DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Replikationskarten für das gesamte Genom von Zebrafischembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erstellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in der Zellzyklus- und Chromatinbiologie zu beantworten, z. B. wie Chromatinveränderungen, die während der Embryonalentwicklung auftreten, die Initiierung von DNA-Replikationsgabeln beeinflussen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Replikationsänderungen abbildet, die in vivo in definierten Stadien der Embryonalentwicklung auftreten.

Obwohl diese Methode Aufschluss darüber geben kann, wie sich die DNA-Replikation während der Entwicklung von Zebrafischen verändert, kann sie auch auf andere Systeme oder Modellorganismen wie Manteltiere, Frösche und Fliegen angewendet werden. Im Allgemeinen können Menschen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Übung erfordert, einzellige Suspensionen aus Zebrafischembryonen zu erzeugen. In der Nacht vor der Entnahme der Embryonen setzen Sie Dutzende von erwachsenen Zuchttieren in Zuchtbecken, wobei Sie ungefähr die gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen verwenden.

Verwenden Sie je nach Versuch eine der folgenden Züchtungsstrategien. Für die erste Brutstrategie setzen Sie einige männliche und weibliche Zebrafische in einzelne Aufzuchtbecken und verwenden Sie eine Trennwand, um die Männchen von den Weibchen zu trennen. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, richten Sie viele verschiedene Zuchtbecken ein und legen Sie die Embryonen von jedem zusammen, um sicherzustellen, dass die biologische Variabilität repräsentativ für die Population ist.

Für die zweite Brutstrategie kombinieren Sie Dutzende von männlichen und weiblichen Zebrafischen in einem großen Aufzuchtbecken. Wenden Sie diese Strategie an, solange eine ausreichend große Anzahl von Embryonen vorhanden ist. Es liegt nahe, davon auszugehen, dass sie von einer Vielzahl von Gründern abstammen und daher genetisch repräsentativ für die Bevölkerung sind.

Um zeitgesteuerte Paarungen durchzuführen, beginnen Sie, sobald die Lichtzyklen am Morgen beginnen. Lassen Sie die Fische 10 Minuten lang in flachem Wasser brüten, mit einem doppelten Boden, durch den die Embryonen entweichen können. Entnehmen Sie nach 10 Minuten die Embryonen, indem Sie sie durch ein Sieb gießen und mit einer Waschflasche in eine 10 Zentimeter dicke Platte spülen.

Fassen Sie alle zum gleichen Zeitpunkt entnommenen Embryonen zusammen, markieren Sie sie mit dem Zeitpunkt der Entnahme und legen Sie sie sofort in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius. Um sicherzustellen, dass sich synchron entwickelnde Embryonen entnommen werden, ist es wichtig, dass alle 10 Minuten Embryonenchargen entnommen werden. Dies ist besonders wichtig in den frühesten Stadien der Embryonalentwicklung.

Hunderte von Embryonen können von einem einzigen Paarungspaar an einem Tag erwartet werden. Lassen Sie die erwachsenen Tiere in 10-Minuten-Zyklen brüten, bis die Anzahl der gewonnenen Embryonen weniger als 20 beträgt. Etwa eine bis 1,5 Stunden nach der Entnahme, um die Embryonen zu sortieren, nehmen Sie sie aus dem Inkubator, beobachten Sie sie unter einem Präpariermikroskop und sortieren Sie sie, um tote und unbefruchtete Eizellen zu entfernen.

Zählen Sie die Embryonen und platzieren Sie sie mit einer Dichte von 100 Embryonen pro 10-Zentimeter-Platte. Fügen Sie frisches E3-Medium hinzu und geben Sie die Embryonen zurück in den 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator. Wenn die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, überprüfen Sie das Stadium morphologisch unter einem Lichtmikroskop gemäß den Stadien der Embryonalentwicklung des Zebrafisches.

Wenn die Embryonen 48 hpf oder jünger sind, übertragen Sie bis zu 1500 Embryonen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie mehrmals mit E3. Pro 100 Embryonen einen Milliliter E3 und 20 Mikroliter Pronase-Lösung hinzufügen und vorsichtig schwenken. Bis zu 1500 Embryonen können in einem einzigen Röhrchen mit 15 Millilitern E3 dechorioniert werden. Legen Sie das Röhrchen auf die Seite und ordnen Sie die Embryonen in einer gleichmäßigen Schicht an, um ein maximales Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu gewährleisten.

Rühren Sie das Röhrchen alle zwei bis drei Minuten vorsichtig um, bis alle Chorionen von den Embryonen abgefallen sind. Die Gesamtdechorionierungszeit variiert je nach Pronase-Aktivität. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie die Embryonen mit 10 Millilitern E3 dreimal vorsichtig aus.

Nachdem Sie die Embryonen auf Eis gelegt und das restliche E3 entfernt haben, verwenden Sie zum Waschen der Probe jeweils einen Milliliter frisch zubereiteten, eiskalten Dotterpuffer pro 500 Embryonen. Als nächstes pipettieren Sie die Embryonen mit einem P1000 vorsichtig fünf bis 10 Mal auf und ab, um den Dottersack aufzubrechen. Geben Sie dann einen Milliliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und 500-facher Schwerkraft.

