Name: Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Spezifität von Antikrebsmedikamenten in vitro mit gemischten Tumor- und Nicht-Tumor-Zellkulturen bewerten. Diese Methode nutzt digitale PCR zur präzisen Analyse und unterstützt die Arzneimittelforschung.

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Frau Alster, Herr Honrath und Dr. Jiang sind bekannt für ihre hervorragende technische Unterstützung geschätzt. geschätzt Auch Dr. Volz und die Forschungsgruppe von Dr. Dandri für die Bereitstellung der Zugriff auf ihre digitalen PCR-Gerät ist.

1. Vorbereitung Mix Kultur, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen <ol><li> Verwenden von Tumorzellen aus einer etablierten Zelllinie MPNST S462 5. Verwenden Fibroblasten als die Nicht-Tumorzellen 6,7 </li><li> Kultur sowohl Tumorzellen und Fibroblasten in Standard-DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (BSA), 3 mM Glutamin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 500 U / ml Penicillin, 500 g / ml Streptomycin und 1 mM Natriumpyruvat bei 37 ° C und 5% CO 05-7 Februar. Bei Subkonfluenz, ernten die Zellen mit 0,05% Trypsin und zähle sie eine Zählkammer. </li><li> Mischungs 400 Tumorzellen und 1600 Nicht-Tumorzellen zusammen in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte in 0,2 ml Medium. Berücksichtigung schnelleres Wachstum von Tumorzellen über den Behandlungszeitraum von 5 Tagen wurde der anfängliche Anteil der Tumorzellen auf 25% eingestellt. Richten Sie 4 Wiederholungen für jede Wirkstoffkonzentration. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug Behandlung <ol><li> Verwenden Sie Nilotinib als Test Droge. Stocklösungen von 0, 2, 4 und 20 mM Nilotinib in DMSO. Verdünnte jeder von ihnen um 200-fach in 5 ml DMEM - Medium, so dass 2-fach konzentriertem arzneimittel Lösungen von 0, 10, 20 und 100 &amp; mgr; M 6.7. </li><li> Entfernen Sie 0,1 ml Medium aus jeder Vertiefung und 0,1 ml Medium, das Medikament. Die Endkonzentrationen sind 0, 5, 10 und 50 uM. Weiter, um die Zellen in Medium, das Medikament für 5 Tage inkubiert. </li><li> Am Ende der Behandlung, überprüfen Sie die anhaftenden Zellen ein Phasenkontrastmikroskop und Fotos zu machen. Saugen Sie das Medium entfernt, waschen Sie einmal die überlebt Klebstoff Zellen mit 0,2 ml PBS. </li></ol> 3. Vorbereitung DNA für digitale PCR <ol><li> Lyse Zellen HotShot mit 8. <ol><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l alkalische Lyse-Lösung (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Folie. Inkubieren der Platte bei 95 ° C in einem Ofen oder auf einer Heizplatte für 30 min. Überprüfen Sie unter einer micrOscope, um sicherzustellen, dass nicht mehr intakte Zellen an der Oberfläche der Vertiefungen blieb. Bei lysieren die Zellen, erhöhen nicht vollständig die Heizzeit oder Reinigungsmittel hinzufügen. Frieren sie einmal bei -20 ° C auch verbessert das Brechen Zellen. </li><li> In 50 ul Neutralisierungslösung (40 mM Tris-HC, pH 4,0) in jede Vertiefung. Übertragen alle Lysate in U-Form Vertiefungen einer PCR-Platte und trocken in einer PCR-Cycler bei 95 ° C für 10 bis 30 min. Rekonstitution der Lysate mit 20 &amp; mgr; l destilliertes Wasser. </li></ol></li><li> Entsalzen mit Tropfen-Dialyse 9 <ol><li> verwenden Membranfilter mit einer mittleren Porengröße von 0,025 &amp; mgr; m. </li><li> Schwimmer den Filter auf destilliertem Wasser mit glänzenden Seite nach oben in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Befeuchten Sie die Filter für 5 min. Achten