Name: Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Lernen Sie die schnelle Zebrafisch-Genotypisierung mit PCR und hochauflösender Schmelzanalyse. Diese Methode ermöglicht effizientes Screening von Mutationen und Transgenen in Danio rerio.

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Wir danken Mitglieder der Blaschke, Grunwald, Wittwer und Labors für die Beratung und technische Unterstützung. Diese Arbeit wird von der Stiftung PCMC, NIH R01 MH092256 und DP2 MH100008 und der March of Dimes Foundation Forschungsstipendium # 1-FY13-425, bis JLB unterstützt.

1. DNA-Präparation <ol><li> Vorbereitung DNA Lysepuffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Frisches Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml am Tag der Verwendung 12. </li><li> Tissue Sammlung: <ol><li> Für erwachsene Fischflosse Clip: <ol><li> Anesthetize Fisch: Den Fisch in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie, bis Kiemenbewegung verlangsamt. </li><li> Setzen Sie Fisch auf einem Stapel von 5-10 Kimwipes und schneiden Sie ein kleines Stück der Schwanzflosse, ca. 2-3 mm, mit einer sterilen Rasierklinge. </li><li> Schnell stellen die Fische in einem markierten Tank mit Frischwasser für die Wiederherstellung, sorgfältig beschriftet sowohl den Tank und Schlauch, der den entsprechenden fin Clip enthalten wird. Wechseln Sie das Wasser und die Fische füttern jeden zweiten Tag. </li><li> Nehmen Sie den Fin-Clip mit einer sterilen Pipettenspitze und übertragen sie in ein Rohr mit 100 ul DNA-Lyse-Puffer gefüllt. </li><li> Entsorgen Sie die Pipettenspitze, und entsorgen Sie die Rasierklinge in einen Behälter für scharfe Gegenstände. </li></ol></li><li> Für Embryo Schwanz-Clip: <ol><li> Zeigen Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie 2 min. </li><li> Schneiden Sie ein Stück Schwanz mit einer Pinzette unter einem Binokular. </li><li> Setzen Sie den Schwanz in ein beschriftetes Röhrchen mit 30 ul DNA-Lyse-Puffer gefüllt. </li><li> Setzen schnell den Embryo in ein Röhrchen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd. </li><li> Beschriften Sie die Röhrchen mit Embryonen und ihre entsprechenden Endrohre. </li><li> Die Röhrchen mit Embryonen bei 4 ° C über Nacht zur Fixierung. </li><li> Reinigen Sie die Zange mit Milli-Q-Wasser und Kimwipes zwischen jedem Embryo auf Kontamination zu minimieren. </li></ol></li><li> Für ganze Embryonen: <ol><li> Zeigen Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie 2 min. </li><li> Setz 1-5 Embryonen in einem Rohr mit 100 ul DNA-Lysepuffer gefüllt. Dechorionation ist nicht erforderlich. </li></ol></li></ol></li><li> DNA-Verdau Rohre mit Gewebe (fin oder Schwanz Clips oder Embryonen), bei 55 ° C inkubieren4 Stunden bis zu 12 über Nacht. </li><li> Inaktivierung der Proteinase K Wärmerohren auf 95 ° C für 15 min 12. DNA für die PCR sollte sofort verwendet werden oder bei -20 ° C für 3 Monate gelagert. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Design-Primer entweder manuell oder durch Primer-Design-Software (zB Lightscanner Primer-Design-Software-Biofire). PCR-Produkte sind in der Regel für HRMA 50-200 bp, PCR-Produkte für die SNP-Nachweis sollte kleiner sein, in der Regel 50-80 bp. </li><li> PCR <ol><li> Führen Sie die PCR-Reaktion in einem 96-Well oder 384-Well-Platte. </li><li> Verwenden Sie 10 ul Volumen: 4 ul LightScanner Master-Mix (0,1 U Hot-Start Taq-AB-Polymerase, Puffer, 0,2 mM dNTPs, 2 mM Magnesiumchlorid und 1x Leuchtstoffdoppelstrang-DNA-bindenden Farbstoff), 5 pmol von jedem Primer, und 1 ul genomische DNA-Vorlage aus adulten Schwanzflosse oder 3 ul genomischer DNA aus embryonalen Schwanz 13 extrahiert. </li><li> Titel Proben mit 30 ul