Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die dosisabhängige Anteilsänderung von Tumorzellen in einer Kultur zu beurteilen, die sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen enthält. Diese Methode bietet ein genetisches Werkzeug zur Beurteilung der in vitro Wirkung und Spezifität von Krebsmedikamenten. Es hat Anwendungspotenzial in der Wirkstoffforschung und in der personalisierten Krebsbehandlung.

Der große Vorteil dieser Methode besteht darin, dass, wenn ein Krebsmedikament in einer Kultur getestet wird, die sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen enthält, die Reaktion der Tumorzellen von der der Nicht-Tumorzellen getrennt werden kann. Dieses Verfahren wird von Eena, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sowohl Tumorzellen als auch Fibroblasten über Nacht in Standard-DMA-Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultivieren.

Bei Subkonfluenz werden die Zellen mit 0,05 % Trypsin entnommen und mit einem Hämozytometer gezählt. Mischen Sie anschließend 400 Tumorzellen und 1.600 Nicht-Tumorzellen in jeder Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit 0,2 ml Medium zusammen und richten Sie vier Replikate für jede Arzneimittelkonzentration ein. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Bereiten Sie dann die Stammlösungen von Nilotinib in DMSO bei 0, 2, 4 und 20 mM vor. Verdünnen Sie jeden von ihnen um das 200-fache in 5 ml DMA-Medium, um zweifach konzentrierte Arzneimittellösungen von 0, 10, 20 und 100 μM zu erhalten. Entfernen Sie anschließend 0,1 ml des Mediums aus jeder Vertiefung.

Fügen Sie 0,1 ml Medium hinzu, das das Arzneimittel enthält, und inkubieren Sie die Zellen fünf Tage lang. Am Ende der Behandlung untersuchen Sie die anhaftenden Zellen mit einem Gesichtskontrastmikroskop und machen Sie Fotos. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die überlebenden Klebezellen einmal mit 0,2 mL PBS.

Um die Zellen mit der HotSHOT-Methode zu lysieren, geben Sie 50 μl alkalische Lyselösung in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Folie. Anschließend die Platte bei 95 Grad Celsius in einem Ofen oder auf einer Heizplatte 30 Minuten inkubieren.

Überprüfen Sie nach 30 Minuten unter dem Mikroskop, ob keine intakten Zellen mehr an der Oberfläche der Vertiefungen zurückgeblieben sind. Falls die Zellen nicht vollständig lysiert haben, verlängern Sie die Aufheizzeit oder fügen Sie Reinigungsmittel hinzu. Einmal bei 20 Grad Celsius einzufrieren verbessert auch das Aufbrechen der Zellen.

Sie anschließend 50 μl der Neutralisationslösung in jede Vertiefung, übertragen Sie dann alle Lysate in die U-Form-Vertiefungen einer PCR-Platte und trocknen Sie sie in einem PCR-Cycler bei 95 Grad Celsius für 10 bis 30 Minuten. Anschließend werden die Lysate mit 20 μl destilliertem Wasser rekonstituiert. Um die DNA mittels Falldialyse zu entsalzen, unterteilen Sie einen Membranfilter mit einem Durchmesser von 25 mm in vier Bereiche und nummerieren Sie die Bereiche.

Schwimmen Sie die Filter mit der glänzenden Seite nach oben auf destilliertem Wasser in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte. Anschließend wird das 20 μl rekonstituierte Lysat vorsichtig auf den Filter aufgebracht. Decken Sie den Teller ab und dialysieren Sie ihn 30 bis 60 Minuten lang.

Saugen Sie anschließend das Wasser unter dem Filter ab, ohne den Filter umzudrehen oder die Tropfen zu stören. Übertragen Sie die Lysattropfen in die Vertiefungen einer neuen PCR-Platte. Trocknen Sie anschließend die DNA-Tropfen, indem Sie die Platte 10 bis 30 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einem PCR-Cycler erhitzen.