Sie Luftblasen zwischen dem Filter und Wasser zu vermeiden. </li><li> Pipettieren die rekonstituierten Lysaten von jeder Probe aus Schritt 3.1.4 vorsichtig auf auf jeder der vier Bereiche des Filters. Decken Sie die Platte und dialysiere für 30 bis 60 min. </li><li> Saugen Sie das Wasser unter dem Filter entfernt, ohne den Filter Umklappen noch die Tropfen zu stören. </li><li> Transfer des Lysats Tropfen in die Vertiefungen einer neuen PCR-Platte. Trockne die DNA-Tropfen durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 bis 30 min in einer PCR-Cycler. Rekonstitution der Lysate in 10 &amp; mgr; l Wasser. </li></ol></li></ol> 4. Digitale PCR <ol><li> Auftau-frozen Komponenten wie DNA, Puffer und der Testansatz bei RT spin bei Maximalkraft von jeder verfügbaren Zentrifuge für 10 sec nach unten (beispielsweise VWR Minizentrifuge) und dann auf Eis halten. </li><li> Vorbereitung Master Mischung enthaltend alle Komponenten außer DNA (Tabelle 1). Betrachten Sie Totvolumen und berechnen Master Mischung ca. 10% mehr als die erforderliche Menge. HINWEIS: Verwenden Sie die Primer und im Handel erhältlichen Kits verwendeten Sonden. </li><li> Vortex die Master-Mischung, Spin-down für 10 Sekunden bei maximaler Kraft von jeder verfügbaren Zentrifuge (zB VWR Mini-Zentrifuge) und 15 &amp; mgr; l zu jeder verzichtenVertiefung einer Platte mit 96-PCR. Fügen Sie alle Lysat von jeder Probe (die DNA enthält) in die Vertiefungen der Master-Gemisch enthält. Transfer 20 ul jeder Reaktionsmischung in eine gut auf der Probenseite einer Kartusche bei RT. </li><li> Dispense 70 ul Tröpfchengenerator Öl in jede Vertiefung auf der Ölseite einer Kartusche. Schließen Sie die Kassette mit der Dichtung und legen Sie die gesamte Einstellung in einen Tröpfchengenerator. Starten Sie Tropfenerzeugung. </li><li> Transfer 40 ul Tröpfchen-Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte. Verschließen Sie die Platte mit einer Folie und legen Sie die Platte in eine PCR-Cycler. Stellen Sie den Deckel-Temperatur bei 105 ° C und Rampenrate bei 2 ° C / s. Führen Sie die PCR mit den Einstellungen in der Tabelle 2. Nach der PCR, übertragen Sie die Platte in einen Tröpfchen Leser und dem Lesen beginnen. Alternativ speichern Sie die Platte bei 4 ° C bis zu 24 Stunden. </li></ol> 5. Berechnen Anteil der Tumorzellen <ol><li> Laden Sie die digitalen Daten PCR und führen Sie die automatische analysist. </li><li> Steuern die Ergebnisse jedes Test manuell durch die eindimensionale und 2-dimensionale Verteilung der positiven und negativen Tröpfchen Inspizieren und sicherzustellen, dass sie gut getrennt sind und die Schwellenlinien wurden in den richtigen Positionen. Ausschließen Ergebnisse nicht die Kriterien erfüllen, zum Beispiel keine klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen, von der weiteren Analyse. Kopieren Sie die resultierende Verhältnis NF1 / RPP30 in ein Excel - Blatt. </li><li> Berechnen des Anteils der Tumorzellen , wie: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> 6. Dosisabhängige Änderung der Anteil der Tumorzellen <ol><li> Für jedes Arzneimittel-Konzentration, die mittlere und Standardabweichung von den vier Replikaten berechnen. Zeichnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen gegen den Drogenkonzentrationen. </li></ol>

<ol><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li>
<li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li>
