Name: Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie lipidsenkende Medikamente die Morphologie von Cholesterinpartikeln modulieren. Diese Studie nutzt die Plaque-Array-Methode mit Imaging-Flow-Zytometrie, um Biomarker für die Atherosklerose-Diagnostik zu identifizieren.

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Diese Arbeit wurde durch eine Plaxgen Forschung finanziert Stipendium an SM (PLX-1008). Wir danken für das Sammeln von Serumproben von Atherosklerose Untertanen unter Zustimmung der IRB Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute.

1. Vorbereitung der Fluoreszenz-markierten Cholesterin und Lipidsenker Hinweis: fluoreszierende beschriftet Cholesterin Aggregate und Statine wurden vorbereitet, wie im vorherigen Artikel beschrieben 21. Informationen von Reagenzien, imaging Durchflusszytometer, Chemie-Analysatoren und Datenanalyse-Software in dieser Studie verwendeten Tabelle der Materialien finden.
<ol><li>Solubilisieren Leuchtstofflampen beschriftet lyophilisierter Cholesterin (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) Pulver in 1 mL 100 % Alkohol.</li>
	<li>Die Probe für 3 min bei 2.040 x g Zentrifugieren und verwenden Sie die Überstände mit löslichen Fluoreszenz-markierten Cholesterin Aggregate in der Plaque Array Assays.</li>
	<li>Zur Herstellung von Medikamenten, individuell solubilisieren Pulver (2 mg) von Simvastatin, Lovastatin, Atorvastatin, Ezetimib und Omega-3-Fettsäure in 1 ml 100 % Alkohol.</li>
	<li>Nach Zentrifugation für 3 min bei 2.040 x g, verwenden Sie die Überstände, die Drogen in der Probe enthalten.</li>
	<li>In ähnlicher Weise anderweitig individuell Pulver (2 mg) von Fluvastatin, Rosuvastatin, Niacin, und fibrate in 1 mL entionisiertem Wasser zu einer Stammlösung von 2 mg/mL.</li>
	<li>Nach Zentrifugation für 3 min bei 2.040 x g, verwenden Sie die Überstände mit Drogen in der Plaque Array Assays.</li>
</ol> 2. Plaque-Array-Assay für Prüfungs-In vitro- Cholesterin-Partikel-Bildung <ol><li>Verwendung Chemie Analyzer-1 (siehe Tabelle der Materialien), um die Plaque-Array-Assay für Cholesterin-Partikel-Bildung einzurichten. Führen Sie den Assay in rundem Boden, eiweißarme Bindung 96-Well-Platte mit den Reagenzien, die in Abschnitt 1 vorbereitet. Das endgültige Reaktionsvolumen in jede Vertiefung in 200 µL pflegen und führen alle Assays in dreifacher Ausfertigung.
	<ol><li>Zuerst, Last 194,5 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung.</li>
		<li>Jeweils gut 2,5 µL (5 µg) jeder lipidsenkenden Medikamenten-Lösung hinzufügen und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte um das Medikament gleichmäßig in Lösung zu mischen. Kein Medikament wird hinzugefügt, um die negativen Kontrollproben.</li>
		<li>Schließlich jede Vertiefung 2 µL (2 µg) Leuchtstofflampen beschriftet Cholesterin aggregierte Lösung hinzu und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte auf einem Lab-Shaker für 2 h bei 37 ° C und 200 u/min eingestellt.</li>
		<li>Nach der Inkubation erwerben Bilder von Partikeln durch bildgebende Durchflusszytometrie.</li>
	</ol></li></ol> 3. Bilder von Cholesterin Partikel mittels Imaging Flow Cytometry Erfassung <ol><li>öffnen die Datenvorlage Akquisition, die richtigen Einstellungen zu laden. Klicken Sie " Datei ", und wählen Sie dann " geöffnete Vorlage … " und wählen Sie die Vorlagendatei.</li>
	<li>Klicken Sie " Flush, Lock, Last ", das Instrument für Probenbeladung vorzubereiten.</li>
	<li>Wenn die " laden Probe " Dialog öffnet sich, klicken Sie auf " OK " 50 µL der Proben von jedem gut vorbereitet in Abschnitt 2 in der bildgebenden Durchflusszytometer laden.</li>
	<li>Klicken Sie " laufen | Setup ", die Partikel im Bereich Bildverarbeitung in Echtzeit anzeigen.</li>
	<li>Wenn die Partikel in der imaging-Bereich in guten Fokus sind klicken Sie auf " ausführen | Erwerben, ", Bilder der einzelnen Objekte gleichzeitig in einer Hochdurchsatz-Weise für Dunkelfeld (Side Scatter/SSC), Hellfeld (BF), grüne Fluoreszenz und gelbe Fluoreszenz erwerben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.5 um 5.000-10.000 Partikel von jeder Probe erwerben.</li>
