des AC auf der Oberfläche des Gehirns zu übertragen. Die Kombination aus Lage hierbei geführt und Ablation des AC bei der Lokalisierung der verletzte Bereich in eine Obduktion koordinieren Karte erleichtert die Überprüfung von Informationen, die vom Tier und führt zu einer besseren Analyse und Verständnis der Daten.

Ein hierbei geführte Lage, chirurgische Exposition und einseitige Abtragen des AC durchgeführt in drei Wistar-Ratten. Die Lokalisation der Läsion bestätigte, dass in den drei Ablationen durchgeführt Ratten die Hauptunterteilungen des AC (primäre, dorsalen und ventralen Cortex) eingegriffen, und umfasste eine Reihe von 80 bis 100 % der Gesamtfläche AC (Abb. 2 b).
Das Protokoll hier beschriebenen restriktiven AC Ablationen durchgeführt wurde zuvor in unserem Labor verwendet, um die langfristigen Auswirkungen der kortikalen Kontrolle Deprivation in der auditiven subkortikale Kerne sowie die anschließende Phänomene der Plastizität zu studieren. In diesen Studien wurde das Protokoll vom AC Ablationen validiert durch die Anwendung der physiologischen (ABR), Verhaltensstörungen (Antworten zu erschrecken, prepulse Hemmung; PPI) und molekularen (DNA-Microarrays, qPCR und Western-Blot) Methoden13,14,15,16,17,18,19. Hier, um die Wirksamkeit unseres Protokolls zu demonstrieren, wir lassen die drei AC abgetragen Ratten eine Woche überleben und gesammelten Cochleae während der Gewebe-Sammlung Schritt zu studieren die Veränderungen in der Expression der relevantesten AMPA-Untereinheiten in der Erwachsenen Cochlea vorhanden , GluA2 und GluA3 von qPCR. Der Vergleich zwischen den Protokollen von AC abgetragen Ratten und Sham Kontrolltieren wo der Chirurgie-Prozess aber nicht der kortikalen Ablation durchgeführt wurde zeigte eine Down-Regulierung für GluA2 und ein Up-Verordnung für GluA3 in beiden Cochleae (Abbildung 3) , die ist im Einvernehmen mit unseren bisherigen19studieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Bilder von der Ratte Schläfenbeins an drei verschiedenen chirurgischen Schritte. (A) Übertragung der stereotaktischen Koordinaten des AC auf dem Felsenbein. Die Koordinaten der vier Punkte sind: A: A/P =-5.8 mm, M/L = + / 6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + / 6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + / 8,67 mm. (B) die Koordinaten als Referenz verwendet werden, um ein Rechteck auf der Oberfläche des Schläfenbeins, die die Öffnung eines Fensters führt. (C) zeigt das Fenster nach dem Bohren im Knochen. Die Hirnhaut mit Blutgefäßen können auf der Oberfläche des Gehirns beobachtet werden. R: rostral, D: dorsal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Verfahren zur Ortung von Läsionen im Rattengehirn. (A) Foto von der dorsalen Oberfläche eines AC abgetragen Gehirns mit hierbei implantierten Nadeln in Lambda und Bregma (nach Paxinos und Watson Koordinaten19). Gepunktete Linien markieren die Position der Bregma und Interaural 0 im 9 x 9 cm Raster, ebenso wie in der dorsalen Oberfläche des Gehirns. (B) Foto der Mantelfläche des abgetragenen Gehirns zur Koordinate Karte des AC überlagert. Der Umfang der Läsion ist in der Abbildung rot gekennzeichnet. Der Umfang der AC Fläche ist in schwarz in der Karte gekennzeichnet. In diesem Beispiel ist der Prozentsatz der AC Ablation in Bezug auf die Gesamtfläche von AC besetzt 84.79 %. AC: auditorischen Kortex, IA: inter aural, FR: Rhinal Riss. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Veränderungen der mRNA-Niveaus AMPA-Rezeptor-Untereinheiten GluA2 und GluA3 nach einseitigen AC Ablationen 7 Tage nach Läsion. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung der Falte Änderung. Änderungen für GluA2 Abschriften sind in blau dargestellt. Veränderung für GluA3 Abschriften sind in rot dargestellt. Eine signifikante Abnahme der GluA2 und eine Zunahme der GluA3 werden in beiden Cochleae beobachtet (Ipsi - und kontralateralen auf die Ablation) relativ zu Schein-Steuerelementen mit keine kortikalen Ablationen 7 Tage nach der Operation; Dies ist im Einvernehmen mit unseren bisherigen Ergebnisse19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben eine Methode für die hierbei geführte Lage, Belichtung und Abtragung des auditorischen Kortex bei Ratten. Die Lokalisierung der Ablation wird anhand eine Koordinate Karte Obduktion.