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<li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome%3A+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li>
</ol>

Das Verfahren ist patentgeschützt (10 2013 221 452, Deutschland)

Der Schlüsselschritt in dieser Gen- und zellbasierte Werkzeug für die Beurteilung der Arzneimittelspezifität in vitro ist die Bestimmung des Anteils der Tumorzellen mit einem oder mehreren Tumor-spezifischen genetischen Merkmale. Im Gegensatz zu herkömmlichen phänotypischen Merkmale 7, sind genetische Merkmale spezifische, stabil und einfach zu quantifizieren. Zum Beispiel ist eine tumorspezifische Mutation oder Veränderung der Kopienzahl vorhanden ausschließlich in die Tumorzellen, jedoch nicht in Nicht-Tumorzellen. Eine solche genetische Stigma zuverlässig werden kann und genau quantifiziert werden, beispielsweise digitale PCR unter Verwendung der in dieser Studie nachgewiesen. Für die digitale PCR ist eine hohe Reinheit der DNA nicht wesentlich. Jedoch sind Entsalzen und Entfernen inhibitorische Moleküle notwendig, die durch einen Tropfendialyse erreicht werden kann, einen geeigneten Filter. Die kombinierte Lyse und Drop-Dialyse ist einfach und schnell, erfordert keine speziellen Instrumente und daher in jedem Standard-Labor durchgeführt werden kann. Wenn die Zellen nicht Break gut, kann eine zusätzliche Behandlung in Betracht gezogen werden, wie die Zellen bei -20 ° C einfrieren, Zugabe von Reinigungsmittel oder / und unter Verwendung von Protease. In der vorliegenden Studie wurde die heterozygote Deletion des NF1 - Gen als das tumorspezifische Merkmal für die Quantifizierung verwendet. In ähnlicher Weise kann auch verwendet werden, Deletionen anderer Gene oder Loci. Weiterhin Mutationen können auch zur Quantifizierung von Tumorzellen verwendet werden. In einem solchen Fall digital PCR-Assays für die mutierten und die normalen Allele müssen umfassend validiert werden, um ihre Spezifität für jeden von ihnen zu gewährleisten. Dosisabhängige Anteil der Tumorzellen liefert eine Anzeige für arzneimittel Spezifität oder Selektivität. Darüber hinaus ermöglicht es auch von Tumorzellen aus der Reaktion der gesamten Zellen einer gemischten Kultur mit einem Medikament (4) Extrahieren Antwort. Diese Extraktion Strategie stellt eine Lösung für das technische Problem bei der Verwendung Primärkulturen (die sowohl Tumor enthält und keinn-Tumorzellen) für Drogentests. Die Gen- und zellbasierten in vitro - Tool in der vorliegenden Studie gezeigt , daher Anwendungspotenzial aufweisen (1) in der Arzneimittelentdeckung , wo es eine Plattform für die Beurteilung der Arzneimittel Spezifität oder Selektivität in vitro und (2) in der personalisierten Krebsbehandlung bietet , wo es ermöglicht die Prüfung Drogen in Primärkulturen und damit zu arzneimittel Auswahl in der adjuvanten Chemotherapie 4 beitragen können. Darüber hinaus können pharmakologische Mechanismus eines Medikaments untersucht werden dieses Werkzeug verwenden, da bestimmte genetische Veränderung oder mehrere genetische Veränderungen können während der Arzneimittelbehandlung folgen. Eine Schwierigkeit in individualisierter Primärkulturen ist das Fehlen einer universellen genetischen Merkmal für die Quantifizierung der Tumorzellen. Jedoch mit vorab in der heutigen Gesamtgenom-Sequenzierung, die am häufigsten veränderten Gene und Regionen sind für die gemeinsame Tumoren bekannt. Zum Beispiel unter Kopf und HalsTumoren, 71%, 23% und 22% haben Mutationen im TP53, FAT1 und CDKN2A gene, und 60%, 34% und 26% weisen Deletionen in den