	<li>Analysieren alle raw-Bilddateien mit der Bildanalyse-Software zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität Objekt und morphologische Varianten.
	<ol><li>Klicken Sie auf die " Tools " Schaltfläche am oberen Rand der Bildanalyse-Software, und wählen Sie dann " Batch-Daten-Dateien " aus dem Dropdown-Menü öffnet die die " Chargen " Fenster.</li>
		<li>In der " Chargen " Fenster, klicken Sie auf die " Batch hinzufügen " Schaltfläche, öffnet die " definieren eine Charge " Fenster.</li>
		<li>In der " definieren einen Batch " Fenster, klicken Sie auf die " Dateien hinzufügen " Taste und wählen Sie die raw-Bild-Dateien, klicken Sie auf die " Vorlage " Taste und wählen Sie die entsprechenden Daten-Analyse-Template-Datei, und wählen Sie dann " "OK" " und " einreichen Chargen " Verarbeitung und Analyse der raw-Bilddateien beginnen.</li>
	</ol></li></ol> 4. Plaque Array Assays basierte Auswertung von lipidsenkenden Medikamenten Wirkung auf gereinigt Cholesterin-Partikel <ol><li>wie unter Punkt 2.1 beschrieben durchführen den Cholesterin Partikel Bildung Assay mit gereinigtem VLDL, LDL und HDL-Lipoproteine/Partikel. Führen Sie Plaque Array Assays in eine 96-Well-Platte.
	<ol><li>Zuerst, laden alle Vertiefungen mit PBS; verwenden Sie eine 200 µL Endvolumen für jedes gut.</li>
	</ol></li> <li>Für negative Kontrolle hinzufügen 4 µg VLDL, LDL oder HDL Proteine/Partikel einzeln in jedem auch ohne Drogen und schütteln Sie die Platte für 30 s.
	<ol><li>Für die Prüfung der Lipid-senkende Wirkung, hinzufügen 4 µg VLDL, LDL oder HDL Proteine/Partikel individuell zu jedem gut und schütteln Sie die Platte für 30 s.</li>
		<li>Für Brunnen mit 4 µg VLDL, LDL und HDL hinzugefügt, fügen 2,5 µL (5 µg) Ezetimib, Lovastatin, Simvastatin oder Niacin-Lösung und schütteln Sie die Platte für 30 s indem man sie in Chemie Analyzer-1.</li>
		<li>Schließlich alle Brunnen 2 µL (2 µg) Fluoreszenz-markierten Cholesterin aggregierte Lösung hinzu und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte.</li>
	</ol></li> <li>Die Platte für 2 h in einem Labor-Shaker set bei 37 ° C und 200 u/min inkubieren.</li>
	<li>Erwerben die Proben unter Verwendung bildgebender Durchflusszytometrie nach Schritte 3.1-3.5.</li>
	<li>Raw-Bilddateien mit Bildanalyse-Software, wie unter Punkt 3.7 beschrieben zu analysieren.</li>
	<li>In der Analyse-Vorlage verwenden das folgende gating Schema zur Identifizierung von Cholesterin-Partikel-Subpopulationen.
	<ol><li>Auf einem Grundstück von Grünkanal gesättigt Pixelzahl (x-Achse) und Dunkelfeld-Kanal gesättigten Pixelzahl (y-Achse), Objekte mit einer oder mehreren gesättigten Pixel in jedem Kanal ablehnen.</li>
		<li>Zeichnen die Objekte/Partikel ohne gesättigten Pixel mit Grünkanal Intensität (x-Achse) und SSC Intensität (y-Achse): Gegenstände fallen in eine der drei Regionen (VLDL, LDL, HDL) anhand ihrer Grünkanal und SSC Intensitäten. 
		Hinweis: Diese Tore wurden erstellt, basierend auf Daten aus Experimente mit gereinigten VLDL, LDL und HDL Partikel/Proteine ohne die Droge durchgeführt.</li>
	</ol></li> <li>Um die Lipid-senkenden Medikament Wirkung für jede Probe ermitteln, berechnen Sie total Lipoprotein Partikel Konzentrationen sowie der Prozentsatz der einzelnen Teilgesamtheit (VLDL, LDL, HDL) als beschrieben Schritt 6.5.
	<ol><li>Berechnen die Partikel Konzentrationen (Partikel/mL) mit Hilfe der folgenden Gleichung: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> Hinweis: die VLDL, LDL und HDL Anspritzung Regionen in den Fluoreszenz-Dot-Plot erkennen ~ 80 % von ihren jeweiligen Untergruppen, und die restlichen ~ 20 % der Partikel überschneiden sich mit anderen gating Regionen.</li>
	</ol></li></ol> 5. Messung der Lipid-Konzentrationen im Serumproben <ol><li>für die Bestimmung der Konzentrationen von LDL, HDL, Cholesterin und Triglyceriden durch Chemie Analyzer-2, verwenden Serumproben aus Alter abgestimmt Normal und Dyslipidämie Themen.</li>
