Optimierte negative Färbung: ein Hochdurchsatz-Protokoll für die Prüfung kleiner und asymmetrische Proteinstruktur durch Elektronenmikroskopie

Mehr als die Hälfte der Proteine ​​sind kleine Proteine ​​(Molekularmasse <200 kDa), die herausfordernd sind sowohl für Elektronenmikroskop Bildgebung und dreidimensionale Rekonstruktionen. Optimierte negative Färbung ist eine robuste und Hochdurchsatz-Protokoll, um einen hohen Kontrast und eine relativ hohe Auflösung (~ 1 nm) Bilder von kleinen asymmetrische Proteine ​​oder Komplexe unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu erhalten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kleine und asymmetrische Proteine unter Verwendung eines für den Hochdurchsatz optimierten Protokolls der negativen Färbeelektronenmikroskopie abzubilden. Dies wird erreicht, indem das Protein zunächst in einer vorbereiteten Inkubationsstation inkubiert wird, während eine Negativfärbe-Workstation vorbereitet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Probe schnell auf drei Wassertröpfchen nacheinander zu waschen.

Der dritte Schritt besteht darin, die Probe sorgfältig nacheinander auf drei Färbeltröpfchen zu färben. Der letzte Schritt besteht darin, die überschüssige Lösung zu entfernen, indem man sie von der Rückseite des EM-Gitters abtupft und dann vorsichtig unter Stickstoffgas trocknet. Letztendlich können die Ergebnisse hochauflösende Bilder von kleinen Proteinen durch TEM-Bildgebung unter einer niedrigen Defokussierungsbedingung zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Kryo-Elektromikroskopie ist festgelegt. Es ermöglicht die Untersuchung mit hohem Durchsatz und die kontrastreiche Bildgebung kleiner und asymmetrischer Proteinstrukturen bei gleichzeitiger Reduzierung der Strukturartefakte durch herkömmliche negative Färbung. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die strukturellen Grundlagen für kleine Proteinmechanismen wie das Cholesterinester-Transferprotein geben.

Es kann auch auf andere Proteine wie IgG, einen Antikörper, ein Lipoprotein hoher Dichte und Proteasom angewendet werden, die in ihrer Größe stark variieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Wasch- und Färbeschritte aufgrund des unterschiedlichen Timings schwer zu erlernen sind und selbst das Abtupfen der Probe dramatische Effekte im fertig gefärbten Protein verursachen kann. Die Demonstration des Verfahrens wird bei Z.A. Forschungsstipendiaten aus meinem Labor fehlen. Bei der Vorbereitung auf dieses Protokoll ist es notwendig, eine 1%-Urinal-Lösung Form 8 herzustellen, wobei größter Wert auf die Minimierung der Lichteinwirkung gelegt wird.

Dazu gehört das Einwickeln der Spritze N 0,2 Mikron Filterteile in Folie, wenn es an der Zeit ist, die Lösung zum ersten Mal zu filtrieren. Lagern Sie nach dem Filtrieren zwei in Folie eingewickelte Milliliter-Fläschchenaliquots am Tag des Experiments bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie ein Aliquot in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf, sobald es vollständig aufgetaut ist.

Filtern Sie es erneut durch einen 0,02-Mikron-Filter mit in Folie eingewickelten Teilen. Das Auffangfläschchen sollte ebenfalls in Folie eingewickelt werden. Übertragen Sie den negativen Fleck in eine Eisbox, bis er verwendet wird.

Stelle ein Tröpfchen-Halteblatt her, indem du einen acht Zoll langen Param auf eine Pipettenspitzenhalterung drückst. Dabei entstehen Straßenvertiefungen, die als Vertiefungen mit einem Durchmesser von fünf Millimetern dienen. Nachdem Sie sechs Reihen Vertiefungen gemacht haben, glätten Sie das Eis auf der Oberfläche einer Styroporschale und positionieren Sie die Folie auf dem Eis.

Geben Sie als Nächstes 35 Mikroliter DI-Wasser in die ersten drei Vertiefungen des Blattes auf der linken Seite. Laden Sie dann die drei rechten Vertiefungen in das Blatt mit 35 Mikrolitern der vorbereiteten negativen Färbelösung. Decken Sie das Tablett ab, um die Lichteinwirkung auf die Lösung zu minimieren.

Diese dient als Färbestation. Bereiten Sie nun aus einer leeren Pipettenspitzenbox mit einem Aufsatz eine EM-Gitterinkubationsstation vor, an der eine Pinzette befestigt werden kann. Füllen Sie die Box zur Hälfte mit Eis, so dass die Eisoberfläche nahe an der Spitze der Pinzette liegt, wenn sie montiert ist.

Erstes Glühen: Entladen Sie die dünnen, kohlenstoffbeschichteten 300 Mesh Kupfer EM-Gitter für ca. 10 Sekunden. Nehmen Sie als Nächstes ein Gitter mit einer Pinzette, die an der EM-Gitter-Inkubationsstation eingehakt wird. Hängen Sie die Pinzette mit dem Gitter auf, so dass das Gitter einen halben Zoll über dem Eis um 45 Grad geneigt ist.

Verdünnen Sie nun die Proteinprobe in DPBS bei 50 bis 100 Mikrogramm Protein pro Milliliter Lösung. Tragen Sie sofort etwa vier Mikroliter der Verdünnung auf das EM-Gitter auf. Lassen Sie die Probe etwa eine Minute lang inkubieren.