Genregionen von CDKN2A, STK11 und PTEN bzw. 10. Screenen von 5 bis 10 solcher Gene oder / und Regionen durch gezielte-Sequenzierung oder / und digitale PCR identifiziert daher wahrscheinlich eine oder mehrere genetische Veränderungen, die zur Quantifizierung von Tumorzellen in der abgeleiteten Primärkultur verwendet werden können. Eine weitere Einschränkung ist die oft unzureichende Menge an reseziert Tumoren für Primärkulturen aufzubauen. Trotz der vorteilhaften Merkmale und viel versprechende Anwendungsmöglichkeiten der Gen- und zellbasierten in vitro - Tool sollte seine Grenzen gehalten werden , in Geist und seine in - vitro - Natur hervorzuheben. Zum Beispiel können die unterschiedlichen Effekte oder Zytotoxizität eines Arzneimittels auf Tumorzellen kann nicht aufgrund des Unterschieds in Zelltypen (Fibroblasten vs. Schwann-Zellen) oder ihreunterschiedlicher Herkunft (von verschiedenen Individuen). Die stärkere Wirkung eines Arzneimittels auf Tumorzellen als auf Nicht-Tumorzellen können auch durch die Tatsache erklärt werden, daß die erstere schneller wachsen als die letzteren. Am wichtigsten ist , Zellen in vitro Verhalten unterscheidet , als Zellen im menschlichen Körper und folglich Ergebnisse der in vitro Beurteilung oft nicht oder nur teilweise den realen klinischen Situation widerzuspiegeln. Daher Wirksamkeit, Zytotoxizität und Spezifität von Medikamenten für kultivierte Zellen erhalten werden, sind eher von biomarker Natur, aber nicht über die Zuverlässigkeit der gemessenen vorklinisch Wirksamkeit von Antibiotika. Dennoch ist Bewegen von Zelllinien zu Mischkulturen und / oder Primärkulturen ein Fortschritt arzneimittel Wirkung und Spezifität / Selektivität in vitro in der Beurteilung. Mit umfangreichen Bemühungen, in vitro Bedingungen können gefunden werden , die eine angemessene Korrelation von in vitro - Daten mit realen Reaktionen von Patienten, zumindest für einige Medikamente ermöglicht.

Therapeutische Wirkungen von Krebsmedikamenten auf Tumorzellen sind mit verschiedenen unerwünschten toxischen Wirkungen auf Nicht-Tumorzellen verbunden. Toxische Wirkungen sind im Labor schwer zu beurteilen, was vor allem auf den Mangel an geeigneten Instrumentenzurückzuführen ist 1. Zellkulturen, die sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen enthalten, würden eine potenzielle In-vitro-Ressource zur Beurteilung der Spezifität oder Selektivität eines Arzneimittels darstellen, was Aufschluss über die klinische Toxizität geben könnte. Herkömmliche in vitro Assays, wie z.B. Proliferations- oder Viabilitätsassays, messen jedoch die Wirkung eines Medikaments auf die Gesamtzelle, können die Wirkung jedoch nicht in den Teil auf Tumorzellen und den Teil auf Nicht-Tumorzellen unterteilen. Zum Beispiel kann eine 50%ige Verringerung der Gesamtzellzahl in einer Kultur, die aus 50% Tumorzellen und 50% Nicht-Tumorzellen besteht, den Tod aller Tumorzellen, den Tod aller Nicht-Tumorzellen oder, was wahrscheinlicher ist, den Tod von Teilen von beiden in verschiedenen Verhältnissen bedeuten. 
Auch wegen dieses technischen Problems sind Primärkulturen, die Tumor- und Nicht-Tumor-Stromazellen enthalten, häufig ungeeignet, um Medikamente zu testen. Auf der anderen Seite ähneln Primärkulturen aufgrund dieser zellulären Heterogenität ihren ursprünglichen Tumoren weitaus besser als klonale Zellen in etablierten Zelllinien2. Noch wichtiger ist, dass Primärkulturen patientenspezifisch sind und individualisierte Arzneimitteltests ermöglichenkönnen 2-4.
