Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, im Zebrafisch schnell nach verschiedenen Genotypen, Mutationen oder Transgenen zu suchen. Dies wird erreicht, indem zuerst DNA aus dünnen Clips extrahiert und dann die DNA durch PCR amplifiziert wird. Der nächste Schritt ist die Denaturierung der PCR-Amplikons bei gleichzeitiger Aufzeichnung der Schmelzkurven, die per Software analysiert werden.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse unterscheidbare Schmelzkurven für verschiedene Genotypen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Gelelektrophorese-Volumen-PCR besteht darin, dass sie empfindlich auf Einzelnukleotidänderungen, kleine Insertionen und alle Deletionen reagiert und schnell und zuverlässig ist. Obwohl diese Technik verwendet werden kann, um Zebrafische schnell und effektiv zu genotypisieren, kann sie auch auf andere Systeme und Modellorganismen angewendet werden, einschließlich Zelllinien, Mäuse und andere Tiere.

Am Tag der DNA-Aufbereitung wird dem Lysepuffer frische Proteinase K in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter zugesetzt. Gewebe kann von einem erwachsenen Fisch mit einem dünnen Clip oder von einem embryonalen Fisch entnommen werden. Betäuben Sie den Fisch zuerst in Trica-Lösung.

Warten Sie, bis sich die Kiemenbewegungen verlangsamen. Dann legst du den Fisch auf einen Stapel Taschentücher und schneidest mit einer sterilen Rasierklinge ein kleines, etwa zwei bis drei Millimeter langes Stück der Schwanzflosse ab. Setzen Sie den Fisch schnell in ein beschriftetes Aquarium mit frischem Wasser, um sich zu erholen.

Nehmen Sie den Flossenclip mit einer sterilen Pipettenspitze auf und geben Sie ihn in ein Röhrchen, das mit 100 Mikrolitern DNA-Lysepuffer gefüllt ist. Achten Sie darauf, sowohl das Aquarium des Tieres als auch das Röhrchen zu beschriften, inkubieren Sie alle gesammelten Gewebe mindestens vier Stunden lang und bis über Nacht bei 55 Grad Celsius nach der Inkubation. Inaktivieren Sie das Protein ACE K, indem Sie die Röhrchen 15 Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen.

Diese Proben sollten sofort für die PCR verwendet werden, können aber auch bis zu drei Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Führen Sie die PCR für jede Reaktion in einer 96- oder 384-Well-Platte durch. Kombinieren Sie nicht mehr als einen Mikroliter der erwachsenen DNA mit vier Mikrolitern Lichtscanner.

Mastermix bestehend aus der Fluoreszenzsonde und den Primern in einer Endkonzentration von jeweils fünf Picomolaren. Wenn die DNA von einem Embryo stammt, verwenden Sie bis zu drei Mikroliter. Decken Sie die Reaktionen mit 30 Mikrolitern Mineralöl ab und verschließen Sie sie.

Decken Sie anschließend die bestückte PCR-Platte mit einem optisch transparenten Klebesiegel ab. Optimieren Sie nun die Bedingungen für den PCR-Zyklus. Ein typischer Bedingungssatz beginnt mit einer Schmelzzeit von fünf Minuten.

Es folgen 30 PCR-Zyklen mit zehn Sekunden Schmelzen, 25 Sekunden Kniezeit und 30 Sekunden Elongation. Die Reaktion sollte mit einer zugegebenen 32. Schmelze enden und dann auf 15 Grad Celsius abkühlen. Analysieren Sie die PCR-Platte, indem Sie sie in ein Schmelzanalysesystem in der Software einsetzen.

Richten Sie die Temperatur ein und erstellen Sie eine neue Datenspeicherdatei. Richten Sie eine Teilmenge ein. Wählen Sie die Vertiefungen mit den Proben auf der unteren linken Seite des Bildschirms aus.

Wählen Sie die Registerkarte "Normalisiert" aus, um fluoreszierende Varianten zu eliminieren. Positionieren Sie die parallele Doppellinie manuell im Prem-, Melt- und Post-Melt-Bereich und normalisieren Sie die Premel- und Post-Melt-Fluoreszenzsignale aller Proben auf eins bzw. null. Unterscheiden Sie als Nächstes die Genotypen anhand ihrer Schmelztemperatur, indem Sie zunächst die Gruppierung auswählen.

Wählen Sie dann die Option Automatische Gruppe aus der Standardauswahlliste aus. Wählen Sie im Abschnitt Gruppierung die Option "Normal" oder "Hoch" für Schmelzprofile mit einzelnen Übergängen bzw. mehreren Übergängen aus. Sie befinden sich in der Auswahlliste für die Vertraulichkeit im Abschnitt Gruppierung.

Wählen Sie nun im Abschnitt Gruppierung die Option Computegruppen aus, gehen Sie dann zum Dateimenü und klicken Sie auf Speichern, um die Ergebnisse zu speichern. Das Protokoll kann an einem einzigen Tag oder in Schritten über mehrere Tage hinweg durchgeführt werden. Bei der PCR hängen die Temperaturen für die Schmelze des Amplikons von der Größe und dem GC-Gehalt ab, aber im Allgemeinen sind Start- und Endtemperaturen von 60 Grad Celsius und 95 Grad Celsius angemessen, sobald die Schmelze durchgeführt wurde.

Analyse der fluoreszierenden Schmelzkurven erfordert in der Regel eine Normalisierung der Variation der verschiedenen Probenkurven unter Verwendung von Vor- und Nachschmelzbereichen als Standards. Dies verbessert den Vergleich von Ergebnissen aus verschiedenen Proben, bei denen die Variation der Fluoreszenz mit geringfügigen experimentellen Variationen zusammenhängt. Jedes Paar von Temperaturlinien für die Normalisierung sollte etwa ein Grad Celsius voneinander entfernt sein.

Die Daten können auf zwei Arten dargestellt werden: durch ein Diagramm, das die Dateien mit den Schmelzkurvenprofilen zeigt, oder durch ein Diagramm, das ein subtraktives Differenzdiagramm im Vergleich zu einer Referenzprobe nach HRMA-Analyse zeigt: Mutationen oder Transgene können nachgewiesen werden. Zwei verschiedene Mutationen im EIF-Zwei-B-Fünf-Gen sind durch die rote und die blaue Kurve gekennzeichnet. Diese mutierten Proben werden durch ihren signifikanten Unterschied in ihrer Schmelzkurve, ihren Formen oder ihrer Fluoreszenzänderung im Vergleich zu den Standard-Wildtyp-Kurven identifiziert.

Dieses Beispiel von vier verschiedenen Genotypen in einer einzigen Embryonensammlung veranschaulicht die Leistungsfähigkeit und Empfindlichkeit der Methode. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als acht Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie HRMA für ein effizientes groß angelegtes Screening von Zebrafisch-Genotypen durchführen können.