Nach einer Minute tupfen Sie das Netz schnell mit Filterpapier ab, um überschüssige Lösung zu entfernen. Berühren Sie dann an der Färbestation das Netz mit dem ersten Tropfen Wasser auf der Para-Folie. Wiederholen Sie schnell den Vorgang des Trocknens des Filters und des Röstens mit dem nächsten Tröpfchen.

Verwenden Sie insgesamt drei Wassertröpfchen und tun Sie dies so schnell wie möglich. Das Waschen des Gitters mit Wasser muss schnell erfolgen, um nachteilige Auswirkungen des Pufferwechsels auf das Protein zu vermeiden. Nachdem Sie die letzte Wäsche innerhalb von drei Sekunden abgetupft haben, beginnen Sie, das Gitter auf dem ersten Tropfen der negativen Färbelösung schwimmen zu lassen.

Lassen Sie es dort 10 Sekunden lang schweben. Reinigen Sie in der Zwischenzeit die Pinzette, indem Sie die Spitzen in das Filterpapier drücken. Tupfen Sie nach dem zehnsekündigen Schwimmer die Lösung mit Filterpapier ab und starten Sie einen weiteren Schwimmer im nächsten Fleckentröpfchen für zwei Sekunden.

Reinigen Sie die Pinzette während der zwei Sekunden. Tupfen Sie dann den Rost trocken und geben Sie ihn auf das dritte Tröpfchen. Decken Sie die Färbestation während dieses Schritts eine volle Minute lang ab.

Zum Entfernen des Flecks muss die Rückseite des EM-Gitters für eine bestimmte Zeit berührt werden, um sicherzustellen, dass das Gitter gleichmäßig getrocknet wird. Wenn das Filterpapier den Fleck zu lange berührt, kann zu viel Fleck entfernt werden, was zu einer schlechten Bildgebung führt. Fahren Sie anschließend mit dem Trocknen des Gitters fort.

Berühren Sie zuerst die gesamte kohlenstofffreie Seite des Filterpapiers, bis die Lösung abgeht. Zweitens, wenden Sie einen sanften Strom Stickstoffgas an. Schieben Sie nun den Rost in eine mit Filterpapier ausgelegte Schüssel und decken Sie die Form teilweise ab.

Lassen Sie den Rost 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Form trocknen. Alternativ können lipidhaltige Proben eine Stunde lang bei 40 Grad Celsius gebacken werden. Sobald das EM-Gitter vollständig getrocknet ist, übertragen Sie es in eine EM-Gitter-Aufbewahrungsbox, bevor Sie zuerst beginnen und das TEM ausrichten.

Überprüfen Sie die Auflösung des höchsten sichtbaren Auftaurings mit dem Leistungsspektrum eines Kohlenstofffilmbereichs des negativ gefärbten Gitters, das besser sein sollte als die angestrebte Auflösung. Um die Ausrichtung anzupassen, überprüfen Sie dann sorgfältig das Leistungsspektrum auf dem Kohlenstofffilmbereich der Probe. Unter richtig ausgerichteten Bedingungen können mehr als 20 T tho Ringe visualisiert werden, was einer Visualisierung besser als fünf Ångström entspricht.

Die Ringe wurden durch kürzlichere Übertragung eines amorphen Kohlenstoffbildes unter einer Unschärfe von 1,6 Mikrometern und einer Dosis von 20,4 Elektronen pro Quadrat hergestellt. Ångström. Bringen Sie nun den Fokus wieder auf eine nahe Scherzer-Fokusbedingung von etwa 0,1 Mikrometern für die Bildgebung kleiner Proteine während der Untersuchung des EM-Gitters. Im Idealfall befinden sich gefärbte Bereiche in der Regel in der Nähe des Randes von dickeren gefärbten trüben Bereichen bei geringer Vergrößerung.

Die Struktur der Lipoproteinproben wurde mit OPNS betrachtet. Beispiele hierfür sind rekombinantes HDL, humanes Plasma, LDL, humanes Plasma-IDL und humanes Plasma-VLDL. Kleinere Strukturen wie 53 Kilodalton, CETP wurden ebenfalls besichtigt.

Es ist eines der kleinsten Proteine, die mit dem EEM erfolgreich abgebildet wurden. Das Super-Imposition der CETP-Kristallstruktur passt sehr gut zum Bild, sehr dynamisch. Heterogene Proteine wurden auch in 160 Kilodalton Immunglobulin G-Antikörpern betrachtet.

Drei Subdomains waren deutlich zu erkennen. Bei näherer Untersuchung des IgG-Antikörpers wurde ein Antikörper verwendet, um einen Vergleich mit seiner Kristallstruktur anzustellen. Die Kristallstruktur des IgG-Antikörpers stimmt in vielerlei Hinsicht mit der EM-Ansicht dieser Antikörper überein, z. B. in Bezug auf die Domänenpositionen und deren Formen.

Andere betrachtete Moleküle umfassen 28 Kilodalton, lipidfreies Apo-Lipoprotein A, One Grow EL und Proteasomen. Im Wesentlichen erweitert die OPNS-Methode die Grenze der EM-Bildgebung für kleine asymmetrische Strukturen sowie die damit verbundenen mechanistischen Studien erheblich. Es ist wichtig, die Lichteinwirkung auf das Fleckenreagenz so weit wie möglich zu reduzieren, um die Probe schnell zu waschen und in der Nähe des Schatzfokus für die Bildgebung zu verwenden. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Methoden, wie z.B. die Elektronentomographie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Nanometer-Auflösungsstrukturen einzelner Moleküle und die bestätigenden Änderungen zwischen ihnen. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Strukturbiologie, um die Magnete eines Cluster-Ester-Transfers zwischen den menschlichen Plasma-Lipoproteinen zu erforschen.