Ein wesentliches Thema ist daher die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung des Anteils von Tumorzellen in Mischkulturen einschließlich Primärkulturen. Um diese Herausforderung zu lösen, wurde eine genetische Lösung entwickelt, die auf der Bestimmung des quantitativen Verhältnisses eines tumorspezifischen genetischen Merkmals zu einer universellen Referenzsequenz basiert. Aus diesem Verhältnis kann der Anteil der Tumorzellen in einer Mischkultur berechnet werden. 
Diese Studie veranschaulicht das Verfahren des genetischen und zellbasierten Werkzeugs zur Beurteilung der Spezifität von Krebsmedikamenten, einschließlich (1) der Herstellung einer Mischkultur aus Tumorzellen einer etablierten Linie und Nicht-Tumor-Fibroblasten, (2) der Behandlung der Mischkultur mit einem Testmedikament, (3) der Vorbereitung der DNA für die digitale PCR, (4) der Bestimmung des Verhältnisses einer tumorspezifischen heterozygoten Deletion zu einer Referenzsequenz unter Verwendung eines digitalen Tröpfchen-PCR-Assays mit zwei Sonden, (5) Berechnung der Anteile der Tumorzellen bei jeder Wirkstoffkonzentration und (6) Erstellung der dosisabhängigen Änderung des Anteils der Tumorzellen.

<table><tbody><tr><td>Membranfilter mit 25 mm Durchmesser</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>Für die Tropfdialyse</td></tr><tr><td>ddPCR-Assay für NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td><td>FAM-markierter</td></tr><tr><td>ddPCR-Assay für RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td>HEX-markierter</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>In der Studie wurde die Vorgängerversion QX verwendet, die nicht mehr verfügbar ist. Der Ersatz ist QX200</td></tr><tr><td>Tröpfchenöl</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Dichtungen</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Cartrige Halter</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Durchstechfolie</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

die beurteilung spezifität von anti-krebs-medikamente<em&gt; in vitro</em

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Ein Verfahren für die Spezifität der Antikrebs - Arzneimittel in vitro Beurteilung unter Verwendung von Kulturen sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält , nachgewiesen wird . Das Schlüsselelement ist die quantitative Bestimmung eines tumorspezifische genetische Veränderung in Bezug auf eine universelle Sequenz, die ein Dual-Sonde digitalen PCR-Assay und die nachfolgende Berechnung des Anteils der Tumorzellen verwendet wird. Der Test wird auf einem Kulturzellen einer etablierten Linie enthaltenden Tumors durchgeführt und versetzt in Nicht-Tumorzellen. Die Mischkultur wird in verschiedenen Konzentrationen mit einem Testwirkstoff behandelt. Nach der Behandlung wird die DNA auf eine Dual-Sonde digitalen PCR Assay direkt von den überlebt Klebstoff Zellen in Wells von 96-Well-Platten eine einfache und kostengünstige Methode und unterzogen unter Verwendung eines tumorspezifische genetische Veränderung und eine Referenz universelle Sequenz zur Messung . In der vorliegenden Demonstration, eine heterozygote Deletion des NF1 - Gens wird als tumorspezifische genetische Veränderung verwendet , undein RPP30 Gen als Referenz - Gen. Verwendung des Verhältnisses NF1 / RPP30 wurde der Anteil der Tumorzellen berechnet. Da die dosisabhängige Veränderung des Anteils der Tumorzellen für die Spezifität des Medikaments eine in vitro Anzeige liefert, diese genetische und zellbasierten in vitro - Assay wird wahrscheinlich Anwendungspotential in der Wirkstoffforschung. Darüber hinaus für die personalisierte Krebsfürsorge, diese Gen- und Zell-basiertes Tool kann zur Optimierung der adjuvanten Chemotherapie durch Prüfung der Wirksamkeit und Spezifität von Wirkstoffkandidaten mit Primärkulturen von einzelnen Tumoren beitragen.