	<li>Definieren Sie abnormale Konzentration von LDL, HDL, Cholesterin und Triglyceride, die basierend auf ihrer Konzentration identifiziert darüber hinaus die obere und untere Referenzwerte in Serumproben.</li>
	<li>Folgen die normalen Referenz-Wert-EmpfehlungenDED vom Reagenz Hersteller: Cholesterin (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) und Triglyceride (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identifizieren, die einen abnormalen Wert haben, wie unter dem niedrigeren Referenzwert oder über die höheren Referenz für Cholesterin und Triglyceride Wert, und sie für das Screening in an- und Abwesenheit von lipidsenkenden Medikamenten Serumproben.</li>
</ol> 6. Analyse der Wirkung von Drogen auf Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben <ol><li>Gebrauch der Chemie Analyzer-1, um die Plaque-Array-Assay für Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben einzurichten. Führen Sie den Assay in rundem Boden, eiweißarme Bindung 96-Well-Platte. Verwenden Sie eine endgültige Reaktionsvolumen von 200 µL/Well und führen alle Assays in dreifacher Ausfertigung.</li>
	<li>Die Platte durch das Laden von Reagenzien in gewissem Sinne schrittweise vorbereiten.
	<ol><li>Bereiten die Kontroll-Vertiefungen.</li>
		<li>Last 193 µL PBS in jede Vertiefung.</li>
		<li>Fügen 2,5 % (V/V) Patientenserum (nur eine Serumprobe pro Well) und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer Reaktion Platte.</li>
		<li>Add 2 µL (2 µg) Fluoreszenz-markierten Cholesterinspiegel aggregieren Lösung in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf eine Chemie-Analysator-1 Reaktion-Platte.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten die Brunnen mit Drogen.
	<ol><li>Last 191 µL PBS in jede Vertiefung.</li>
		<li>Fügen 2,5 % (V/V) Patientenserum (nur eine Serumprobe pro Well) und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf eine Chemie-Analysator-1 Reaktion-Platte.</li>
		<li>Add 2 µL Ezetimib, Lovastatin, Simvastatin oder Niacin-Lösung (4 µg) in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrolle Brunnen. Fügen Sie nur ein Medikament pro Bohrloch und schütteln die Platte für 30 s, indem es auf eine Chemie-Analysator-1 Reaktion-Platte.</li>
		<li>Add 2 µL der Fluoreszenz-markierten Cholesterin aggregieren Lösung (2 µg) in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte.</li>
	</ol></li> <li>Laden Sie Medikamente nur nach alle Wells (Steuern und Medikament behandelten) mit ihren jeweiligen Serumproben geladen wurden, und fügen Sie Fluoreszenz-markierten Cholesterinspiegel am Ende dieses Schrittes.</li>
	<li>Die Platte für 2 h in einem Labor-Shaker set bei 37 ° C und 200 u/min inkubieren.</li>
	<li>Erwerben die Proben durch bildgebende Durchflusszytometer folgenden Einstellungen beschrieben Schritte 3.1-3.6.</li>
	<li>Das Bild Analyse Software für Batch-Verarbeitung alle Image-Dateien, die über die gleiche Vorlage wie 3.7 beschrieben.
	<ol><li>Die Datenanalyse durch Tore auf dem Grundstück zu zeichnen, wie 4.5 und 4.6 beschrieben.</li>
	</ol></li> <li>An die Lipid-senkenden Medikament Wirkung/Antwort (niedrig, moderat und hoch) für jede Probe bestimmen, zu berechnen, die total Lipoprotein Partikelkonzentration sowie den Prozentsatz der die Gesamtzahl Partikeln bestehend aus VLDL, LDL und HDL Subpopulationen.</li>
	<li>Plotten der VLDL, LDL und HDL Populationen auf ein Histogramm des Objekts ' s Hellfeld Bild, Breite (Länge - Breite) und Tor in entweder kugelförmig oder lineare Regionen subtrahiert: Objekte mit (Länge - Breite) ≤ 2 µm fallen in die kugelförmige Region für die Berechnung des Anteils von Kugelsternhaufen und lineare geprägt Partikel.</li>
	<li>Vergleichen Sie den Prozentsatz von Kugelsternhaufen und linear geformten LDL und HDL Cholesterin Partikel für jede Serumprobe inkubiert, mit und ohne jedes Medikament identifiziert. Unter dreifacher Werte für jede Serumprobe, akzeptieren der Prozentsatz der kugelige und lineare Form LDL und HDL-Partikel, die in SD ±2 Bereich zur Bestimmung von der Drogenwirkung fallen.</li>
</ol>

