Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genauigkeit der Chromosomensegregation während der Mitose in einem lebenden Zebrafischembryo zu überwachen, indem fluoreszenzmarkiertes Chromatin und Zellmembranproteine verwendet werden, die mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie erfasst werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mitose zu beantworten, z. B. wie Mitosedefekte zu einem Entwicklungsdefekt führen oder Tumorbildung in einem lebenden Wirbeltierorganismus? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus beobachten, die es ermöglicht, phsyiologisch relevante Daten zu sammeln.

Nach der Zucht adulter Zebrafische und der Injektion von Eiern mit H2A. F/Z-EGFP und/oder pCS2 mCherry-CAAX RNA, etwa zwei Stunden vor der Bildgebung, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um GFP-positive Embryonen zu identifizieren. Übertragen Sie hellgrüne, GFP-exprimierende Embryonen in eine neue, 100 x 15 Millimeter große Petrischale mit blauem E3-Medium.

Kochen Sie eine Stammlösung aus 1%iger Low-Melt-Agarose in E3-Blau. Aliquotieren Sie drei Milliliter der geschmolzenen Agarose in ein 17 mal 100 Millimeter großes Kulturröhrchen. Halten Sie die Agarose warm, indem Sie das Kulturröhrchen bis zur Verwendung in ein 42 Grad heißes Wasserbad legen.

Sammeln Sie 15 Millimolare Tricain, gescreente Embryonen, niedrigschmelzende Agarose, E3-Blau und eine 35-Millimeter-Kulturschale aus Glas mit Deckglasboden sowie ein Präparierlichtmikroskop. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette Nummer fünf vorsichtig die Chorionen von drei Embryonen und legen Sie die Embryonen zur Betäubung in einen separaten Behälter. Geben Sie dann mit einer Transferpipette drei Tropfen 15-Millimolares Tricain in die Schale, die die Embryonen und fünf Milliliter Medium enthält.

Geben Sie drei bis vier Tropfen 15-millimolare Tricainlösung in das Röhrchen mit 1% geschmolzener Agarose. Wenn die Embryonen ausreichend betäubt sind, werden die betäubten Embryonen mit einem Pipetman P200 und einem Zentimeter der Pipettenspitze abgeschnitten und in die Schale mit Deckglas übertragen. Entfernen Sie überschüssige E3-Blue-Tricain-Lösung.

Geben Sie langsam fünf bis 10 Mikroliter niedrigschmelzende Agarose-Tricain-Lösung über die Embryonen und halten Sie jeden Tropfen getrennt, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht nahe beieinander driften. Richten Sie dann mit einer 21-Gauge-Eineinhalbnadel die Embryonen in der Agarose vorsichtig in die gewünschte Position aus, wobei Sie den interessierenden Bereich so nah wie möglich am Deckglas ausrichten, wenn Sie ein inverses Mikroskop verwenden. Aufgrund der Verschiebungen, die auftreten können, kann es notwendig sein, zu jedem Embryo zurückzukehren, um sicherzustellen, dass er in der gewünschten Position bleibt.

Dies muss möglicherweise mehrmals durchgeführt werden, bis die ideale Position erreicht ist, wenn der Agar erstarrt. Um nach ein paar Minuten zu testen, ob es fest ist, brechen Sie mit einer Nadel ein kleines Stück Agarose auseinander. Wenn es vom Tropfen weggezogen werden kann, verwenden Sie zusätzliche niedrigschmelzende Agarose, um eine Kuppel über den eingebetteten Embryonen zu bilden, die das gesamte Deckglas bedeckt.

Während die Agarose erstarrt, bereiten Sie drei Milliliter E3-blaues Medium mit fünf Tropfen 15-millimolaren Tricain vor, die während der Bildgebung über die eingebetteten Embryonen gelegt werden. Um eine konfokale 5D-Bildgebung von lebenden Zebrafischembryonen durchzuführen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und stellen Sie das Mikroskop auf ein Objektiv mit 60-facher numerischer Apertur und 1,4 ein. Tragen Sie Immersionsöl auf die Linse auf und stellen Sie die Kulturschale in den Objektträgerhalter auf den Mikroskoptisch.

