Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen
29. Oktober 2020
Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden
Unser Multiplex-Immunfluoreszenz-basierter zellbasierter Nachweis von DNA, RNA und Proteinen ermöglicht es uns, Proteine und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strangung innerhalb einzelner Zellen gleichzeitig sichtbar zu machen. Vor der Aussaat die Deckgläser fünf Minuten lang in Ethanol inkubieren, gefolgt von zwei zweiminütigen Wäschen in PBS. Nach der zweiten Wäsche den Deckglas 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vollständig in 20 Mikrogramm pro Milliliter Poly-D-Lysin eintauchen.
Am Ende der Inkubation entfernen Sie die überschüssige Matrixlösung mit zwei Wäschen in PBS und verdünnen Sie die interessierenden Zellen mit 1 x 10 bis zu den sechsten Zellen pro 50 Mikroliter PBS pro Deckglaskonzentration. Säen Sie dann 50 Mikroliter der interessierenden Zellen auf jedes mit Poly-D-Lysin beschichtete Deckglas für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal in PBS, bevor Sie sie 30 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd fixieren.
Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal in PBS, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,1 % Tween 20 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisieren. Waschen Sie am Ende der Inkubation jeden Einbezugsbezug zweimal mit 500 Mikrolitern frischem PBS pro Waschgang. Um den Deckglas auf einem Objektträger zu fixieren, geben Sie einen kleinen Tropfen Klarlack auf einen sterilisierten Glasobjektträger und legen Sie eine Kante der zellfreien Seite des Deckglases auf den Nagellacktropfen und senken Sie den Deckglas mit der Seite nach oben auf die Objektträgerzelle.
Geben Sie ein paar Tropfen PBS auf das immobilisierte Deckblatt, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen, und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis um die Außenseite des Deckblatts. Wenn die Barriere gezogen wurde, ersetzen Sie die PBS durch 100 Mikroliter Protease III und legen Sie den Objektträger für 15 Minuten in einen 40 Grad Celsius heißen Inkubator. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation zweimal pro Waschgang zwei Minuten lang in frischem PBS unter Schaukeln.
Nach dem zweiten Waschen verdünnen Sie die Sonde von Interesse 10 Minuten lang in 200 Mikrolitern Hybridisierungspuffer bei 67 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter der Sondenlösung auf jedes Deckglas und legen Sie die Objektträger für zwei Stunden in einen befeuchteten Ofen bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation zweimal mit frischem Waschpuffer und wiegen Sie sie zwei Minuten pro Waschgang.
Klopfen Sie nach dem zweiten Waschen auf die Objektträger, um den überschüssigen Puffer zu entfernen, und behandeln Sie die Deckgläser nacheinander mit einem Tropfen der Verstärker für die Fluoreszenzkanäle 1, 2 und 3 für eine 30-minütige Inkubation bei 40 Grad Celsius pro Verstärker mit zwei zweiminütigen Wäschen in frischem Waschpuffer mit Schaukeln pro Waschgang zwischen den Behandlungen. Geben Sie nach dem letzten Waschen einen Tropfen des fluoreszierenden Kanal-4-Verstärkers für eine 15-minütige Inkubation im 40-Grad-Gefrierofen auf den Deckglas und waschen Sie den Objektträger zweimal mit Waschpuffer und einmal mit PBS, wie gezeigt. Zur Immunfärbung der interessierenden Proteine wird nach der letzten Wäsche jedes Deckglas mit 200 Mikrolitern Blockpuffer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur behandelt.
Am Ende der Inkubation wird der Blockierungspuffer dekantiert und 200 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse, verdünnt in PBS und Tween 20, ergänzt mit 1 %igem Rinderserumalbumin, hinzugefügt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Objektträger mit zwei 10-minütigen Wäschen in frischem PBS plus Tween 20 unter Schütteln pro Waschgang, bevor Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Sekundärantikörper markieren. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation zweimal mit frischem PBS plus Tween 20 für 10 Minuten unter Schütteln pro Waschgang.