Die Qualität der hergestellten DNA die kombinierte HotShot / Tropfen-Dialyse ausreichend ist für eine zufriedenstellende digitale PCR (Abbildung 1B) verwendet wird . Für 2000 Fibroblasten, etwa 3000 ± 500 positive Tröpfchen erhalten, was 75% der erwarteten 4.000 Kopien entspricht (zwei Kopien in einer Zelle). In dieser Studie wurden die Tumorzellen aus einer etablierten Linie MPNST S462 die eine heterozygote Deletion des NF1 - Gens 5 haben , sind bekannt. Diese 50% Gendosis Reduktion wurde durch das Dual - Digital - PCR - Assay (1B) eindeutig erkannt. Im Gegensatz dazu zwei Kopien dieses Gens wurden in Fibroblasten gemessen. Diese genetische Unterschied zwischen Tumor- und Nicht-Tumorzellen ermöglicht die Berechnung des Anteils der Tumorzellen in gemischten Kulturen (Figur 2). Durch Messung der relativen Gendosis von NF1 bis RPP30, Anteil von Tumorzellen in einer Mischkultur bestimmt werdenbei jeder Arzneimittelkonzentration (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Abbildung 1. Digital PCR. (A) Darstellung des Prinzips. (B) ein Dual-Sondentest zeigt reduzierte Menge eines Ziels (NF1) Gen in den Tumorzellen MPNST S462 in Bezug auf einen Referenz (RPP30) -Gen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Abbildung 2. Berechnete Anteil der Tumorzellen. Die Tumorzellen und Nicht-Tumorzellen wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und entkernt in jede Vertiefung einer 96-Platte. Nach der Befestigung O / N wurden die Zellen lysiert with HotShot / Tropfendialyse entsalzt und die Lysate wurden in digitale PCR unterzogen , die das Verhältnis von NF1 / RPP30 gab. Basis dieses Verhältnisses Anteil von Tumorzellen in jeder Vertiefung wurde berechnet. Mittelwert und Standardabweichung der Anteil der Tumorzellen wurden berechnet aus 4 bei jedem Set-up Anteil repliziert. Die berechneten Anteile von Tumorzellen (Y-Achse) gegen die Set-up Proportionen aufgetragen wurden (X-Achse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Abbildung 3. dosisabhängige Veränderung der Anteil der Tumorzellen. (A) eine dosisabhängige Verringerung der sichtbaren vitalen Zellen. (B) Anteil der Tumorzellen (Mittelwert und Standardabweichung von 4 Replikaten) aus der berechneten<html> Verhältnis von NF1: RPP30 verringerte sich im Bereich von 0 - 10 &amp; mgr; M. Bei der höchsten Dosis 50 &amp; mgr; M, wenige vitale Zellen gelassen wurden, wahrscheinlich durch toxische Wirkung auf alle Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Abbildung 4. Vereinzeler Reaktion von Tumorzellen von der Nicht-Tumorzellen (A) Lebensfähigkeit oder / und die Proliferation von Zellen insgesamt kann unter Verwendung herkömmlicher Tests gemessen werden; Anteil der Tumorzellen kann unter Verwendung des Verfahrens in der vorliegenden Studie gezeigt werden, bestimmt. (B) über die beiden Parameter, Reaktion der gesamten Zellen in einer Mischkultur auf ein Medikament kann in Reaktion der Tumorzellen und der Reaktion des nicht-Tumorzellen unterteilt werden..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Umsetzung </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Assay-Mix für NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Assay-Mix für RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0,6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Zwischensumme </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> Stammischung </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Gesamt </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Endgültige PCR-Gemisch </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Einrichten von Dual - ddPCR Reaktion <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Aktion </td><td> Temperatur </td><td> Zeit </td><td> Fahrräder </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymlöschen Aktivierung </td><td> 95 ° C </td><td> 10 Minuten </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> DNA-Denaturierung </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sec </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Glüh- / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 Minute </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Polymerase Deaktivierung </td><td> 98 ° C </td><td> 10 Minuten </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Hold (optional) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2 : PCR - Cycler - Einstellungen

Das Ziel dieses Protokolls ist die Spezifität von Antikrebs - Arzneimittel in vitro zu beurteilen , Mischkulturen unter Verwendung von sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält.

Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die dosisabhängige prozentuale Veränderung von Tumorzellen in einer Kultur, die sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen enthält, zu bewerten. Diese Methode stellt ein genetikbasiertes Werkzeug zur Beurteilung der in-vitro-Wirkung und Spezifität von Antikrebsmitteln bereit. Sie bietet Anwendungspotenzial in der Arzneimittelforschung und der individualisierten Krebsbehandlung. Der wesentliche Vorteil dieser Methode besteht darin, dass bei der Prüfung eines Anti-Krebs-Medikaments in einer Kultur, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen enthält, die Reaktion der Tumorzellen von der Reaktion der Nicht-Tumorzellen getrennt werden kann. Diese Prozedur wird Eena, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie sowohl Tumorzellen als auch Fibroblasten über Nacht in einem standardmäßigen DMA-Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultivieren.Bei Subkonfluenz die Zellen mit 0,05 %iger Trypsin-Lösung ablösen und mittels eines Hämozytometers zählen. Anschließend in jedes Brunnen einer 96-Loch-Kulturplatte 400 Tumorzellen und 1.600 Nicht-Tumorzellen in 0,2 mL Medium mischen und für jede Wirkstoffkonzentration vierfache Ansätze anlegen. Die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Danach bereiten Sie die Stammlösungen von Nilotinib in DMSO in Konzentrationen von 0, 2, 4 und 20 mM vor. Verdünnen Sie jede dieser Lösungen 200-fach in 5 mL DMA-Medium, um zweifach konzentrierte Wirkstofflösungen mit 0, 10, 20 und 100 µM zu erhalten. Entfernen Sie anschließend 0,1 mL des Mediums aus jedem Wells.Fügen Sie 0,1 mL Medium mit dem Wirkstoff hinzu und inkubieren Sie die Zellen weiterhin für fünf Tage. Am Ende der Behandlung untersuchen Sie die anhaftenden Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop und machen Sie Fotos. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die überlebenden adhärenten Zellen einmal mit 0,2 mL PBS.Um die Zellen mit der HotSHOT-Methode zu lysieren, 50 µL alkalische Lysepufferlösung zu jedem Well hinzufügen. Die Wells mit Folie versiegeln. Anschließend die Platte 30 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einem Ofen oder auf einer Heizplatte inkubieren.Nach 30 Minuten unter dem Mikroskop überprüfen, ob keine intakten Zellen mehr an der Oberfläche der Vertiefungen vorhanden sind. Falls die Zellen nicht vollständig lysiert wurden, verlängern Sie die Erhitzungszeit oder geben Sie ein Detergens hinzu. Einmaliges Einfrieren bei 20 Grad Celsius fördert ebenfalls die Zerstörung der Zellen.Im Anschluss 50 µL der Neutralisierungslösung in jede Vertiefung geben, dann alle Lysate in die U-förmigen Vertiefungen einer PCR-Platte überführen und in einem PCR-Cycler bei 95 °C 10 bis 30 Minuten trocknen lassen. Danach die Lysate mit 20 µL destilliertem Wasser wieder aufnehmen. Um die DNA mittels Tropfendialyse von Salzen zu befreien, einen Membranfilter mit 25 mm Durchmesser in vier Bereiche einteilen und die Bereiche nummerieren.Legen Sie die Filter mit der glänzenden Seite nach oben in destilliertem Wasser in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Geben Sie dann vorsichtig 20 µL rekonstituiertes Lysat auf den Filter. Decken Sie die Platte ab und dialysieren Sie 30 bis 60 Minuten lang.Entfernen Sie anschließend das Wasser unter dem Filter, ohne den Filter umzudrehen oder die Tropfen zu stören. Überführen Sie die Lysattropfen in die Vertiefungen einer neuen PCR-Platte. Danach trocknen Sie die DNA-Tropfen, indem Sie die Platte 10 bis 30 Minuten bei 95 Grad Celsius in einem PCR-Cycler erhitzen.Rekonstituieren Sie die Lysate anschließend in 10 µL Wasser. Bereiten Sie danach die Master-Mischung für die duale