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</ol>

Dr. Madasamy erhielt Zuschüsse von Plaxgen, Inc. und hat ein konkurrierendes finanzielles Interesse. Die anderen Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte offenlegen.

Im Allgemeinen sind die Verteilung und die funktionellen Eigenschaften der VLDL, LDL und HDL-Cholesterin-Partikel in den Blutkreislauf hauptsächlich durch metabolische, genetische, epidemiologischen, Mobilfunk und Plasma Faktoren22,23bestimmt. In der vorliegenden Studie untersucht die Auswirkungen der Lipid-modifizierende Drogen im Puffer ergab, dass hoch lipophile Drogen wie Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Atorvastatin eine höhere Ebene Komplexität auf die Morphologie der Cholesterin-Partikel induziert im Vergleich zu der unteren Ebene Wirkung mit hoch hydrophilen Rosuvastatin und Fluvastatin Drogen beobachtet. Diese Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit unseren früheren Studie beschreibt eine nicht-enzymatische Mechanismus Wirkung von Statinen LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in den Puffer und Serum Proben21Modulation. Dementsprechend zeigten die Ergebnisse aus dieser Studie ein nicht-enzymatische Wirkmechanismus von Ezetimib, Niacin, fibrate, und Omega-3-Fettsäure-Drogen, die eine direkte Rolle bei der Modulation der Cholesterin-Partikel-Bildung spielen können. Es ist möglich, dass die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Cholesterin Aggregate führt bis zur Montage von Großformat-Cholesterin-Partikel, die 2-60 µm2, sind kugelförmig und linearen Strang Morphologien ausstellen.
Außerdem empfehlen die erzielten Ergebnisse mit gereinigtem Lipoprotein Partikel Wechselwirkungen zwischen Cholesterin Aggregate und Plasma Faktoren einschließlich VLDL, LDL und HDL Proteine, die die Kompositionen und die morphologischen Eigenschaften des Cholesterins verändern kann Partikel. Die Droge Behandlungsergebnisse mit gereinigtem Lipoprotein Partikel zeigten eine höhere Ebene Drogenwirkung auf VLDL-Partikel-Bildung im Vergleich zu ihrer Wirkung auf LDL-Cholesterin-Partikel-Bildung beobachtet. Die Lovastatin, Simvastatin und Ezetimib Medikamente dienten als Pro-Drogen und ihre Dosen in den Tests können höher sein als die physiologischen Konzentrationen.
Interessant, geformte screening von Serumproben zeigte Variationen der Drogenwirkung auf die Profile der VLDL, LDL und HDL-Cholesterin-Partikel-Bildung zu verändern, insbesondere deren Auswirkungen auf die Formationen der lineare LDL und HDL-Partikel. Diese Medikamente induzierte Reduktion auf lineare geformte LDL und HDL Cholesterin Partikel Bildung in Dyslipidämie und normalen Serumproben Alter abgestimmt. Die Arzneimittelwirkungen beobachtet auf die Verringerung der linear geformten Partikeln Bildung lag in Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin. Die Identifizierung von Cholesterin-Partikel mit kugelförmigen und linearen Strang Morphologien in Normal und Dyslipidämie Serumproben deutet darauf hin, dass Teilchen mit ähnlichen Morphologien in in Vivo Bedingungen bilden können. Frühere Studien haben das Vorhandensein von Scheibe und nadelartige Cholesterin-Kristalle in den atherosklerotischen Plaques Menschen- und ApoE- / - und LDLR- / - Mäusen Modelle24,25,26 identifiziert. ,27,28.
Die HDL-Partikel im Blut zirkulierenden vorhanden sein, da eine heterogene Mischung und das Niveau der klein und groß HDL-Partikel sowie funktionelle Aktivität wichtige Faktoren sind, die ihre Herz-Kreislauf-Schutz wirken über den umgekehrten Cholesterin-transport Weg29,30. Jüngste Studien haben deutlich gemacht, dass die Bedeutung der Identifizierung von HDL-Cholesterin Partikel Unterfraktionen für die Aufklärung ihrer Rolle in mehrere biologische Funktionen wie Cholesterin Efflux, entzündungshemmende, Anti-thrombotische und anti-oxidativen31 . Darüber hinaus haben eine Reihe von Studien die Wirkung der lipidsenkenden Therapie bei der Steigerung von eines niedrigen Niveau von HDL im Plasma1,5,21moderieren berichtet. Entsprechend liefern der Ergebnisse aus dieser Studie neue Erkenntnisse auf morphologische Merkmale der Cholesterin-Partikel. Insbesondere die Erkennung von einer höheren Ebene linear geformten HDL Cholesterin-Partikel in Serumproben von Dyslipidämie Themen legt nahe, dass sie die verlässliche Biomarker für die Diagnose und Bewertung der Auswirkungen der Lipid-modifizierende möglicherweise Drogen bei Patienten. Weitere ist Untersuchung jedoch erforderlich, mit großen klinischen Proben, um die Cholesterin-Partikel mit verschiedenen Morphologien und deren Zuordnung zu CVD besser zu verstehen.
In der Plaque Array Assays für die Prüfung der Drogenwirkung auf Montage von Cholesterin-Partikel, verwendeten wir 2 µg der Fluoreszenz bezeichnet Cholesterin Aggregate und 5 µgof Droge, weil: (1) Drogen kompetitiv an beiden Fluoreszenz bezeichnet Cholesterin binden und endogene Lipide in die Serumproben vorhanden; (2) von jeder Probe erwarben wir 5.000 bis 10.000 Cholesterin-Partikel, die in großen Größen und Formen von ~ 2-60 µ2montiert werden; (3) Wir beobachteten eine große Unterschiede der Droge Reaktion zwischen Serumproben inkubiert mit Drogen (Dosen 300 ng zu 5 µg) und ~ 1-5 % von ihnen inkubiert mit hohen Dosen zeigten keine nachweisbaren Änderungen im Profil der Cholesterin-Partikel-Bildung; und (4) die Interaktion zwischen Cholesterin Aggregate und Lipidsenker wird durch ein nicht-enzymatische Prozess vermittelt. Daher können die Konzentrationen der im Test verwendeten Reagenzien höher als ihre physiologischen Ebene sein.
Zusammenfassend haben wir erfolgreich demonstriert die Vorteile einer in-vitro- bildgebendes Verfahren beschrieben in dieser Studie zur Bestimmung der Wirkung eines breiten Spektrums von lipidsenkenden Medikamenten auf modulierenden Morphologie und Zusammensetzung des Cholesterins Partikel. Der Ansatz der Visualisierung und Quantifizierung der Morphologie der Lipid-Teilchen durch den Einsatz einer Konstellation von Bild-Analyse-Algorithmen kann helfen, die Diagnose der Atherosklerose und Ergebnisse der lipidsenkenden Therapie bei Patienten zu bewerten.