Hierbei leiten Ablation der Ratte auditorischen Kortex und der Lokalisation der Läsion im Gehirn

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die stereotaktisch gesteuerte Ablation des auditorischen Kortex und die Verwendung einer Koordinatenkarte zur Lokalisierung der Läsion über einem Bild der Gehirnoberfläche zu beschreiben. Diese Methode kann den Forschern der auditorischen Neurowissenschaften helfen, die Rolle der Kortikale in der Signalbahn bei der Wahrnehmung von Schall zu untersuchen. Sowie die Mechanismen und die Plastizität der Linienposition.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die chirurgische Freilegung und Ablation des auditorischen Kortex mit grundlegenden Methoden ermöglicht, die von jedem Untersucher angepasst werden können. Diese Methode kann also im Bereich der auditiven Neurowissenschaften nützlich sein, sie kann auch in anderen Systemen wie dem visuellen und somatosensorischen System angewendet werden. Diese Methode kann auch verwendet werden, um Defekte zu untersuchen, die die einseitige Ablation des auditorischen Kortex in anderen kortikalen Bereichen ausübt.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die korrekte Identifizierung und Übersetzung der stereotaktischen Koordinaten in das Schläfenbein für die genaue Lokalisierung des auditorischen Kortex unerlässlich ist. Um diesen Vorgang zu beginnen, legen Sie die betäubte Ratte auf ein Heizkissen, um ihre Körpertemperatur zu halten. Stabilisieren Sie dann den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Rahmen mit zwei Ohrstangen und einer Beißstange.Rasieren Sie die Kopfhaut und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen und das Periost, das die Oberfläche des Schädels bedeckt, zurückzuziehen. Verwenden Sie danach ein steriles Wattestäbchen, um vorsichtig das Blut zu entfernen, das die Oberfläche des Schädels bedeckt.Um Bregma, Lambda und die interaurale Linie sichtbar zu machen, machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in den Schläfenmuskel in der Nähe seines dorsalen Ansatzes am Schädel. Danach ziehen Sie den Muskel mit einer Nadel und Nahtmaterial heraus und fixieren das Nahtmaterial am stereotaktischen Rahmen, um das Schläfenbein freizulegen. Senken Sie eine sterile gerade Nadel langsam ab, bis sie sich direkt über der Schädeloberfläche befindet, so dass die Spitze der Nadel auf interauraler Null eingestellt ist.Legen Sie diesen Punkt auf Null fest. Zielen Sie danach mit vier Punkten auf das AC. Senken Sie dann die Nadel nach rechts über das Schläfenbein, um jeden dieser vier Punkte zu visualisieren.Markieren Sie die Punkte mit einem Marker auf dem Schläfenbein und verbinden Sie sie, um ein Rechteck zu zeichnen. Das Rechteck dient als Orientierungshilfe zum Öffnen eines Fensters im Knochen. Öffnen Sie bei diesem Vorgang das Fenster mit einer elektrischen Bohrmaschine und einem kleinen Bohrer.Bohren Sie den Umfang des Rechtecks bei 8.000 U/min, bis der Knochen nachgibt. Kühlen Sie die Bohrfläche, indem Sie sie mit kalter, steriler Kochsalzlösung abspülen, um eine Beschädigung der subkortikalen Strukturen zu vermeiden. Wenn der Knochen nachgibt, achten Sie darauf, dass Sie nicht in das Gehirn bohren.Wenn die Ränder gelöst sind, ziehen Sie den Deckknochen mit einer feinen Pinzette nach oben und lagern Sie ihn in kalter, steriler Kochsalzlösung. Schneiden Sie mit einem mikrochirurgischen Messer vorsichtig mit einem Operationsmikroskop die Hirnhäute ab und entfernen Sie sie mit zwei feinen Zangen. Wenn Blutungen auftreten, spülen Sie die Operationsstelle mit kalter, steriler Kochsalzlösung aus.Saugen Sie anschließend die Klimaanlage vorsichtig mit einem chirurgischen Absauggerät ab, das mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze gekoppelt ist. Aspirieren Sie nur die sechs kortikalen Schichten und nicht die darunter liegende weiße Substanz. Dieser Punkt ist kritisch und muss sehr sorgfältig durchgeführt werden.Wenn die Aspiration abgeschlossen ist, bedecken Sie die Operationsstelle mit dem extrahierten Knochen und tragen Sie eine resorbierbare hämostatische