Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einsatz einer Multiplex-Point-of-Care-Diagnostikplattform zu demonstrieren, die keine umfangreiche Probenvorbereitung und teure Instrumente erfordert und in einer Vielzahl von biologischen Proben eingesetzt wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Point-of-Care-Diagnostik zu beantworten, wie z.B. den Nachweis verschiedener Ziele in einem einzigen Reaktionsgefäß. Durch die Verwendung von schleifenvermittelter isothermer Amplifikation in Verbindung mit zielspezifischen Strangverdrängungssonden können drei verschiedene Viren effizient nachgewiesen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine isotherme Amplifikation anstelle der PCR verwendet, eine minimale Probenvorbereitung erfordert und auf eine Reihe von klinischen Proben angewendet werden kann. Beginnen Sie damit, Q-paper-Blätter mit einer Papierstanze in kleine Rechtecke von drei Millimetern x vier Millimetern zu schneiden. Verwenden Sie dann einen Mikrostößel, um weibliche Mücken von Aedes aegypti, die möglicherweise mit Zika infiziert sind, auf jedem Papier zu zerkleinern.

Pipettieren Sie 20 Mikroliter einer molaren wässrigen Ammoniaklösung auf jedes Blatt Papier. Waschen Sie nach fünf Minuten jedes Papier mit 20 Mikrolitern 50 % Ethanol, gefolgt von 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Trocknen Sie das Papier etwa eine Stunde lang in einer BSL-2-Biosicherheitswerkbank an der Luft.

Nach dem Trocknen jedes Papier mit einer Pinzette vollständig in 100 Mikroliter RT-LAMP-Reaktionsgemisch tauchen und 45 Minuten lang bei 65 bis 68 Grad Celsius inkubieren. Lesen und aufzeichnen Sie die vom Zika-Virus ausgehende Fluoreszenz mit einer 3D-gedruckten Beobachtungsbox mit einer LED-Lichtquelle und einem orangefarbenen oder gelben Filter. Beginnen Sie mit der Zugabe von 90 Mikrolitern 1,1-fachem Rehydrationspuffer in jedes Reaktionsröhrchen, das lyophilisierte RT-LAMP-Reagenzien enthält, und lösen Sie es durch Schütteln auf.

Dann schleudern Sie kurz mit dem 1.000-fachen der Schwerkraft nach unten. Nach der Zentrifugation werden 10 Mikroliter Urinprobe, die mit der viralen RNA versetzt ist, in die Reaktionsröhrchen gegeben und durch Pipettieren gemischt. Wenn Sie Mücken testen, fügen Sie ein Rechteck aus Q-Papier hinzu, das die Mückenkadaver zusammen mit 10 Mikrolitern gereinigtem Wasser anstelle von Urin enthält.

Legen Sie die geschlossenen Röhrchen in einen auf 65 bis 68 Grad Celsius voreingestellten Heizblock und inkubieren Sie sie 30 bis 45 Minuten lang. Halten Sie die Röhrchen nach der Inkubation geschlossen, um eine Kontamination zukünftiger Assays zu vermeiden, und legen Sie sie in die Beobachtungsbox. Schalten Sie den Schalter auf der Rückseite der Beobachtungsbox ein.

Beobachten Sie die Probe durch den Orangefilter und nehmen Sie das Bild mit einer Handykamera auf, die in einer Entfernung gehalten wird, in der das Bild 80 % des Sichtfeldes ausfüllt. Schalten Sie nach Abschluss der Visualisierung den Schalter aus. Lagern Sie die verschlossenen Röhrchen im Dunkeln, vorzugsweise mit Kühlung, wenn eine spätere Visualisierung erforderlich ist.

Sowohl in Singleplex- als auch in Multiplex-Fällen erscheinen RT-LAMP-Produkte als Buchstabe von Concatemern, wenn sie auf Agarosegel ausgeführt werden. Negative Kontrollproben, die Wasser als Probe enthielten, lieferten nur die Banden für die Primer selbst, einschließlich der unspezifischen Zielkontrolle, bei der die Gesamtnukleinsäure, die von einer nicht infizierten weiblichen Mücke extrahiert wurde, als Vorlage verwendet wurde. Grüne Fluoreszenz wird für Zika mit Sonden wie fünf Primzahlen von NT beobachtet, die mit FAM markiert sind.

Hellgrün-gelbe Fluoreszenz wird Chikungunya zugeordnet, wobei die Sonde fünf Prime NT ist, die mit HEX markiert sind. Eine orange-rote Fluoreszenz wird für Dengue-1 verwendet, wobei die Sonde fünf Primzahlen NT ist, die mit TAMRA markiert sind. Zwei Papiere mit Mücken wurden direkt in das RT-LAMP-Gemisch getaucht und nach einer 30-minütigen Inkubation bei 65 Grad Celsius wurde eine hellgrüne Fluoreszenz in Gegenwart des Zika-Virus beobachtet.

Mit neun Volumina Rehydrationspuffer und einem Volumen Urinprobe kann innerhalb von 30 Minuten eine sichtbare grüne Fluoreszenz erzeugt und das Bild mit jeder Handykamera aufgenommen werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik, um Point-of-Care-Plattformen zum Nachweis von durch Mücken übertragenen Viren in Urin, Blut, Speichel oder Mückenkadavern zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein isothermes Amplifikationssystem, in diesem Fall eine Lampe, verwendet, um Zika und andere Arboviren in multiplexer Weise in einer Vielzahl von biologischen Proben nachzuweisen.