Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genauigkeit der Chromosomensegregation während der Mitose in einem lebenden Zebrafischembryo mithilfe fluoreszenzmarkierter Chromatin- und Zellmembranproteine zu überwachen, die mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie erfasst werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mitose zu beantworten, beispielsweise wie mitotische Defekte zu Entwicklungsstörungen oder Tumorbildung in einem lebenden Wirbeltierorganismus führen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus beobachtet wird, wodurch physiologisch relevante Daten gewonnen werden können.

Nach der Züchtung erwachsener Zebrafische und der Injektion von Eiern mit H2A.F/Z-EGFP und/oder pCS2 mCherry-CAAX-RNA identifizieren Sie etwa zwei Stunden vor der Bildaufnahme mithilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskops GFP-positive Embryonen. Übertragen Sie stark grün leuchtende, GFP-exprimierende Embryonen in eine neue Petrischale mit den Maßen 100 mal 15 Millimeter, die mit E3-Blau-Medium gefüllt ist.

Kochen Sie eine Stammlösung mit 1 % Low-Melt-Agarose in E3-Blau. Portionieren Sie drei Milliliter der geschmolzenen Agarose in ein Kulturrohr mit den Maßen 17 mal 100 Millimeter. Halten Sie die Agarose warm, indem Sie das Kulturrohr bis zur Verwendung in ein Wasserbad mit 42 Grad Celsius stellen.

Sammeln Sie 15-Millimolar-Tricain, selektierte Embryonen, Low-Melt-Agarose, E3-Blau und eine 35-Millimeter-Kultur-Schale mit Deckglasboden sowie ein Stereomikroskop. Entfernen Sie anschließend mit Pinzette Nummer fünf vorsichtig die Chorionhüllen von drei Embryonen und legen Sie die Embryonen in einen separaten Behälter zur Anästhesie. Geben Sie danach mit einer Transferpipette drei Tropfen 15-Millimolar-Tricain in die Schale, die die Embryonen und fünf Milliliter Medium enthält.

Geben Sie drei bis vier Tropfen einer 15-millimolaren Tricain-Lösung zu dem Gefäß mit 1% geschmolzenem Agarose hinzu. Sobald die Embryonen ausreichend anästhesiert sind, überführen Sie die anästhesierten Embryonen mit einer P200-Pipette, bei der ein Zentimeter der Pipettenspitze abgeschnitten wurde, auf die mit Deckgläsern ausgekleidete Schale. Entfernen Sie überschüssige Mengen an der E3-blauen Tricain-Lösung.

Fügen Sie langsam fünf bis 10 Mikroliter der Low-Melt-Agarose-Tricain-Lösung über den Embryonen hinzu, wobei jeder Tropfen getrennt bleiben sollte, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht zueinander wandern. Drehen Sie die Embryonen anschließend mit einer 21-Gauge-ein-und-ein-halb-Nadel vorsichtig in der Agarose in die gewünschte Position, wobei der interessierende Bereich, falls ein invertiertes Mikroskop verwendet wird, so nah wie möglich an der Deckglasoberfläche ausgerichtet werden sollte. Aufgrund möglicher Verschiebungen kann es erforderlich sein, zu jedem Embryo erneut zurückzukehren, um sicherzustellen, dass er in der erforderlichen Position verbleibt.

Dieser Vorgang muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, bis die ideale Position erreicht ist, während das Agar erstarrt. Nach einigen Minuten, um zu überprüfen, ob es fest ist, verwenden Sie eine Nadel, um ein kleines Stück Agarose aufzubrechen. Wenn es sich von dem Tropfen lösen lässt, verwenden Sie zusätzliche Low-Melt-Agarose, um eine Kalotte über die eingebetteten Embryonen zu bilden, die die gesamte Deckglasabdeckung bedeckt.

Während sich das Agarose verfestigt, bereiten Sie drei Milliliter E3-Blaumedium mit fünf Tropfen 15-millimolarer Tricainlösung vor, das während der Bildgebung über die eingebetteten Embryonen gegeben wird. Um eine 5D-Konfokalbildgebung lebender Zebrafisch-Embryonen durchzuführen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und stellen das Mikroskop auf ein 60X-Objektiv mit numerischer Apertur 1,4 ein. Geben Sie Immersionsöl auf das Objektiv und platzieren Sie die Kulturschale im Objektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch.

Positionieren Sie mit dem Achsenregler das gewünschte Embryo über der Objektivlinse und heben Sie die Linse an, bis sie die Kulturschale erreicht. Gießen Sie die E3-blaue Lösung mit Tricain über die in Agar eingebetteten Embryonen. Klicken Sie anschließend auf das Augenport-Symbol, um die Embryonen durch das Okular zu betrachten.

Deaktivieren Sie die Augenport-Auswahl und wählen Sie Ansicht, Aufnahme-Steuerungen, A1-Scan-Bereich, um das Werkzeug für den A1-Scan-Bereich zu öffnen. Wählen Sie den GFP-Kanal aus, starten Sie den Scan neu und fokussieren Sie auf einen interessierenden Bereich in der Nähe des Deckglases. Beenden Sie den Scan, wählen Sie die GFP- und mCherry-Kanäle aus und stellen Sie die Zeilenmittelungs-Option auf normal.