Gaze auf. Lassen Sie den Schläfenmuskel seine ursprüngliche Position wiederherstellen und nähen Sie die Haut dann mit Wundklammern. Tragen Sie danach eine antibiotische Salbe auf die Wunde auf.Injizieren Sie anschließend Buprenorphin subkutan als Analgetikum in den Rücken der Ratte, eine Stunde und acht Stunden nach Beendigung der Operation. Lassen Sie das Tier auf dem Heizkissen, bis es aufwacht, und bringen Sie es zur Genesung in seinen Stallkäfig zurück. Wenn die mit der AC-ablierten Ratte durchgeführte Forschung abgeschlossen ist, betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion von 0,1 Millilitern Natrium-Pentobarbital.Entfernen Sie nach einer intrakardialen Profusion mit Ringer-Lösung und Formaldehyd die Haut und den Muskel vom Kopf, um den Schädel freizulegen. Machen Sie mit einer Spencer-Schere einen Querschnitt in den Augenhöhlenknochen. Entfernen Sie danach die Rückseite des Schädels und schneiden Sie mit Rongeuren entlang der oberen Ränder des Schädels, um das Gehirn freizulegen.Achte darauf, das Gehirn nicht zu schädigen. Sobald das Gehirn freigelegt ist, entfernen Sie die Dura mater vorsichtig mit einer feinen Zange. Verwenden Sie einen Finger, um das Gehirn sanft zu unterdrücken und anzuheben.Heben Sie dann das Gehirn an und durchtrennen Sie die Nerven, bis es frei ist. Tauchen Sie anschließend das Gehirn in Formaldehydlösung und lagern Sie sie 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Platzieren Sie das Gehirn nach der Fixation vorsichtig in einer sagittalen Rattenhirnmatrix, wobei die laterale Oberfläche des Gehirns freigelegt wird.Platzieren Sie eine Kamera mit einer Kamerahalterung 21 Zentimeter über der Kortexoberfläche. Wählen Sie dann den Super-Makro-Aufnahmemodus und machen Sie ein Bild von der Oberfläche des Gehirns. Öffnen Sie anschließend mit einem Bildbearbeitungsprogramm die Bilder und skalieren Sie sie um 50 % herunterIdentifizieren Sie die Bregma-, Lambda- und interauralen Nullreferenzen und markieren Sie ihre Position in den Bildern.Zeichnen Sie die Kontur der Ablation über das laterale Bild des Gehirns. Importieren Sie die Koordinatenkarte, in der sich die primären und sekundären Regionen des auditorischen Kortex befinden, in die Datei des Editorprogramms. Klicken Sie dann auf die Karte und ziehen Sie sie, um sie mit dem seitlichen Foto des abgetragenen Gehirns zu überlagern.Lassen Sie die Bregma- und Lambda-Referenzen der Koordinatenkarte mit den Bregma- und IA-Referenzen übereinstimmen, die im Bild des lateralen Gehirns identifiziert sind. Verwenden Sie anschließend die Rhinalfissur als Referenz, um das Bild des Gehirns an die Karte anzupassen und sie übereinstimmen zu lassen. Es ist wichtig zu bestätigen, dass die weiße Substanz intakt ist.Dies kann durch anfängliche Immunfärbung des seriellen Schnitts des Gehirns erfolgen. Um die Wirksamkeit unseres Protokolls zu demonstrieren, ließen wir die drei AC-ablierten Ratten, die überlebten, eine Woche lang und sammelten dann die Cochleae, um die Veränderungen in der Expression der wichtigsten AMPA-Untereinheiten in der adulten Cochlea, GluA2 und GluA3, mittels qPCR zu untersuchen. Der Vergleich zwischen den Transkripten von AC-ablierten Ratten und Scheinkontrolltieren zeigte eine Herunterregulierung von GluA2 und eine Hochregulierung von GluA3 in beiden Cochleae, was mit unserer vorherigen Studie übereinstimmt.Bei der Operation ist es wichtig, sich an drei Dinge zu erinnern: das Schläfenbein mit geringster Geschwindigkeit und minimalem Druck zu bohren, die Hirnhäute vorsichtig zu entfernen, um eine Verletzung der Blutgefäße zu vermeiden, und die Aspiration auf die graue Substanz zu beschränken. Sobald sie gemeistert ist, kann die chirurgische Freilegung und Ablation des auditorischen Kortex 45 Minuten dauern, wenn sie richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können physiologische, verhaltenswissenschaftliche und/oder immunzytochemische Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. wie sich das Fehlen des auditorischen Kortex auf die Funktion weiterer sensorischer Systeme auswirkt.