Zahlreiche klinische Studien haben bewiesen, wohltuende Wirkung der Lipid-senkende Medikamente bei der Verringerung der Plasmaspiegel von Low-Density-Lipoproteine (LDL) Cholesterin und einem niedrigen bis moderaten Anstieg der High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin, die primäre und sekundäre Vorfälle im Zusammenhang mit Arteriosklerose kardiovaskuläre Nebenwirkungen1,2,3,4,5verhindert. Statine, eine Gruppe von HMG-CoA-Reduktase-Enzym-Inhibitoren, blockieren die körpereigene Cholesterinsynthese in der Leber, dass wiederum führen zu niedrigeren Niveaus von LDL-Cholesterin im Blut6,7im Umlauf. Ebenso ist die Senkung der Wirkung von Niacin Lipid durch seine direkte und nichtkompetitiv Hemmung der Hepatozyten Diacylglycerol Acyltransferase-2, ein Schlüsselenzym Leber beteiligt Triglycerid-Synthese8vermittelt. Vergleichsweise, reduziert Ezetimib Plasmaspiegel von LDL durch die Absorption der exogene Cholesterin durch die Bindung an Niemann-Pick-C1-Like-1 (NPC1L1) Protein befindet sich in den Epithelzellen des Dünndarms9Begrenzung. Fenofibrate, einem anderen Lipid-senkenden Medikament, reduziert deutlich die Plasmakonzentrationen von Triglyceriden und LDL-Cholesterin durch das Peroxisom davon aktiviert Rezeptoren Weg10auch mäßig verringert. Außerdem ist Omega-3-Fettsäure berichtet, um die Anti-atherosklerotische Wirkung wegen seiner Fähigkeit, die Plasmaspiegel von LDL11zu senken.
Lipidsenker, neben ihrer primären Effekt auf die Senkung des LDL-Cholesterins, haben eine Reihe von vorteilhaften pleiotrope Effekte einschließlich Erhöhung der HDL, Verbesserung der endotheliale Funktionen, Verringerung der Entzündung und Hemmung der Thrombozyten Aggregationen12,13,14. Aber der zugrunde liegende Mechanismus dieser Medikamente bei Erhöhung der HDL-Cholesterin-Partikel und ändern ihre strukturellen Merkmale sind nicht vollständig geklärt. Da diese Medikamente häufig zur Behandlung von Atherosklerose-Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) vorgeschrieben sind, gilt es weiter zu untersuchen, ihre mögliche Rolle bei der Bestimmung der morphologischen Merkmale und Verteilung der Lipid-Partikel. Die menschlichen Plasma-Lipidome besteht aus etwa 600 verschiedene Lipide und 22 verschiedenen molekularen Arten von Lipoproteinen, die in verschiedenen Größen, Formen, dichten und Kompositionen15,16,17 . Analytische Methoden wie Ultra-Zentrifugation, NMR und Gradienten Gelelektrophorese werden verwendet, um LDL und HDL-Partikel und ihre Unterfraktionen18,19charakterisieren. Jedoch beschränkt sich die Anwendung dieser Methoden auf Studien zur Bestimmung der Wirkung von Drogen in der modulierenden Morphologie und Montage der Lipid-Partikel. Flow Cytometer basierend Plaque Array ist eine funktionelle biochemischen Assays entwickelt, für die Erkennung und Visualisierung von Serum Lipid und Amyloid Plakette Partikel20abgeleitet. Die Vorteile von in-vitro- bildgebendes Verfahren, die in dieser Studie beschriebenen ermöglicht die Identifizierung von Lipid-modulierende Drogenwirkungen Morphologie und Verteilung von Cholesterin-Partikel im Puffer und Serumproben zu ändern.