Mineralöl. </li&gt; <li> Die Platte mit einem optisch transparenten Klebesiegel. </li><li> Optimierung der PCR-Zyklusbedingungen sind typische Bedingungen 95 ° C für 5 min und 30 Zyklen von 10 s bei 95 ° C, 25 sec bei 60 ° C, 30 sec bei 72 ° C, endend mit 95 ° C für 30 sec und gekühlt 15 ° C. </li><li> Speicher PCR-Platten bei 4 ° C oder direkt weiter HRMA. </li><li> Bestätigen unsere PCR-Produkt durch Analyse seiner Größe unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese bei der ersten Optimierung der PCR, und, wenn angegeben, durch Sequenzierung des PCR-Produkts. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> Wärmeplatten <ol><li> Zeigen Platte in einem Schmelzanalyse-System. </li><li> Öffnen Sie die Software (Software LightScanner Call-IT 2.0). </li><li> Wärmeplatten von 60 bis 95 ° C </li><li> Erstellen Sie einen neuen Datenspeicher-Datei. </li></ol></li><li> Analysieren HRMA Daten (Abbildung 2). Mehrere Analyseschritte möglich sind. Wir zeigen die am häufigsten verwendeten Satz von Daten manipulations. <ol><li> Subset-Einstellung Klicken Sie auf Subset-Registerkarte. Wählen Sie die Vertiefungen mit Proben. </li><li> Normalisierung <ol><li> Wählen Sie die Registerkarte Normalisieren in der linken Panel. Um Fluoreszenz Varianz zu beseitigen, manuell positionieren Sie den parallelen Doppellinie in der Vor-(initial) und Post (final) Schmelz Regionen dargestellt (2C, Pfeilspitzen) und normalisieren Vorschmelze und Post-Schmelze Fluoreszenzsignale aller Proben 1 und 0 bzw. 14. </li><li> Einstellen der Positionierung der Leitungen, so daß der Schmelzbereich in dem Bereich zwischen den Pre-und Post-Schmelzeleitungen, aber nicht ausgewählt. Im Allgemeinen ist die Nieder Min-und Max Nieder (und Ober Min-und Max Ober) Temperaturleitungen sollten getrennt aufgestellt werden, etwa 1 ° C. </li><li> Wählen Temperatur Positionen für die Normalisierung, so dass alle Proben Maximum oder voll (100%) für die Fluoreszenz Vorschmelze Region und minimale oder gar keine (0%) Fluoreszenz für die Post-Schmelzbereich (am besten wie möglichlich). Die Normalisierung sollte in einer nahezu horizontalen Linie bei der maximalen Fluoreszenz von 1, die bis zum Schmelzpunkt und dann eine nahezu horizontale Linie aus der Schmelze Punkt bei der minimalen Fluoreszenz von 0 erstreckt sich führen, es sollte nicht Fluoreszenzwerte über 1 oder unter 0 sein . Beispielsweise in Fig. 2C, normalisieren die Vorschmelztemperatur Kurven mit Temperaturbereichen von 79-80 ° C. </li></ol></li><li> Gruppierung / Clustering Unterscheiden Genotypen basierend auf ihren Schmelztemperatur (2C, grün Kasten). Wählen Sie Gruppierung. <ol><li> Wählen Sie aus dem Autogroup Standards Auswahlliste unter dem Abschnitt Gruppierung. </li><li> Wählen Sie Normal oder Hoch zum Schmelzen Profile mit einzelnen Übergänge oder mehrere Übergänge jeweils von der Empfindlichkeit Auswahlliste unter dem Abschnitt Gruppierung. </li><li> Wählen ComputeGruppen unter der Gruppierung Abschnitt. </li><li> Gehen Sie auf das Menü Datei und klicken Sie auf Speichern, um die Ergebnisse zu speichern. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

PCR in Kombination mit HRMA ist eine leistungsstarke Technologie für die Zebrafisch-Genotypisierung. Die Vorteile dieses Ansatzes sind seine Geschwindigkeit, Robustheit und Empfindlichkeit, auch Punktmutationen. Das gesamte Protokoll, aus fin-Clip zum Schmelzkurvenanalyse kann in weniger als acht Stunden von einer einzelnen Person durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Technik zugänglich für Hochdurchsatz-Screening, die Verwendung von Ethidiumbromid nicht erforderlich, und wird für alle PCR und Analyseschritte die ...

