Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung einer kleinen, gebrauchsfertigen Kassette, die für den visuellen Nachweis mehrerer Nukleinsäuren in einem einzigen, einfach zu bedienenden Test eingesetzt werden kann. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Multiplex-Nukleinsäurenachweises zu beantworten, wie z. B. beim Nachweis gentechnisch veränderter Organismen oder beim Nachweis von GVO. Um die Kapillaren zu reinigen, ziehen Sie eine Laboruniform, eine Schutzbrille und Chemikalienschutzhandschuhe an.

Gib die Kapillaren in ein Becherglas. Reinigen Sie die Kapillaren fünf Minuten lang mit 30 Millilitern Aceton, um organische Stoffe zu entfernen. Waschen Sie dann die Kapillaren mit entionisiertem Wasser.

Bereiten Sie dann die Piranha-Lösung vor, indem Sie etwa zehn Milliliter Wasserstoffperoxid in das Becherglas gießen. Geben Sie dann 30 Milliliter Schwefelsäure unter langsamem Schütteln in das Wasserstoffperoxid, um eine Überhitzung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die Kapillaren mindestens 30 Minuten lang vollständig bedeckt.

Waschen Sie dann die Piranha-Lösung mit einer großen Menge Wasser ab. Waschen Sie die Kapillaren jeweils fünf Minuten lang mit Ethanol und entionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Kapillaren in einem Trockenofen.

Wiegen Sie anschließend PDMS-Basis- und Getriebereagenzien im Verhältnis eins zu eins in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Mischen Sie in der Regel fünf Gramm Elastomerbasis mit fünf Gramm Elastomerhärter. Rühre die Mischung etwa fünf Minuten lang mit einem Glasstab gründlich um.

Das Becherglas mit dem PDMS für dreißig Minuten zum Entgasen in eine Vakuumglocke stellen. Gießen Sie dann das PDMS langsam in den Zylinder der Edelstahlform. Lassen Sie das PDMS drei Stunden lang in einem Trockenschrank bei 60 Grad Celsius aushärten.

Entfernen Sie nach dem Aushärten des PDMS die Form, indem Sie die Form mit Cylindar herausziehen. Entfernen Sie das PDMS vom Zylinder, indem Sie den Rand der Form mit einem Skalpell abschneiden. Waschen Sie PDMS dreimal mit Ethanol und entionisiertem Wasser.

Trocknen Sie dann die PDMS-Halterung mit Stickstoff. Behandeln Sie die untere Oberfläche des PDMS-Trägers so, dass er hydrophob ist, indem Sie den PDMS-Träger eine Sekunde lang in einer superhydrophoben Schicht einweichen. Trocknen Sie es dann zehn Minuten lang bei Raumtemperatur.

Führen Sie als Nächstes die gereinigten vier Millimeter Kapillaren in die Löcher des PDMS-Trägers ein, wobei Nullpunkt fünf Millimeter der Kapillaren außerhalb der oberen Oberfläche des PDMS-Trägers verbleiben. Stellen Sie sicher, dass sich die Enden der Kapillaren auf gleicher Höhe befinden. Um die äußere Oberfläche der Kapillaren und die Oberseite des PDMS-Trägers hydrophob zu behandeln, tragen Sie 15 Mikroliter der superhydrophoben Schicht auf die Oberfläche des PDMS-Trägers auf.

Trocknen Sie das superhydrophobe modifizierte Kapillararray an der Luft. Als nächstes fügen Sie einen Punkt sechs Mikroliter der Primerfixiermischung aus einem Satz Primer hinzu, um eine entsprechende Kapillare des Kapillararrays gemäß einer vordefinierten Reihenfolge zu füllen. Verankern Sie das Array in einer transparenten Vertiefung einer standardmäßigen 96-Well-Platte mit flachem Boden und trocknen Sie das Array mindestens zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius.

Um die Kassette zusammenzubauen, platzieren Sie einen Ladeadapter auf der Oberseite des verankerten Arrays. Stellen Sie sicher, dass die Schale des Adapters nur die freiliegenden Teile aller zehn Kapillaren abdeckt. Zur Herstellung des LAMP-Reaktionsgemisches wird das Gemisch gemäß dem Textprotokoll mit Reagenzien versetzt und das Reaktionsgemisch nach Zugabe von Kalzin fünf Sekunden lang vortexiert.