<table><tbody><tr><td>TopFluor fluoreszierendes Cholesterin</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td></td><td>speichern 100 & Mikro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Simvastatin (pro-drug)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Lovastatin (pro-drug)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>rosuvastatin</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>atorvastatin</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fluvastatin</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>Lager 100 &Mikro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ezetimib (pro-drug)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Niacin</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 & micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fibrat</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Omega-3-Fettsäure</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>gereinigte VLDL-Proteine/-Partikel</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gereinigte LDL-Proteine/-Partikel</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gereinigte HDL-Proteine/-Partikel</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum für Menschen altersangepasstes</td><td>Dx-Bioproben</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atherosklerose-Serum für den Menschen</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normales Serum für Menschen</td><td>Stanford </td> Reagenzienpackung für LDL-Messungen für Blutzentren <td></td><td></td></tr><tr><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenzienpackung für HDL-Messungen</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Messung des Gesamtcholesterinspiegels</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triglyceridmessung</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis Imaging Durchflusszytometer</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Bildanalysesoftware</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differentielle effekte von lipidsenkenden medikamenten modulation morphologie der cholesterin-partikel

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Behandlung von Dyslipidämie Patienten mit lipidsenkenden Medikamenten führt zu einem deutlichen Rückgang der Low-Density-Lipoproteine (LDL) Ebene und eine geringe bis mäßige Niveau der Anstieg des High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterins im Plasma. Allerdings ist eine mögliche Rolle dieser Medikamente bei Veränderung der Morphologie und Verteilung von Cholesterin-Partikel schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die in-vitro- Bewertung der lipidsenkenden Drogenwirkungen Modulation morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel mit der Plaque-Array-Methode in Kombination mit bildgebenden Durchflusszytometrie. Bild-Analysen der Cholesterin-Partikel angedeutet, dass Lovastatin, Simvastatin, Ezetimib und Atorvastatin die Bildung von Kugelsternhaufen und linearen Strang geformt Partikel induzieren, veranlaßt Niacin, Fibrate, Fluvastatin und Rosuvastatin das Bildung von nur kugelig geformten Partikeln. Nächste, gereinigte sehr Low density Lipoprotein (VLDL) und LDL-Partikel, die mit diesen Medikamenten inkubiert zeigten Veränderungen in der Morphologie und Image Textur des Cholesterins Partikel Subpopulationen. Screening von 50 Serumproben ergab darüber hinaus die Anwesenheit von ein höheres Maß an lineare geformte HDL-Cholesterin-Partikel bei Patienten mit Dyslipidämie (Mittelwert von 18,3 %) im Vergleich zu den Beispielen Alter abgestimmt Normal (Mittelwert von 11,1 %). Wir beobachten auch, dass erhebliche Unterschiede in Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen auf die Verringerung der linearen LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben geformt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Lipidsenker, neben ihrer Zell-vermittelten lipidsenkende Wirkung, Morphologie der Cholesterin-Partikel direkt von einem nicht-enzymatische Wirkmechanismus modulieren können. Die Ergebnisse dieser Ergebnisse haben Potenzial, Diagnose der Atherosklerose zu informieren und optimalen lipidsenkenden Therapie vorherzusagen.

Das Ziel dieser Studie war es, in-vitro- Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen Modulation der Morphologie der Cholesterin-Partikel zu bewerten. Vergleich der Lipidsenker ergab Variationen in ihrer Wirkung Modulation der morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel.

Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die Wirkung von lipidsenkenden Arzneimitteln bei der Modulation morphologischer Merkmale von Cholesterinpartikeln mit Hilfe einer Plaque-Array-Methode zu bewerten und potenzielle Biomarker für die Diagnose von Atherosklerose und die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen zu identifizieren. Die Rolle von lipidsenkenden Arzneimitteln bei der Modulation der Bildung von Cholesterinpartikeln ist nur unzureichend verstanden. Hier zeigen wir, dass lipidsenkende Medikamente eine direkte Rolle bei der Veränderung von Profilen und morphologischen Merkmalen der Bildung von Cholesterinpartikeln spielen.Der Hauptvorteil des auf Plaque-Arrays basierenden In-vitro-Bildgebungsverfahrens gegenüber anderen Partikelnachweismethoden besteht darin, dass es die Visualisierung von Cholesterinpartikeln zur Bewertung der Wirkung von lipidsenkenden Arzneimitteln im Serum ermöglicht. Jason Lundry, Labortechniker bei Plaxgen, wird demonstrieren, wie wir den Plaque-Array-Assay mit einem chemischen Analysator einrichten. Raymond Kong, leitender Wissenschaftler bei Millipore Sigma, wird demonstrieren, wie wir die Probenverarbeitung mit Hilfe der bildgebenden Durchflusszytometrie durchführen.Schließlich wird David Liu, Labortechniker bei Plaxgen, die Datenanalyse für Cholesterinpartikel-Bilder demonstrieren. Verwenden Sie einen chemischen Analysator-1, um den Plaque-Array-Assay für die Bildung von Cholesterinpartikeln einzurichten. Halten Sie das endgültige Reaktionsvolumen während des gesamten Assays in jeder Vertiefung bei 200 Mikrolitern und führen Sie alle Assays in dreifacher Ausführung durch.Laden Sie zunächst 194 Komma fünf Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PDS) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und geringer Proteinbindung. Geben Sie in jede Vertiefung zwei Komma fünf Mikroliter jeder lipidsenkenden Arzneimittellösung, kein Arzneimittel wird den negativen Kontrollproben zugesetzt. Schütteln Sie dann die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf die Reaktionsplatte des Chemieanalysators-1 legen, um das Arzneimittel gleichmäßig in die Lösung zu mischen.Geben Sie schließlich zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierte Cholesterinzuschlaglösung in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie wie zuvor auf die Reaktionsplatte des Chemieanalysators-1 legen. Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang auf einem Laborschüttler, der auf 37 Grad Celsius und 200 U/min eingestellt ist.Nach der Inkubation erfassen Sie die Bilder der Partikel durch bildgebende Durchflusszytometrie. Öffnen Sie die Datenerfassungsvorlage, um die richtigen Geräteeinstellungen zu laden. Klicken Sie auf Datei, wählen Sie dann Vorlage laden und wählen Sie die Vorlagendatei aus.Klicken Sie auf Laden, um das Gerät für das Laden der Probe vorzubereiten. Wenn das Dialogfeld Probe laden geöffnet wird, klicken Sie auf OK, um 50 Mikroliter der Proben in das bildgebende Durchflusszytometer zu laden. Warten Sie, bis die Partikel in Echtzeit im Bildgebungsbereich zu sehen sind.Wenn die Partikel im Bildgebungsbereich gut fokussiert sind, klicken Sie auf "Erfassen", um Bilder jedes Objekts gleichzeitig mit hohem Durchsatz für Dunkelfeld-, Hellfeld-, Grün- und Gelbfluoreszenz aufzunehmen. Klicken Sie am Ende der Erfassung auf die Schaltfläche "Zurück", um das Muster zurückzugeben. Wiederholen Sie diese Schritte, um 5.000 bis 10.000 Partikel aus jeder Probe zu erfassen.Analysieren Sie alle Rohbilddateien mit der Bildanalysesoftware zur Bestimmung der Objektfluoreszenzintensität und morphologischer Variationen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit rundem Boden für eine geringe Proteinbindung vor, indem Sie die Reagenzien schrittweise mit einem endgültigen Reaktionsvolumen von 200 Mikrolitern pro Well laden. Bereiten Sie zunächst die Kontrollvertiefungen vor.Laden Sie 193 Mikroliter PBS in jede Vertiefung. Fügen Sie 2,5 % des Patientenserums hinzu und laden Sie nur eine Serumprobe pro Well. Schütteln Sie dann die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf die Reaktionsplatte des chemischen Analysators legen.Geben Sie als Nächstes zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierte Cholesterin-Aggregatlösung in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte erneut 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf die Reaktionsplatte des Chemieanalysators-1 legen. Um die Vertiefungen mit Medikamenten vorzubereiten, laden Sie 191 Mikroliter PBS in jede Vertiefung.Fügen Sie dann 2,5 % jedes Patientenserums pro Vertiefung hinzu und schütteln Sie die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf eine Reaktionsplatte mit chemischem Analysegerät-1 legen. Geben Sie zwei Mikroliter Ezetimib, Lovastatin, Simvastatin oder Niacinlösung in alle Vertiefungen mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen. Zugabe von nur einem Medikament pro Vertiefung.Schütteln Sie die Platte wie zuvor 30 Sekunden lang. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierte Cholesterinzuschlaglösung in jede Vertiefung, bevor Sie die Platte 30 Sekunden lang schütteln. Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang in einem Laborschüttler, der auf 37 Grad Celsius und 200 U/min eingestellt ist.Nach der Inkubation werden die Proben durch bildgebende Durchflusszytometrie mit den gleichen Einstellungen wie zuvor entnommen. Verwenden Sie die Bildanalysesoftware für die Stapelverarbeitung aller Bilddateien, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier sind repräsentative Ergebnisse gezeigt, die die Identifizierung von globulären und linearstrangförmigen Cholesterinpartikeln zeigen, die durch Statine induziert werden, durch einen nicht-enzymatischen Mechanismus.Es wird die Bestätigung von zwei unterschiedlichen Morphologien der Bildung von Cholesterinpartikeln gezeigt, die durch andere lipidsenkende Medikamente induziert werden. Einschließlich Ezetimib, Niacin, Fibrat und Omega-3-Fettsäure. Hier sind Punktdiagramme dargestellt, bei denen die X-Achse ein Spektrum von Cholesterinpartikeln anzeigt, die im grünen Fluoreszenzkanal nachgewiesen wurden.Und die Y-Achse zeigt die Seitenstreuung, das Gating zeigt Regionen mit Lipoproteinen mit sehr niedriger Dichte, Lipoproteinen niedriger Dichte und Lipoproteinpartikeln hoher Dichte, die in den Fluoreszenzpunktdiagrammen nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse zeigen, wie die lipidsenkende Wirkung die Profile von gereinigten VLDL- und LDL-Cholesterinpartikeln verändert, wenn kein Medikament, Ezemid, Lovastatin, Simvastatin und Niacin vorhanden sind. Hier ist ein Screen von drei verschiedenen Serumproben zu sehen, um eine differentielle Wirkung verschiedener lipidsenkender Medikamente zu identifizieren, die Profile der VLDL-, LDL- und HDL-Cholesterinpartikelbildung modulieren.Diese Profile deuten auch darauf hin, dass es eine Variation in den Ansprechmengen zwischen den drei verschiedenen Serumproben gibt. Das Screening der ersten Serumprobe auf globuläre und linear geformte Cholesterinpartikel, die ohne das Arzneimittel und in Gegenwart verschiedener lipidsenkender Arzneimittel gebildet wurden, bestätigt zwei unterschiedliche Morphologien von aus dem Serum abgeleiteten Cholesterinpartikeln, die sowohl globuläre als auch lineare Strangformen aufweisen. Daher haben wir erfolgreich einen in-vitro-Bildgebungsansatz zur Identifizierung der lipidsenkenden Wirkung von Medikamenten demonstriert, der die Beziehung zur Bildung von Cholesterinpartikeln und deren klinische Bedeutung moduliert.Unsere vorläufigen Ergebnisse sind vielversprechend, und wir sind dabei, diesen Plaque-Array-Assay mit großen klinischen Proben weiter zu validieren. Ihr Standard-Lipid-Panel misst den LDL- und HDL-Cholesterinspiegel im Serum. Unser Plaque-Array-Assay hofft, die Genauigkeit des Atheroskleroserisikos zu verbessern und sagt das lipidsenkende Ansprechen des Medikaments mit Serum voraus.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.