Die Proben müssen gerade kräftig genug pipettiert werden, um eine einzellige Suspension zu erzeugen, ohne dass die Zellen lysiert werden. Dieser Schritt erfordert etwas Übung. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie einen Milliliter eiskaltes 1x PBS, um das Pellet zu waschen und die Ringer-Lösung zu entfernen.

Zentrifugieren Sie die Probe dann erneut. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter 1x PBS. Legen Sie dann das Rohr auf Eis.

Geben Sie drei Milliliter eiskaltes Ethanol in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen mit EtOH vorsichtig auf niedriger Stufe. Mit einem P1000 die Zebrafischembryo-Zellsuspension langsam in das EtOH tropfen, während Sie weiter wirbeln. Fügen Sie insgesamt einen Milliliter der Embryozellsuspension hinzu, um eine endgültige Fixierungslösung von 75 % EtOH zu erhalten.

Nachdem ein Milliliter Zellsuspension hinzugefügt wurde, schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig zum Mischen und legen Sie es mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius auf die Seite, oder lagern Sie die Suspension zwei bis drei Wochen lang im Gefrierschrank. Um embryonale DNA zu färben, zentrifugieren Sie das Röhrchen nach der Entnahme von EtOH-fixierten Embryozellen von minus 20 Grad Celsius fünf Minuten lang bei der 1500-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.

Anschließend werden die Zellen mit einem P1000 in einem Milliliter frisch zubereitetem, kaltem PBS-BSA sanft resuspendiert. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei der 1500-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius und legen Sie die Probe auf Eis. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie für jeweils 1.000 Embryonen 200 Mikroliter Propidiumiodid-Färbelösung hinzu und resuspendieren Sie die Zellen.

Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang in PI-Lösung auf Eis inkubieren und mischen Sie sie alle fünf Minuten vorsichtig. Legen Sie ein 40-Mikrometer-Nylon-Zellsieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Pipettieren Sie dann die Zellen vorsichtig, um die Zelllösung zu mischen und durch das Netz zu filtrieren.

Lösen Sie mit dem flachen, inneren Ende eines Spritzenkolbens vorsichtig alle verbleibenden Zellklumpen auf dem Netz. Verwenden Sie für jeweils 1.000 Embryonen 500 Mikroliter kaltes PBS-BSA, um die Zellen durch den Filter zu spülen. Legen Sie ein 40-Mikrometer-Netz über ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis und filtrieren Sie die Zellsuspension aus dem konischen 50-Milliliter-Röhrchen ein zweites Mal in das 15-Milliliter-Röhrchen.

Stellen Sie schließlich mit einem geeigneten Zellsortiergerät die Laseranregung auf 561 Nanometer und die Emissionsdetektion auf 610 über 20 ein, um Propidiumiodid zu detektieren. Sortieren Sie die Zellen und führen Sie zusätzliche Analysen gemäß dem Textprotokoll durch. Um die Qualität des Read-Mappings zu bestimmen, müssen die Sequenzierungsdaten zunächst mit dem Genom abgeglichen werden, wobei Statistiken von mapQ-Werten verwendet werden.

Darüber hinaus wird die berechnete Leselängenstatistik als Histogramm der Verteilung der Insert-Größen für alle Sequenzier-Reads dargestellt. Dieses spezielle Experiment ergab einen Median von 170 bp. Dieses Balkendiagramm veranschaulicht die Lesestatistiken für die Gesamtzahl der zugeordneten Lesevorgänge, die Lesevorgänge mit einem Flag von geringer Qualität, Lesevorgänge mit Paaren, die einem anderen Chromosom zugeordnet sind, Lesevorgänge mit einem Paar jenseits der Entfernungsschwelle und PCR-Duplikate.

Hier sind repräsentative Zahlen der gesamten kartierten, nicht zugeordneten und ungepaarten Lesevorgänge, der Abdeckung und der Leseauflösung für einen typischen Sequenzierungslauf einer Zebrafischprobe aufgeführt. Nach dem Filtern werden die Lesezahlen in Fenstern variabler Größe bestimmt und die Daten werden geglättet und normalisiert. Typische geglättete und normalisierte Replikationszeitprofile eines repräsentativen Zebrafischchromosoms für biologische Replikate sind hier dargestellt.

Die Profile für biologische und experimentelle Replikate sollten sehr ähnlich sein und auch eine hohe Korrelation entlang der Länge des Chromosoms aufweisen. Die Profile sollten auch eine hohe Korrelation zwischen den Timing-Werten im gesamten Genom aufweisen. Die Farbkarte stellt den Korrelationskoeffizienten von Pearson dar.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es am wichtigsten, daran zu denken, dass synchron entwickelte Embryonen entnommen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. Morpholino-Injektionen oder CRISPR-Cas9-Mutagenese, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. durch welche Mechanismen die DNA-Replikation mit anderen Entwicklungsprozessen koordiniert wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man in bestimmten Stadien des Zellzyklus Zellen von sich synchron entwickelnden Zebrafischembryonen sammelt.

Die Entnahme dieser Proben ist entscheidend für die Erstellung von DNA-Replikationskarten für das gesamte Genom.