Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen
October 29th, 2020
Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden
Unser Multiplex-Immunfluoreszenz-basierter zellbasierter Nachweis von DNA, RNA und Proteinen ermöglicht es uns, Proteine und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strangung innerhalb einzelner Zellen gleichzeitig sichtbar zu machen. Vor der Aussaat die Deckgläser fünf Minuten lang in Ethanol inkubieren, gefolgt von zwei zweiminütigen Wäschen in PBS. Nach der zweiten Wäsche den Deckglas 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vollständig in 20 Mikrogramm pro Milliliter Poly-D-Lysin eintauchen.
Am Ende der Inkubation entfernen Sie die überschüssige Matrixlösung mit zwei Wäschen in PBS und verdünnen Sie die interessierenden Zellen mit 1 x 10 bis zu den sechsten Zellen pro 50 Mikroliter PBS pro Deckglaskonzentration. Säen Sie dann 50 Mikroliter der interessierenden Zellen auf jedes mit Poly-D-Lysin beschichtete Deckglas für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal in PBS, bevor Sie sie 30 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd fixieren.
Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal in PBS, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,1 % Tween 20 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisieren. Waschen Sie am Ende der Inkubation jeden Einbezugsbezug zweimal mit 500 Mikrolitern frischem PBS pro Waschgang. Um den Deckglas auf einem Objektträger zu fixieren, geben Sie einen kleinen Tropfen Klarlack auf einen sterilisierten Glasobjektträger und legen Sie eine Kante der zellfreien Seite des Deckglases auf den Nagellacktropfen und senken Sie den Deckglas mit der Seite nach oben auf die Objektträgerzelle.
Geben Sie ein paar Tropfen PBS auf das immobilisierte Deckblatt, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen, und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis um die Außenseite des Deckblatts. Wenn die Barriere gezogen wurde, ersetzen Sie die PBS durch 100 Mikroliter Protease III und legen Sie den Objektträger für 15 Minuten in einen 40 Grad Celsius heißen Inkubator. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation zweimal pro Waschgang zwei Minuten lang in frischem PBS unter Schaukeln.
Nach dem zweiten Waschen verdünnen Sie die Sonde von Interesse 10 Minuten lang in 200 Mikrolitern Hybridisierungspuffer bei 67 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter der Sondenlösung auf jedes Deckglas und legen Sie die Objektträger für zwei Stunden in einen befeuchteten Ofen bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation zweimal mit frischem Waschpuffer und wiegen Sie sie zwei Minuten pro Waschgang.
Klopfen Sie nach dem zweiten Waschen auf die Objektträger, um den überschüssigen Puffer zu entfernen, und behandeln Sie die Deckgläser nacheinander mit einem Tropfen der Verstärker für die Fluoreszenzkanäle 1, 2 und 3 für eine 30-minütige Inkubation bei 40 Grad Celsius pro Verstärker mit zwei zweiminütigen Wäschen in frischem Waschpuffer mit Schaukeln pro Waschgang zwischen den Behandlungen. Geben Sie nach dem letzten Waschen einen Tropfen des fluoreszierenden Kanal-4-Verstärkers für eine 15-minütige Inkubation im 40-Grad-Gefrierofen auf den Deckglas und waschen Sie den Objektträger zweimal mit Waschpuffer und einmal mit PBS, wie gezeigt. Zur Immunfärbung der interessierenden Proteine wird nach der letzten Wäsche jedes Deckglas mit 200 Mikrolitern Blockpuffer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur behandelt.
Am Ende der Inkubation wird der Blockierungspuffer dekantiert und 200 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse, verdünnt in PBS und Tween 20, ergänzt mit 1 %igem Rinderserumalbumin, hinzugefügt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Objektträger mit zwei 10-minütigen Wäschen in frischem PBS plus Tween 20 unter Schütteln pro Waschgang, bevor Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Sekundärantikörper markieren. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation zweimal mit frischem PBS plus Tween 20 für 10 Minuten unter Schütteln pro Waschgang.
Nach dem zweiten Waschen werden die Zellkerne eine Minute lang bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Kernfarbstoff gegengefärbt, gefolgt von zwei Waschgängen in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Um die Proben für die Bildgebung zu montieren, geben Sie einen Tropfen Antifading-Lösung auf einen neuen sterilen Objektträger pro Probe und verteilen Sie die Lösung so, dass eine Fläche bedeckt ist, die ungefähr der Größe der Deckgläser entspricht. Lösen Sie die Deckgläser von den Objektträgern und tauchen Sie sie in PBS ein.
Entfernen Sie mit einer Pinzette alle Nagellackreste und trocknen Sie die Rückseite des Deckglases mit einem Labortuch ab. Legen Sie dann jedes Deckblatt vorsichtig mit der Seite nach unten auf die Antifading-Lösung und lassen Sie die Proben über Nacht trocknen. Als Proof of Concept dieses Verfahrens wurden HIV-1-DNA, RNA und -Protein gleichzeitig markiert und mikroskopisch auf Einzelzellebene sichtbar gemacht.
