Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die Wirkung von lipidsenkenden Arzneimitteln bei der Modulation morphologischer Merkmale von Cholesterinpartikeln mit Hilfe einer Plaque-Array-Methode zu bewerten und potenzielle Biomarker für die Diagnose von Atherosklerose und die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen zu identifizieren. Die Rolle von lipidsenkenden Arzneimitteln bei der Modulation der Bildung von Cholesterinpartikeln ist nur unzureichend verstanden. Hier zeigen wir, dass lipidsenkende Medikamente eine direkte Rolle bei der Veränderung von Profilen und morphologischen Merkmalen der Bildung von Cholesterinpartikeln spielen.

Der Hauptvorteil des auf Plaque-Arrays basierenden In-vitro-Bildgebungsverfahrens gegenüber anderen Partikelnachweismethoden besteht darin, dass es die Visualisierung von Cholesterinpartikeln zur Bewertung der Wirkung von lipidsenkenden Arzneimitteln im Serum ermöglicht. Jason Lundry, Labortechniker bei Plaxgen, wird demonstrieren, wie wir den Plaque-Array-Assay mit einem chemischen Analysator einrichten. Raymond Kong, leitender Wissenschaftler bei Millipore Sigma, wird demonstrieren, wie wir die Probenverarbeitung mit Hilfe der bildgebenden Durchflusszytometrie durchführen.

Schließlich wird David Liu, Labortechniker bei Plaxgen, die Datenanalyse für Cholesterinpartikel-Bilder demonstrieren. Verwenden Sie einen chemischen Analysator-1, um den Plaque-Array-Assay für die Bildung von Cholesterinpartikeln einzurichten. Halten Sie das endgültige Reaktionsvolumen während des gesamten Assays in jeder Vertiefung bei 200 Mikrolitern und führen Sie alle Assays in dreifacher Ausführung durch.

Laden Sie zunächst 194 Komma fünf Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PDS) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und geringer Proteinbindung. Geben Sie in jede Vertiefung zwei Komma fünf Mikroliter jeder lipidsenkenden Arzneimittellösung, kein Arzneimittel wird den negativen Kontrollproben zugesetzt. Schütteln Sie dann die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf die Reaktionsplatte des Chemieanalysators-1 legen, um das Arzneimittel gleichmäßig in die Lösung zu mischen.

Geben Sie schließlich zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierte Cholesterinzuschlaglösung in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie wie zuvor auf die Reaktionsplatte des Chemieanalysators-1 legen. Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang auf einem Laborschüttler, der auf 37 Grad Celsius und 200 U/min eingestellt ist.

Nach der Inkubation erfassen Sie die Bilder der Partikel durch bildgebende Durchflusszytometrie. Öffnen Sie die Datenerfassungsvorlage, um die richtigen Geräteeinstellungen zu laden. Klicken Sie auf Datei, wählen Sie dann Vorlage laden und wählen Sie die Vorlagendatei aus.

Klicken Sie auf Laden, um das Gerät für das Laden der Probe vorzubereiten. Wenn das Dialogfeld Probe laden geöffnet wird, klicken Sie auf OK, um 50 Mikroliter der Proben in das bildgebende Durchflusszytometer zu laden. Warten Sie, bis die Partikel in Echtzeit im Bildgebungsbereich zu sehen sind.

Wenn die Partikel im Bildgebungsbereich gut fokussiert sind, klicken Sie auf "Erfassen", um Bilder jedes Objekts gleichzeitig mit hohem Durchsatz für Dunkelfeld-, Hellfeld-, Grün- und Gelbfluoreszenz aufzunehmen. Klicken Sie am Ende der Erfassung auf die Schaltfläche "Zurück", um das Muster zurückzugeben. Wiederholen Sie diese Schritte, um 5.000 bis 10.000 Partikel aus jeder Probe zu erfassen.

Analysieren Sie alle Rohbilddateien mit der Bildanalysesoftware zur Bestimmung der Objektfluoreszenzintensität und morphologischer Variationen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit rundem Boden für eine geringe Proteinbindung vor, indem Sie die Reagenzien schrittweise mit einem endgültigen Reaktionsvolumen von 200 Mikrolitern pro Well laden. Bereiten Sie zunächst die Kontrollvertiefungen vor.