Nach dem zweiten Waschen werden die Zellkerne eine Minute lang bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Kernfarbstoff gegengefärbt, gefolgt von zwei Waschgängen in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Um die Proben für die Bildgebung zu montieren, geben Sie einen Tropfen Antifading-Lösung auf einen neuen sterilen Objektträger pro Probe und verteilen Sie die Lösung so, dass eine Fläche bedeckt ist, die ungefähr der Größe der Deckgläser entspricht. Lösen Sie die Deckgläser von den Objektträgern und tauchen Sie sie in PBS ein.
Entfernen Sie mit einer Pinzette alle Nagellackreste und trocknen Sie die Rückseite des Deckglases mit einem Labortuch ab. Legen Sie dann jedes Deckblatt vorsichtig mit der Seite nach unten auf die Antifading-Lösung und lassen Sie die Proben über Nacht trocknen. Als Proof of Concept dieses Verfahrens wurden HIV-1-DNA, RNA und -Protein gleichzeitig markiert und mikroskopisch auf Einzelzellebene sichtbar gemacht.
In diesem Beispiel können zwei HIV-1-DNA-Genome in einer einzigen Zelle sichtbar gemacht werden, während sie die virale RNA aktiv transkribieren. Die virale RNA wurde durch den Kernporenkomplex exportiert und das virale Protein im Zytoplasma synthetisiert. Wie beobachtet, wird zwischen den Sondensätzen der beiden Viren nur sehr geringe bis gar keine Kreuzreaktivität beobachtet, obwohl die Markierung mit zwei Retroviren das Potenzial für eine Sondenkreuzreaktivität aufweist.
Darüber hinaus kann die virale RNA-Färbung eliminiert werden, wenn die Zellen während der Probenvorbereitung mit RNase behandelt werden. Die mittlere integrierte Fluoreszenzintensität des Antikörpersignals pro Zelle in jedem Bild kann dann quantifiziert werden. Wie beobachtet, nimmt die Menge an HBV-prägenomischer RNA und Gesamt-HBV-RNA im Verlauf der HBV-Infektion zu.
Die Bildgebung von HCV-Infektionen kann auch über konfokale Mikroskopie mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv durchgeführt werden, um die interessierenden Fluorophore zu detektieren. Dieser hochspezifische Ansatz ermöglicht auch die Verfolgung viraler oder zellulärer Prozesse mit einer hohen räumlich-zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus kann diese Technik zur Untersuchung mehrerer Viren und anderer Krankheitserreger verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine multiplex immunfluoreszenzbasierte Nachweismethode an Zellen für die simultane Visualisierung von DNA, RNA und Proteinen innerhalb einzelner Zellen vor. Der Ansatz zeigt seine Wirksamkeit bei der Beobachtung viraler Proteine und Nukleinsäuren unterschiedlicher Typen und Strangzahl auf und demonstriert so seine breite Anwendbarkeit über verschiedene biologische Systeme hinweg.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Immunfluoreszenztechniken
- Virusnachweis
Hintergrund
- Die gleichzeitige Detektion mehrerer Biomoleküle ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse.
- Herkömmliche Methoden können bei der Spezifität und Kreuzreaktivität in Multiplex-Systemen Schwierigkeiten haben.
- Fortschritte in den Bildgebungstechniken verbessern die Visualisierung und Quantifizierung auf Einzelzell-Ebene.
Verwendete Methoden
- Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung
- Einzelzellanalyse in verschiedenen viralen Kontexten
- Fluoreszenzverstärkungs- und Hybridisierungstechniken
Hauptergebnisse
- Gleichzeitige Markierung und Visualisierung von HIV-1-DNA, RNA und Protein
- Hohe Spezifität mit minimaler Kreuzreaktivität in den Sonden-Sets
- Quantitative Analyse der viralen RNA während einer HBV-Infektion
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine robuste Methode zur Verfolgung viraler Prozesse mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bereit.