In diesem Beispiel können zwei HIV-1-DNA-Genome in einer einzigen Zelle sichtbar gemacht werden, während sie die virale RNA aktiv transkribieren. Die virale RNA wurde durch den Kernporenkomplex exportiert und das virale Protein im Zytoplasma synthetisiert. Wie beobachtet, wird zwischen den Sondensätzen der beiden Viren nur sehr geringe bis gar keine Kreuzreaktivität beobachtet, obwohl die Markierung mit zwei Retroviren das Potenzial für eine Sondenkreuzreaktivität aufweist.
Darüber hinaus kann die virale RNA-Färbung eliminiert werden, wenn die Zellen während der Probenvorbereitung mit RNase behandelt werden. Die mittlere integrierte Fluoreszenzintensität des Antikörpersignals pro Zelle in jedem Bild kann dann quantifiziert werden. Wie beobachtet, nimmt die Menge an HBV-prägenomischer RNA und Gesamt-HBV-RNA im Verlauf der HBV-Infektion zu.
Die Bildgebung von HCV-Infektionen kann auch über konfokale Mikroskopie mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv durchgeführt werden, um die interessierenden Fluorophore zu detektieren. Dieser hochspezifische Ansatz ermöglicht auch die Verfolgung viraler oder zellulärer Prozesse mit einer hohen räumlich-zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus kann diese Technik zur Untersuchung mehrerer Viren und anderer Krankheitserreger verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert eine multiplex-immunfluoreszente, zellbasierte Nachweismethode zur gleichzeitigen Visualisierung von DNA, RNA und Proteinen in Einzelzellen. Der Ansatz zeigt seine Wirksamkeit bei der Beobachtung viraler Proteine und Nukleinsäuren verschiedener Typen und Stränge und demonstriert damit seine breite Anwendbarkeit in verschiedenen biologischen Systemen.
Hauptbestandteile der Studie
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Immunofluorescence-Techniken
- Virale Erkennung
Hintergrund
- Die gleichzeitige Erkennung mehrerer Biomoleküle ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse.
- Traditionelle Methoden können mit Spezifität und Kreuzreaktivität in Multiplex-Systemen zu kämpfen haben.
- Fortschritte in der Bildgebungstechnik verbessern die Visualisierung und Quantifizierung auf Einzelzellebene.
Verwendete Methoden
- Multiplex-immunfluoreszente Bildgebung
- Einzelzellanalyse in verschiedenen viralen Kontexten
- Fluoreszente Amplifikations- und Hybridisierungstechniken
Hauptergebnisse
- Gleichzeitige Markierung und Visualisierung von HIV-1 DNA, RNA und Protein
- Hohe Spezifität mit minimaler Kreuzreaktivität in Sondensätzen
- Quantitative Analyse der viralen RNA während einer HBV-Infektion
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert eine robuste Technik zur Verfolgung viraler Prozesse mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.
- Die Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in pathogene Mechanismen und potenzielle therapeutische Ziele in der Virologie.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous visualization of viral nucleic acids and proteins in single cells addresses a critical gap in antiviral target validation by enabling direct observation of replication dynamics. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by correlating nucleic acid expression with protein production across diverse viral systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing spatially resolved, quantitative readouts of viral life-cycle stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking viral nucleic acid transcription to protein synthesis in individual infected cells.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through direct co-localization of DNA, RNA, and protein targets without cross-reactivity between probe sets.
- Scientific Value: Supports functional target validation by visualizing active viral replication stages across HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika, and influenza models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity measurements for viral RNA and protein levels, enabling dose-response assessment in compound screening.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible single-cell readouts compatible with confocal microscopy for high-content applications.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness for antiviral screening by providing simultaneous nucleic acid and protein detection in fixed cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks viral RNA accumulation over infection courses, such as HBV pre-genomic RNA increase, to inform pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling.
- Operational Value: Enables high spatiotemporal resolution imaging of viral processes using 60X oil immersion objectives for detailed mechanistic studies.
- Scientific Value: Serves as a template for multiplexed imaging in broader cellular systems, supporting translational continuity from discovery to preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing mechanistic insights post-target identification but prior to lead optimization, particularly for antiviral programs requiring validation of replication inhibitors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing viral nucleic acid export and cytoplasmic protein synthesis in single cells.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs that allow comparison of treatment effects on viral replication and protein expression.
- Analytics: Enables mean integrated fluorescence intensity quantification per cell, facilitating statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling viral RNA and protein dynamics relevant to inhibitor efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple viral pathogens without reformulation of core probe chemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct observation of viral nucleic acid-protein co-expression, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization via branched DNA ISH technology that improves sensitivity over conventional FISH and accommodates immunostaining compatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering spatially resolved mechanistic data on viral life-cycle progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on concurrent nucleic acid and protein suppression metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplex immunofluorescence and branched DNA in situ hybridization probe handling.
- Depends on hybridization ovens, confocal microscopes, and hydrophobic barrier pens for slide preparation.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and wash protocols across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to new viral targets or cellular systems due to varying nucleic acid accessibility.
- Includes practical limitations such as the need for RNase treatment controls to confirm RNA-specific signal and overnight drying steps for sample mounting.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:24
Cell Seeding, Fixation and Permeabilization
1:40
Coverslip Immobilization and Protease Treatment
2:31
Target Probe and Amplifier Hybridization
3:40
Protein Immunostaining and Nuclear Counterstaining
4:48
Mounting
5:28
Results: Representative Single‐Cell Multiplexed Fluorescence Imaging
6:54
Conclusion