Wählen Sie nun Ansicht, Aufnahmesteuerung, ND-Aufnahme, um das ND-Aufnahmewerkzeug A1 zu öffnen. Beginnen Sie mit der Abtastung. Positionieren Sie dann mithilfe des Achsencontrollers die Embryonen so, dass der Scan-Bereich so weit wie möglich mit dem Zebrafisch ausgefüllt wird.

Stellen Sie die obere Grenze des Z-Stapels dort ein, wo die Zellen außerhalb der Fokusebene liegen, und berücksichtigen Sie zusätzlich einen Freiraum von drei Mikrometern über der Probe für Wachstum und Zellbewegung. Danach setzen Sie die untere Grenze dorthin, wo die Zellen nicht mehr sichtbar sind, und legen Sie die Z-Intervall-Schrittweite auf zwei Mikrometer fest. Für die hier dargestellten Experimente stellen Sie jeweils die Leistung des Abbildungslasers, die HV- oder Verstärkungseinstellung sowie die Offset-Werte wie unten aufgeführt ein.

Wenn die Parameter eingestellt sind, schalten Sie den Scanvorgang ab, um eine unnötige Laserexposition zu verhindern, die Phototoxizität und Photobleaching der Probe verursachen könnte. Wählen Sie nun das Symbol für die 2-fache Zeilenmittelung aus, das die beste Bildqualität und die schnellste Scanzeit bietet. Wählen Sie das für das Experiment erforderliche Zeitintervall und die erforderliche Versuchszeitdauer aus.

Für die Zellteilungen des Wildtyps sind Zwei-Minuten-Zeitintervalle über einen Zeitraum von zwei Stunden ausreichend, um die Mitosedauer zu bestimmen. Für Teilungen, die die Spindelkontrollpunktkontrolle länger als dreißig Minuten aktivieren, eignen sich Vier-bis-Fünf-Minuten-Intervalle über vier Stunden besser, um die Fluoreszenz zu schonen, wie hier gezeigt. Um die Datei automatisch während der Aufnahme zu speichern, aktivieren Sie das Kontrollkästchen „In Datei speichern“ und benennen Sie die Datei.

Überprüfen Sie abschließend, ob alle Parameter korrekt eingestellt sind, und klicken Sie auf „Jetzt ausführen“. Nach Abschluss der Aufnahme klicken Sie auf das Symbol „Volumenschwelle“, um die Datei im dreidimensionalen Format anzuzeigen. Diese Abbildung zeigt die Möglichkeit, zahlreiche Zellteilungen mithilfe eines weiten Sichtfelds am Schwanz eines AB-Wildtyp-Zebrafischs zu beobachten.

Die Zellteilungen sind mit Sternchen markiert. Der entsprechende Film wird hier gezeigt. Im Durchschnitt wurden 50 teilende Zellen in AB und 30 teilende Zellen im Aurora-B-Mutanten beobachtet.

Um die geringere Anzahl an in der Aurora-B-Mutante beobachteten mitotischen Zellen zu berücksichtigen, wurde das Verhältnis der mitotischen Zellen zur Gesamtanzahl der beobachteten Zellen berechnet. Dies deutet darauf hin, dass nicht weniger Zellen die Mitose durchlaufen, sondern dass insgesamt weniger Zellen abgebildet werden. Zur Quantifizierung der Mitosedauer wird die Anzahl der Zeitintervalle, die eine Zellteilung umfassen, mit dem Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stacks multipliziert. Wie in diesem Diagramm gezeigt, beträgt die durchschnittliche Teilungszeit der AB-Wildtyp-Zelle 25 Minuten und 58 Minuten in der Aurora-B-Mutante.

Wie bei Wildtyp-Embryonen kann jede mitotische Phase unterschieden werden. Bei dem Aurora B-Mutanten-Embryo treten jedoch mitotische Defekte auf, die eine mitotische Arrestierung und eine fehlgeschlagene Zytokinese umfassen, was zu einer binukleären Zelle führt, sowie zur anschließenden Bildung von Mikrokernen, was die bei diesem Mutanten gemessene verlängerte Teilungsdauer unterstützt. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Stunde durchgeführt werden – von der Untersuchung der Embryonen bis zur Einstellung der Parameter am konfokalen Mikroskop.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den experimentellen Kontext zu berücksichtigen, insbesondere hinsichtlich des interessierenden Bereichs, der Beobachtungsdauer, des Zeitintervalls und der Z-Tiefe. Dies trägt zur Maximierung der Effizienz bei und hilft, Photobleaching sowie Phototoxizität zu vermeiden. Nach Abschluss dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Chromosomenausstriche angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Ursachen beobachteter Mitosestörungen zu klären, oder es kann eine Behandlung mit Wirkstoffen erfolgen, um deren Auswirkungen auf den Verlauf, die Dauer der Mitose oder das Zellschicksal zu untersuchen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biologie den Weg, um die Mitose im Kontext der Entwicklungs- und Krebsbiologie unter Verwendung von Zebrafischen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafischembryonen einbettet, Live-Bildaufnahmen der Mitose erstellt und die Häufigkeit, Dauer und Zellgeschicke der Mitose analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit leistungsstarken Lasern und fluoreszierendem Licht schädlich für die Augen sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Vermeiden von direktem Augenkontakt mit den Lasern sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.