- Die Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in pathogene Mechanismen und potenzielle therapeutische Ansatzpunkte in der Virologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die simultane Visualisierung von viralen Nukleinsäuren und Proteinen in einzelnen Zellen schließt eine entscheidende Lücke bei der Validierung antiviraler Zielstrukturen, indem sie eine direkte Beobachtung der Replikationsdynamik ermöglicht. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckung, indem sie die Expression von Nukleinsäuren mit der Proteinsynthese über verschiedene virale Systeme hinweg korreliert. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitverbindungen, indem sie räumlich aufgelöste, quantitative Messwerte der Stadien des viralen Lebenszyklus liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Transkription viraler Nukleinsäuren mit der Proteinsynthese in einzelnen infizierten Zellen verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Verringert mechanistische Unschärfen durch direkte räumliche Gleichortigkeit von DNA, RNA und Proteintargets, ohne Kreuzreaktivität zwischen den Sondensätzen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem aktive Phasen der Virusreplikation in Modellen von HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika und Influenza sichtbar gemacht werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messungen der Fluoreszenzintensität für virale RNA- und Proteinspiegel und ermöglicht dadurch die Dosis-Wirkungs-Bewertung bei der Wirkstoffscreening.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare Einzelzell-Auslesesignale, die mit konfokaler Mikroskopie für hochinhaltsbasierte Anwendungen kompatibel sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Einsatzbereitschaft des Assays für antivirale Screening-Verfahren, indem gleichzeitige Nachweise von Nukleinsäuren und Proteinen in fixierten Zellen bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verfolgt die Anreicherung viraler RNA während des Infektionsverlaufs, beispielsweise den Anstieg der prägenomischen RNA von HBV, um die pharmakokinetische/pharmakodynamische Modellierung zu unterstützen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die hochaufgelöste räumlich-zeitliche Abbildung viraler Prozesse mithilfe von 60X-Ölimmersionsobjektiven für detaillierte mechanistische Untersuchungen.
- Wissenschaftlicher Wert: Dient als Vorlage für multiplexierte Bildgebung in weiter gefassten zellulären Systemen und unterstützt die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette ein, indem sie mechanistische Einblicke nach der Zielidentifizierung, jedoch vor der Leadoptimierung liefert, insbesondere für antivirale Programme, die die Validierung von Replikationsinhibitoren erfordern.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Visualisierung des nukleinsäurebedingten Virusausstoßes und der zytoplasmatischen Proteinsynthese in einzelnen Zellen.
- Screening: Liefert quantitative, multiplexe Ergebnisse, die den Vergleich von Behandlungseffekten auf die virale Replikation und Proteinausprägung ermöglichen.
- Analytik: Ermöglicht die Quantifizierung der mittleren integrierten Fluoreszenzintensität pro Zelle und damit statistische Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, indem sie virale RNA- und Proteindynamiken modelliert, die für die Beurteilung der Wirksamkeit von Inhibitoren relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die auf mehrere virale Pathogene anwendbar ist, ohne dass die Kernprobenchemie neu formuliert werden muss.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet Vorhersagesicherheit durch direkte Beobachtung der koexprimierten viralen Nukleinsäure und Proteine und reduziert so falsch-positive Ergebnisse bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung mittels der verzweigten DNA-IS-H-Technologie, die die Empfindlichkeit gegenüber herkömmlichem FISH verbessert und mit Immunfärbungen kompatibel ist.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch räumlich aufgelöste, mechanistische Daten zum Fortschreiten des Viruslebenszyklus.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von antiviralen Kandidaten basierend auf simultanen Metriken zur Unterdrückung von Nukleinsäuren und Proteinen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit multiplexer Immunfluoreszenz und verzweigten DNA-in-situ-Hybridisierungs-Sonden.
- Ist abhängig von Hybridisierungsöfen, konfokalen Mikroskopen und hydrophoben Barrierestiften für die Objektträgerpräparation.
- Erfordert die Standardisierung von Blockier-, Antikörperinkubations- und Waschprotokollen zwischen Laboren für reproduzierbare Ergebnisse.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Erweiterung auf neue virale Zielstrukturen oder zelluläre Systeme aufgrund unterschiedlicher Nukleinsäure-Zugänglichkeit.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit von RNase-Behandlungskontrollen zur Bestätigung des RNA-spezifischen Signals sowie Übernacht-Trocknungsschritte zur Probenaufbringung.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:24
Cell Seeding, Fixation and Permeabilization
1:40
Coverslip Immobilization and Protease Treatment
2:31
Target Probe and Amplifier Hybridization
3:40
Protein Immunostaining and Nuclear Counterstaining
4:48
Mounting
5:28
Results: Representative Single‐Cell Multiplexed Fluorescence Imaging
6:54
Conclusion