Zebrafisch (Danio rerio), ein Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der weithin Entwicklung und Krankheit Modellierung verwendet. Kürzlich wurden zahlreiche transgenen und Mutationstechniken für Zebrafisch entwickelt. Rapid-Techniken Transgenese, in der Regel auf einem Tol2 Transposonsystem 1 basiert, haben mit verbesserten Klonen Optionen für mehrere DNA-Fragment Anordnung 2 zusammengefasst. Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) verwendet worden, um Loci in beiden somatischen und Keimbahnzellen im Zebrafisch 3,4 Ziel. Diese Techniken können effizient genetisch veränderte Tiere zu erzeugen, mit Hochfrequenz-Mutation Erstellung und Keimbahn-Übertragung 3,4. Trotz dieser Fortschritte, traditionelle Techniken, Genotypisierung im Zebrafisch begrenzen die volle Leistung der Mutagenese und Transgenese-Tools. PCR, gefolgt von Gelelektrophorese, manchmal kombiniert mit EINSCHRÄNKn Enzymverdauung, wird häufig zur Modifikation Genom nachzuweisen, ist jedoch zeitaufwendig und weniger empfindlich gegenüber kleinen Insertionen oder Deletionen zu identifizieren. TaqMan-Sondentests haben eine hohe Anfangskosten und erfordern eine sorgfältige Optimierung. Die Sequenzierung von PCR-Produkten kann mehrere Tage dauern und ist nicht praktisch für große Screening. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse kann nur unterscheiden SNPs mit Auswirkungen auf eine begrenzte Anzahl von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen. Hochauflösende Schmelzanalyse (HRMA), eine geschlossene Röhre Post-PCR-Analyseverfahren, ist eine kürzlich entwickelte Methode, die schnell, empfindlich, kostengünstig und zugänglich Screening einer großen Anzahl von Proben. HRMA kann verwendet werden, um SNPs, Mutationen und Transgene 5-7 zu erkennen. HRMA auf die thermische Denaturierung von doppelsträngigen DNAs basiert, und jedes PCR-Amplicon eine eindeutige Dissoziation (Schmelze) Kennlinie 5. Die Proben unterschieden werden durch to ihrer unterschiedlichen Nukleotid-Zusammensetzung, GC-Gehalt, oder Länge, in der Regel in Kombination mit einem Fluoreszenz-Farbstoff bindet, die nur doppelsträngige DNA-8. Somit kann HRMA verschiedenen Genotypen basierend auf den unterschiedlichen Schmelzkurvencharakteristika unterscheiden. Da HRMA verwendet Low-Cost-Reagenzien und ist eine Einzelschritt-Post-PCR-Verfahren, kann es für Hochdurchsatz-Strategien verwendet werden. HRMA ist nicht destruktiv, so dass folgende Analyse die PCR-Produkte auch für andere Anwendungen verwendet werden. HRMA in vielen Organismen und Systeme, einschließlich Zelllinien, Mäusen und Menschen 9-11 angewandt. Sein Einsatz hat kürzlich im Zebrafisch beschrieben worden, um Mutationen, die durch Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Talens 6,12,13 induziert wird. In diesem Papier beschreiben wir, wie man auf PCR-Basis HRMA in embryonalen und adulten Zebrafisch (Abbildung 1) durchzuführen. Dieses Protokoll ist für die Detektion von SNPs, Transgene, und Mutationen, einschließlich single Basenpaar-Veränderungen, Insertionen oder Deletionen.

<table><tbody><tr><td>100 Reaktionen LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Hartschalen-PCR 96-Well-BLK/WHT-Platten</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Klebedichtungen</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>96-Well-LightScanner Instrument</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Software mit Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Hochauflösende Schmelzanalyse 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Primer Design Software</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI Software</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle und effiziente verwendung von zebrafisch-genotypisierung pcr mit hochauflösende schmelzanalyse

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung, Modellierung Krankheit und Arzneimittel-Screening durchführen. Kürzlich wurde eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen eingeführt, darunter mehrere Strategien zur Induktion von Mutationen und zur Erzeugung transgener Linien. Jedoch wird großen Screening durch Genotypisierung traditionellen Methoden, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind begrenzt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Zebrafisch-Genotypen durch PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) zu analysieren. Dieser Ansatz ist eine schnelle, empfindliche und preiswert, mit einem geringeren Risiko der Kontamination Artefakte. Genotypisierung mittels PCR mit HRMA für Embryonen oder ausgewachsene Fische verwendet werden, auch im Hochdurchsatz-Screening-Protokolle.