Laden Sie 193 Mikroliter PBS in jede Vertiefung. Fügen Sie 2,5 % des Patientenserums hinzu und laden Sie nur eine Serumprobe pro Well. Schütteln Sie dann die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf die Reaktionsplatte des chemischen Analysators legen.

Geben Sie als Nächstes zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierte Cholesterin-Aggregatlösung in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte erneut 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf die Reaktionsplatte des Chemieanalysators-1 legen. Um die Vertiefungen mit Medikamenten vorzubereiten, laden Sie 191 Mikroliter PBS in jede Vertiefung

Fügen Sie dann 2,5 % jedes Patientenserums pro Vertiefung hinzu und schütteln Sie die Platte 30 Sekunden lang, indem Sie sie auf eine Reaktionsplatte mit chemischem Analysegerät-1 legen. Geben Sie zwei Mikroliter Ezetimib, Lovastatin, Simvastatin oder Niacinlösung in alle Vertiefungen mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen. Zugabe von nur einem Medikament pro Vertiefung.

Schütteln Sie die Platte wie zuvor 30 Sekunden lang. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierte Cholesterinzuschlaglösung in jede Vertiefung, bevor Sie die Platte 30 Sekunden lang schütteln. Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang in einem Laborschüttler, der auf 37 Grad Celsius und 200 U/min eingestellt ist.

Nach der Inkubation werden die Proben durch bildgebende Durchflusszytometrie mit den gleichen Einstellungen wie zuvor entnommen. Verwenden Sie die Bildanalysesoftware für die Stapelverarbeitung aller Bilddateien, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier sind repräsentative Ergebnisse gezeigt, die die Identifizierung von globulären und linearstrangförmigen Cholesterinpartikeln zeigen, die durch Statine induziert werden, durch einen nicht-enzymatischen Mechanismus.

Es wird die Bestätigung von zwei unterschiedlichen Morphologien der Bildung von Cholesterinpartikeln gezeigt, die durch andere lipidsenkende Medikamente induziert werden. Einschließlich Ezetimib, Niacin, Fibrat und Omega-3-Fettsäure. Hier sind Punktdiagramme dargestellt, bei denen die X-Achse ein Spektrum von Cholesterinpartikeln anzeigt, die im grünen Fluoreszenzkanal nachgewiesen wurden.

Und die Y-Achse zeigt die Seitenstreuung, das Gating zeigt Regionen mit Lipoproteinen mit sehr niedriger Dichte, Lipoproteinen niedriger Dichte und Lipoproteinpartikeln hoher Dichte, die in den Fluoreszenzpunktdiagrammen nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse zeigen, wie die lipidsenkende Wirkung die Profile von gereinigten VLDL- und LDL-Cholesterinpartikeln verändert, wenn kein Medikament, Ezemid, Lovastatin, Simvastatin und Niacin vorhanden sind. Hier ist ein Screen von drei verschiedenen Serumproben zu sehen, um eine differentielle Wirkung verschiedener lipidsenkender Medikamente zu identifizieren, die Profile der VLDL-, LDL- und HDL-Cholesterinpartikelbildung modulieren.

Diese Profile deuten auch darauf hin, dass es eine Variation in den Ansprechmengen zwischen den drei verschiedenen Serumproben gibt. Das Screening der ersten Serumprobe auf globuläre und linear geformte Cholesterinpartikel, die ohne das Arzneimittel und in Gegenwart verschiedener lipidsenkender Arzneimittel gebildet wurden, bestätigt zwei unterschiedliche Morphologien von aus dem Serum abgeleiteten Cholesterinpartikeln, die sowohl globuläre als auch lineare Strangformen aufweisen. Daher haben wir erfolgreich einen in-vitro-Bildgebungsansatz zur Identifizierung der lipidsenkenden Wirkung von Medikamenten demonstriert, der die Beziehung zur Bildung von Cholesterinpartikeln und deren klinische Bedeutung moduliert.

Unsere vorläufigen Ergebnisse sind vielversprechend, und wir sind dabei, diesen Plaque-Array-Assay mit großen klinischen Proben weiter zu validieren. Ihr Standard-Lipid-Panel misst den LDL- und HDL-Cholesterinspiegel im Serum. Unser Plaque-Array-Assay hofft, die Genauigkeit des Atheroskleroserisikos zu verbessern und sagt das lipidsenkende Ansprechen des Medikaments mit Serum voraus.