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Wir haben eine Methode zur gleichzeitigen funktionellen Kernspintomographie und elektrophysiologischen Aufnahme in das Nagetier Gehirn entwickelt, eine Plattform für die Untersuchung der Beziehung zwischen neuronaler Aktivität und der Blutoxygenierung level dependent (BOLD) MRT-Signal.

Gleichzeitige fMRI und Elektrophysiologie in der Nager Gehirn

Gezielte Abtragung von spezifischen Hirnregionen (en) durch Infusion unter Verwendung eines stereotaktischen Koordinaten Excitotoxin beschrieben. Diese Technik könnte auch für die Infusion von anderen Chemikalien in dem Gehirn der Ratte angepasst werden.

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Das Video zeigt ein Verfahren zur Implantation einer drahtlosen bidirektionalen Mehrkanal-Elektrodeneinheit in ein Rattengehirn, um mehrkanalige neuronale Netze aufzuzeichnen und zu stimulieren.

Implantation eines drahtlosen bidirektionalen Mikroelektrodensystems in ein Rattengehirn

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Induktion von Gewebeschäden oder Infarkten in den Pons einer anästhesierten Ratte mittels elektrischer Stimulation.

Induktion eines akuten Pons-Infarkts in einem Rattenmodell mittels Elektrostimulation

Dieses Video zeigt ein stereotaktisch geführtes chirurgisches Verfahren zur Ablation des auditorischen Kortex bei einer Ratte. Zu den Schritten gehören die Identifizierung anatomischer Orientierungspunkte bei einer anästhesierten Ratte, die in einem stereotaktischen Rahmen gesichert ist, die Schaffung eines Fensters am Schädel über dem auditorischen Kortex, die Aspiration der kortikalen Schichten und die postoperative Versorgung, um die Auswirkungen der Ablation auf die Klangverarbeitung zu...

Eine stereotaktisch gesteuerte Ablationstechnik zur Entfernung der auditorischen Hirnrinde bei Ratten

Dieses Protokoll beschreibt eine Standardmethode für den Nagetieren gleichzeitigen funktionellen Magnetresonanztomographie und der tiefen Hirnstimulation. Die kombinierte Verwendung dieser experimentellen Werkzeuge ermöglicht die Erforschung des globalen abwärts Aktivität in Reaktion auf eine elektrische Stimulation an praktisch jeder Gehirnziel.

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

Ein Verfahren zur Implantation von Elektroden in den subthalamischen Kern (STN) von Ratten wird beschrieben. Eine bessere Lokalisierung des STN wurde durch den Einsatz eines Mikroaufzeichnungssystems erreicht. Des Weiteren wird ein Stimulationsaufbau vorgestellt, der sich durch lang anhaltende Verbindungen zwischen dem Kopf des Tieres und dem Stimulator auszeichnet.

Mikroelektroden-geführte Implantation von Elektroden in den Nucleus subthalamicus des Rats für die Langzeit-Tiefe Hirnstimulation

In dieser Studie wird die Methodik vorgestellt, wie man mehrfache in vivo elektrophysiologische Aufnahmen aus dem hyperdirekten Weg unter Urethananästhesie durchführt.

Akut<em&gt; In vivo</em&gt; Elektrophysiologische Aufzeichnungen von lokalen Feldpotentialen und Multi-Unit-Aktivitäten von der Hyperdirect-Pathway in anästhesierten Ratten

Ein kabelloses, bidirektionale System für neuronale Mehrkanal-Aufnahmen und Stimulation in Ratten frei Verhalten wird eingeführt. Das System ist leicht und kompakt, so dass nur minimale Auswirkungen auf die Futtersorten Verhaltensrepertoire. Darüber hinaus bietet dieses bidirektionale System ein ausgefeiltes Instrument um kausale Zusammenhänge zwischen Aktivierungsmuster Gehirn und Verhalten zu beurteilen.

Ein kabelloses, bidirektionale Schnittstelle für In Vivo Aufnahme und Stimulation der neuronalen Aktivität in Ratten frei Verhalten

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur gleichzeitigen Erfassung von Co lokalisierte Elektroenzephalographie (EEG) und Multi-laminar lokales Feld bei einem anästhesierten Ratte. Eine Grat-Bohrung im Schädel für das Einfügen von einer Mikroelektrode erweist sich vernachlässigbar Verzerrung des EEG Signals zu produzieren.

Gleichzeitige Aufnahme von Co lokalisierte Elektroenzephalographie und lokales Feld Potential in Nagetier

Wir beschreiben eine präklinische experimentelle Methode zur Bewertung der metabolischen Neuromodulation, die durch akute Tiefe Hirnstimulation mit in vivo FDG-PET induziert wird. Dieses Manuskript umfasst alle experimentellen Schritte, von der stereotaktischen Chirurgie über die Anwendung der Stimulationsbehandlung bis hin zur Aufnahme, Verarbeitung und Analyse von PET-Bildern.

Im lebenden Organismus Positronen-Emissions-Tomographie zur Aufdeckung von Aktivitätsmustern, die durch tiefe Hirnstimulation bei Ratten induziert werden

Lernen Sie die stereotaktisch geführte Ablation des auditorischen Kortex bei Ratten zur Untersuchung kortikaler Funktionen in der Schallwahrnehmung. Diese Methode ermöglicht präzise Läsionslokalisierung durch Koordinatenkarten.

Hierbei leiten Ablation der Ratte auditorischen Kortex und der Lokalisation der Läsion im Gehirn

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