Drehen Sie das Röhrchen zwanzig Mal vorsichtig um, nachdem die Bst-Polymerase hinzugefügt wurde. DNA-Spuren, die in der Umwelt vorhanden sind, kann eliminiert werden, indem vor der Verabreichung der LAMP-Mischung eine frühere Reinigung mit einem Mol pro Liter Salzsäure durchgeführt wird. Aspirieren Sie 20 Mikroliter des LAMP-Reaktionsgemisches mit einer Standardspitze von 100 Mikrolitern.

Stecken Sie die Spitze in den Einlass des Ladeadapters, um ihn zu verriegeln. Injizieren Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig in die Schale des Adapters. Das Reaktionsgemisch füllt die Schale schnell und lädt dann die Kapillaren automatisch durch Kapillarkraft.

Entfernen Sie den Adapter mit der Verschlussspitze und verschließen Sie die Vertiefung mit einer PCR-kompatiblen transparenten Dichtungsfolie. Inkubieren Sie dann das Kapillararray in einem Inkubator bei 63 Grad Celsius für eine Stunde. Um Bilder der Fluoreszenzemission aufzunehmen, verwenden Sie eine UV-Taschenlampe, um das dissoziierte Kalzin zur Fluoreszenzemission anzuregen.

Nehmen Sie Bilder von der Oberseite des Kapillararrays mit einer Digitalkamera oder einem Smartphone auf. Achten Sie bei der Aufnahme eines Bildes darauf, dass die Kamera so weit wie möglich auf den Bereich der Kapillaren heranzoomt, um qualitativ hochwertige, klare Bilder zu erhalten. Öffnen Sie anschließend das Bild mit einer Bildanalysesoftware.

Wählen Sie dann Bild, Form, Graustufen, Ja und Bild, Form, 16-Bit, Ja aus. Wählen Sie Datei, Speichern unter, Format, TIFF, um das Bild in das 16-Bit-TIFF-Format zu konvertieren. Um den Wert der Fluoreszenzintensität zu extrahieren, öffnen Sie die Microarray-Analysesoftware.

Ziehen Sie das Bild im 16-Bit-TIFF-Format in die Benutzeroberfläche der Software und wählen Sie dann die Wellenlänge von 532 Nanometern und eine grüne Farbe aus, um das Bild anzuzeigen. Erstellen Sie dann einen neuen Block, um das Fluoreszenzsignal aus den Kapillaren zu lokalisieren. Wählen Sie Werkzeuge und neue Blöcke aus, und fügen Sie dann die Anzahl der Spalten und Zeilen als eins-zu-eins und zwei bis fünf in die Blöcke und Funktionsschnittstellen separat ein

Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie das Feature-Modell aus. Passen Sie dann die Position und den Durchmesser an den Fluoreszenzbereich der Kapillaren an. Wählen Sie Analysieren aus, um den Wert der Fluoreszenzintensität zu extrahieren.

Wählen Sie abschließend Datei, Einstellungen speichern unter, um die Dokumente des Blocks zu speichern. Wählen Sie dann aus, archivieren Sie die Ergebnisse und speichern Sie sie, um die Ergebnisse der Fluoreszenzintensität zu speichern. Hier ist das Layout des Kapillararrays dargestellt.

Kapillaren eins bis acht, vorangestellt mit LAMP-Primer-Sets. Die Kapillaren neun und zehn stellen zwei dar, keine Primerkontrollen. Hier ist das Fluoreszenzfoto für den Nachweis von gentechnisch verändertem Mais, MON863, zu sehen, wobei die grüne Farbe die positive LAMP-Verstärkung darstellt.

Erfolgreiche Amplifikation, die nur in den erwarteten Kapillaren eins, sechs, sieben und acht präsentiert wurde, ohne Kontamination zwischen den blinden Kapillaren. Dieses Fluoreszenzfoto dient zum Nachweis des GVO-Gemisches. Die grüne Farbe stellte die positive LAMP-Verstärkung dar.

Eine erfolgreiche Amplifikation zeigte sich nur in den erwarteten Kapillaren eins, vier, fünf, sechs, sieben und acht ohne Kontamination unter den blinden Kapillaren. Das hier gezeigte Fluoreszenzfoto dient zum Nachweis von nicht gentechnisch verändertem Mais, wobei die grüne Farbe die positive LAMP-Amplifikation darstellt. Eine erfolgreiche Amplifikation wurde nur in den erwarteten Kapillar-Acht-Intervallen und ohne Kontamination zwischen den Blindkapillaren präsentiert.

Einmal gemeistert, kann dieses Erkennungsverfahren in einem Punkt von fünf Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine kapillarbasierte Kassette herstellt, um den Nachweis mehrerer Nukleinsäuren durchzuführen.