Dann rekonstituieren Sie die Lysate in 10 μl Wasser. Bereiten Sie als Nächstes den Mastermix vor, der alle Komponenten außer DNA für die digitale PCR-Reaktion mit der Duellsonde enthält. Wirbeln Sie die Mastermischung 10 Sekunden lang bei maximaler Kraft in der Zentrifuge herunter und geben Sie 15 μl der Mischung in jede Vertiefung einer 96-PCR-Platte ab.

Das Lysat jeder Probe wird in die Vertiefungen gegeben, die die Hauptmischung enthalten. Von jedem Reaktionsgemisch werden 20 μl in die Vertiefung auf der Probenseite einer Kartusche bei Raumtemperatur überführt. Geben Sie dann 70 μl Tröpfchengeneratoröl in jede Vertiefung auf der Ölseite einer Kartusche ab.

Verschließen Sie die Kartusche mit einer Dichtung und legen Sie die gesamte Einstellung in einen Tröpfchengenerator, bevor Sie mit der Tröpfchenerzeugung beginnen. Übertragen Sie anschließend 40 μl Tröpfchenlösung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. Verschließen Sie die Platte mit einem Folienblatt und legen Sie die Platte in einen PCR-Cycler.

Stellen Sie als Nächstes die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius und die Rampenrate auf 2 Grad Celsius pro Sekunde ein. Wenn Sie fertig sind, geben Sie die Platte in einen Tröpfchenleser und beginnen Sie mit dem Lesen. Alternativ kannst du die Platte bis zu 24 Stunden bei 4 Grad Celsius lagern.

Laden Sie nun die digitalen PCR-Daten und führen Sie eine automatische Analyse durch. Untersuchen Sie die Proben manuell, um sicherzustellen, dass die positiven und negativen Tröpfchen gut voneinander getrennt sind. Schließen Sie die Proben ohne klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen von der weiteren Analyse aus.

Kopieren Sie das resultierende Verhältnis von NF1 zu RPP30 in eine Excel-Tabelle. Berechnen Sie als Nächstes den Anteil der Tumorzellen. Berechnen Sie für jede Arzneimittelkonzentration den Mittelwert und die Standardabweichung aus den vier Replikaten und stellen Sie dann die Mittelwerte und die Standardabweichungen gegen die Arzneimittelkonzentrationen dar.

Hier ist die dosisabhängige Reduktion der sichtbaren vitalen Zellen dargestellt. Der Anteil der Tumorzellen, berechnet aus dem Verhältnis von NF1 zu RPP30, nahm im Bereich von 0 bis 10 μM ab. Bei der höchsten Dosis von 50 μM blieben nur noch wenige vitale Zellen übrig, was wahrscheinlich auf eine toxische Wirkung auf alle Zellen zurückzuführen ist.

Die Lebensfähigkeit und Proliferation der Gesamtzellen kann mit herkömmlichen Assays gemessen werden, der Anteil der Tumorzellen kann jedoch mit dem in der vorliegenden Studie gezeigten Verfahren bestimmt werden. Anhand der beiden Parameter kann die Gesamtzellantwort auf ein Medikament in einer Mischkultur in die Tumorzellantwort und die Nicht-Tumorzellantwort unterteilt werden. Das gesamte Testverfahren kann in einer Woche durchgeführt werden, einschließlich der Behandlungsdauer von fünf Tagen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Verhältnis zwischen dem Zielgen und dem Umkehrgen variiert. Wir sehen einen sehr engen Bereich, der zwischen 0 und 1 liegt, und daher ist Präzision unerlässlich. Die Auswertung unter den Proben und in der Handhabung sollte so weit wie möglich reduziert werden.

Nach diesem Verfahren können auch Primärkulturen, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen enthalten, verwendet werden, um die Wirkung und Spezifität von Krebsmedikamenten zu testen. Darüber hinaus kann die Wirkung eines Medikaments auf bestimmte Subpopulationen von Zellen mit definierter genetischer Veränderung spezifisch beurteilt werden. Ich hoffe, dass dieses Video Ihnen hilft zu verstehen, wie Sie genetische Merkmale verwenden können, um den Anteil von Tumorzellen in einer Probe oder in einer Kultur zu bestimmen, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen enthält.