Sonden-Digital-PCR-Reaktion zu, die alle Komponenten außer DNA enthält. Vortexen und zentrifugieren Sie die Master-Mischung 10 Sekunden bei maximaler Kraft und geben Sie 15 µL der Mischung in jedes Loch einer 96er-PCR-Platte.Fügen Sie das Lysat jeder Probe den Vertiefungen mit der Mastermischung hinzu. Übertragen Sie 20 µL des jeweiligen Reaktionsgemisches in die Vertiefung auf der Proben-Seite einer Kartusche bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 70 µL Tropfengenerator-Öl in jede Vertiefung auf der Öl-Seite einer Kartusche.Schließen Sie die Kartusche mit einer Dichtung und setzen Sie die gesamte Vorrichtung in einen Tröpfchengenerator, bevor Sie die Tröpfchenbildung starten. Übertragen Sie anschließend 40 µL der Tröpfchenlösung in jedes Loch einer 96-Loch-PCR-Platte. Versiegeln Sie die Platte mit einer Folie und stellen Sie die Platte in einen PCR-Cycler. Als Nächstes die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius und die Aufheizrate auf 2 Grad Celsius pro Sekunde einstellen. Nach Abschluss die Platte in ein Tropfenlesegerät überführen und mit dem Auslesen beginnen. Alternativ die Platte bis zu 24 Stunden bei 4 Grad Celsius lagern.Laden Sie nun die digitalen PCR-Daten und führen Sie eine automatische Analyse durch. Überprüfen Sie die Proben manuell, um sicherzustellen, dass die positiven und negativen Tröpfchen gut getrennt sind. Schließen Sie Proben ohne klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen von der weiteren Analyse aus.Kopieren Sie das resultierende Verhältnis von NF1 zu RPP30 in ein Excel-Arbeitsblatt. Berechnen Sie anschließend den Anteil der Tumorzellen. Berechnen Sie für jede Wirkstoffkonzentration den Mittelwert und die Standardabweichung aus den vier Wiederholungen und tragen Sie die Mittelwerte und Standardabweichungen gegen die Wirkstoffkonzentrationen auf.Hier ist die dosisabhängige Verringerung der sichtbaren vitalen Zellen dargestellt. Der Anteil an Tumorzellen, berechnet aus dem Verhältnis von NF1 zu RPP30, nahm im Bereich von 0 bis 10 µM ab. Bei der höchsten Dosis von 50 µM verblieben nur noch wenige vitale Zellen, wahrscheinlich aufgrund eines toxischen Effekts auf alle Zellen.Die Lebensfähigkeit und Proliferation der Gesamtzellpopulation kann mithilfe konventioneller Assays gemessen werden, während der Anteil an Tumorzellen mit der in der vorliegenden Studie demonstrierten Methode bestimmt werden kann. Mithilfe dieser beiden Parameter lässt sich die Gesamtzellreaktion auf ein Medikament in einer gemischten Kultur in die Reaktion der Tumorzellen und die Reaktion der Nicht-Tumorzellen aufteilen. Der gesamte Testvorgang kann innerhalb einer Woche durchgeführt werden, einschließlich einer Behandlungsphase von fünf Tagen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass das Verhältnis zwischen dem Zielgen und dem Umkehrgen variiert. Wir beobachten einen sehr engen Bereich, der zwischen 0 und 1 liegt, weshalb Präzision unerlässlich ist. Abweichungen zwischen den Proben sowie bei der Handhabung sollten so weit wie möglich minimiert werden.Mit diesem Verfahren können auch Primärkulturen, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen enthalten, zur Untersuchung der Wirkung und Spezifität von Antikrebsmitteln verwendet werden. Darüber hinaus kann die Wirkung eines Wirkstoffs auf eine bestimmte Teilpopulation von Zellen mit definierten genetischen Veränderungen gezielt bewertet werden. Ich hoffe, dass dieses Video Ihnen helfen wird zu verstehen, wie man genetische Merkmale nutzen kann, um den Anteil von Tumorzellen in einer Probe oder Kultur, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen enthält, zu bestimmen.

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