Das Protokoll kann an einem einzigen Tag über mehrere Tage durchgeführt wird oder in Stufen getrennt (Flußdiagramm der Arbeit ist in Fig. 1 gezeigt). Die DNA-Extraktion wird durch die Schmelze und Analyse von PCR-Amplikons, gefolgt. Die Temperaturen für die Schmelze des Amplikons sind abhängig von der Größe und der GC-Gehalt, aber in der Regel Anfang und Ende Temperaturen von 50 ˚ C und 95 ˚ C falls (2A und 2B) sind. Sobald die Schmelze durchgeführt wird, die Analyse de...

PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, verschiedene Genotypen, Mutationen oder Transgene bei Zebrafischen schnell zu screenen. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA aus kleinen Gewebeproben extrahiert und anschließend mittels PCR amplifiziert wird. Im nächsten Schritt werden die PCR-Amplicons denaturiert, während die Schmelzkurven aufgezeichnet und anschließend von einer Software analysiert werden. Letztlich zeigen die Ergebnisse unterscheidbare Schmelzkurven für verschiedene Genotypen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Gelelektrophorese von PCR-Volumina liegt darin, dass sie empfindlich gegenüber Einzelnukleotid-Änderungen, kleinen Insertionen und Deletionen ist, und dass diese Technik schnell und zuverlässig ist. Obwohl diese Technik verwendet werden kann, um Zebrafische schnell und effektiv zu genotypisieren, ist sie ebenfalls auf andere Systeme und Modellorganismen anwendbar, einschließlich Zelllinien, Mäuse und andere Tiere.Am Tag der DNA-Präparation frisches Proteinase K der Lysepufferlösung in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Das Gewebe kann von einem adulten Fisch mittels eines dünnen

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

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Biologie

Dieser Artikel beschreibt die DNA-Extraktion aus dem Zebrafisch-Schwanzclip. Das Protokoll demonstriert eine schnelle und effiziente Methode zur Analyse von Zebrafisch-Genotypen.

DNA-Extraktion aus dem Schwanzclip: eine Methode zur Genotypisierung von Zebrafischen

In diesem Video beschreiben wir eine hochauflösende Schmelz-PCR-Technik zur Bestimmung des Längenpolymorphismus von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Sequenzlängen, basierend auf einer Schmelztemperaturanalyse.

Hochauflösende Schmelz-PCR zur Bestimmung von Sequenzvariationen in mutierten DNA-Sequenzen

Während eine hohe Auflösung Schmelzanalyse bietet die Möglichkeit, zwischen den Single Nucleotide Polymorphismen in einer heterogenen Population zu unterscheiden, können mutante Allel amplification bias seine Fähigkeit, bei relativ niedrigen Prozentsätzen in einer Probe vorhandenen Allele detektieren erhöhen. Dieses Protokoll beschreibt Verbesserungen, die die Empfindlichkeit der hochauflösende Schmelzanalyse zu verbessern.

Methoden, um die Sensitivität der High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotypisierung in Malaria erhöhen

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Gen-Editing-Technologien haben es Forschern ermöglicht, Zebrafischmutanten zu generieren, um die Genfunktion relativ einfach zu untersuchen. Hier bieten wir einen Leitfaden zur parallelen Embryo-Genotypisierung und Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungssignalen in Zebrafischen. Dieser unvoreingenommene Ansatz bietet eine höhere Genauigkeit bei phäotypischen Analysen auf der Grundlage der In-situ-Hybridisierung.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Lernen Sie die schnelle Zebrafisch-Genotypisierung mit PCR und hochauflösender Schmelzanalyse. Diese Methode ermöglicht effizientes Screening von Mutationen und Transgenen in Danio rerio.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

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