Cholesterin Efflux-Assay

Mehr als die Hälfte der Proteine ​​sind kleine Proteine ​​(Molekularmasse &lt;200 kDa), die herausfordernd sind sowohl für Elektronenmikroskop Bildgebung und dreidimensionale Rekonstruktionen. Optimierte negative Färbung ist eine robuste und Hochdurchsatz-Protokoll, um einen hohen Kontrast und eine relativ hohe Auflösung (~ 1 nm) Bilder von kleinen asymmetrische Proteine ​​oder Komplexe unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu erhalten.

Optimierte negative Färbung: ein Hochdurchsatz-Protokoll für die Prüfung kleiner und asymmetrische Proteinstruktur durch Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Ansatz zur Messung von LDL-Cholesterin-Aufnahme mit Real-Time Zustrom Raten mit einem live Cell imaging-System in verschiedenen Zelltypen. Diese Technik bietet eine Plattform die pharmakologische Aktivität von Verbindungen beeinflussen LDL Zustrom während der Überwachung für Zellmorphologie und damit potenzielle Zytotoxizität auf dem Bildschirm.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Zwei Methoden der Cholesterinanreicherung werden vorgestellt: die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, um Säugetiergewebe und -zellen anzureichern, und die Verwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Diese Methoden sind entscheidend für die Bestimmung der Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in molekularen, zellulären, und Organfunktion.

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Mehrere Methoden wurden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen verwendet; Ultrazentrifugation ist jedoch nach wie vor eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Hier beschreiben wir eine Methode, wie Lipoproteine aus Plasma mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation isoliert werden und wie die Apolipoproteine sowohl für diagnostische als auch für Forschungszwecke analysiert werden können.

Isolierung und Analyse von Plasmalipoproteinen durch Ultrazentrifugation

Darin beschreiben wir die Protokolle zur Messung der Menge an fluoreszierendem Phospholipid, die spezifisch aus Lipidspenderpartikeln durch High-Density-Lipoprotein (HDL) entfernt wird, das im gesamten menschlichen Plasma oder Serum vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass diese Metrik der HDL-Funktionalität das Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagt.

High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux-Assay

Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Das Ziel dieses Protokolls ist die Spezifität von Antikrebs - Arzneimittel in vitro zu beurteilen , Mischkulturen unter Verwendung von sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält.

Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente<em&gt; In Vitro</em

Kaninchen werden häufig verwendet, um die Pharmakokinetik von intraokularen Arzneimitteln zu untersuchen. Wir beschreiben ein Verfahren zur Durchführung pharmakokinetischer Studien von intraokularen Arzneimitteln mit Kaninchenaugen.

Die Verwendung von Kaninchenaugen in pharmakokinetischen Studien von intraokulare Drugs

Erfahren Sie, wie lipidsenkende Medikamente die Morphologie von Cholesterinpartikeln modulieren. Diese Studie nutzt die Plaque-Array-Methode mit Imaging-Flow-Zytometrie, um Biomarker für die Atherosklerose-Diagnostik zu identifizieren.

Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

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