Zentrieren Sie den interessierenden Embryo mit dem Achsenregler über der Objektivlinse und heben Sie die Linse an, um auf die Kulturschale zu treffen. Gießen Sie E3-Blau und Tricain-Lösung über die in Agar eingebetteten Embryonen. Klicken Sie anschließend auf das Augenport-Symbol, um Embryonen durch das Okular zu betrachten.

Deaktivieren Sie die Auswahl "Augenport" und wählen Sie "Ansicht", "Aufnahmesteuerung", "A1-Scanbereich", um das Werkzeug "A1-Scanbereich" zu öffnen. Wählen Sie den GFP-Kanal aus, starten Sie den Scan neu und fokussieren Sie sich auf einen interessanten Bereich in der Nähe des Deckglases. Stoppen Sie den Scan, wählen Sie die Kanäle GFP und mCherry aus und stellen Sie die Option für die Mittelwertbildung auf normal ein.

Wählen Sie nun Ansicht, Erfassungssteuerung, ND-Erfassung, um das A1 ND-Erfassungswerkzeug zu öffnen. Beginnen Sie mit dem Scannen. Positionieren Sie dann die Embryonen mit dem Achsenregler so, dass der Scanbereich so viel wie möglich mit dem Zebrafisch gefüllt ist.

Stellen Sie die Obergrenze des Z-Stapels auf den Bereich ein, an dem die Zellen unscharf sind, und lassen Sie so drei Mikrometer mehr Platz über der Probe für das Wachstum und die Zellbewegung. Legen Sie dann die untere Grenze auf den Punkt fest, an dem die Zellen nicht mehr sichtbar sind, und legen Sie die Schrittweite des Z-Intervalls auf zwei Mikrometer fest. Für die hier gezeigten Experimente passen Sie die Bildgebungslaserleistung, die HV oder Verstärkung bzw. die Offset-Pegel wie unten aufgeführt an.

Sobald die Parameter eingestellt sind, schalten Sie den Scan aus, um unnötige Laserbelichtung zu vermeiden, die Phototoxizität und Photobleiche der Probe verursachen kann. Wählen Sie nun das Symbol für die 2-fache Mittelwertbildung aus, das die beste Bildqualität und die schnellste Scanzeit bietet. Wählen Sie das entsprechende Zeitintervall und die Zeitdauer aus, die für das Experiment erforderlich sind.

Für Wildtyp-Zellteilungen sind Zeitintervalle von zwei Minuten für eine Dauer von zwei Stunden ausreichend, um die mitotische Dauer zu bestimmen. Teilungen, die den Prüfpunkt für die Spindelmontage länger als dreißig Minuten aktivieren, eignen sich besser für Intervalle von vier bis fünf Minuten für vier Stunden, um den Fluoreszenz zu erhalten, wie hier gezeigt. Um die Datei automatisch zu speichern, während sie abgerufen wird, aktivieren Sie das Kontrollkästchen In Datei speichern, und benennen Sie die Datei.

Überprüfen Sie abschließend, ob alle Parameter korrekt eingestellt sind, und klicken Sie auf Jetzt ausführen. Nachdem die Erfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Symbol für den Lautstärkeschwellenwert, um die Datei in einem dreidimensionalen Format anzuzeigen. Diese Abbildung zeigt die Fähigkeit, viele Zellteilungen mit einem weiten Sichtfeld eines AB-Wildtyp-Zebrafischschwanzes zu beobachten.

Die Zellteilungen sind mit Sternchen gekennzeichnet. Den entsprechenden Film sehen Sie hier. Im Durchschnitt wurden 50 sich teilende Zellen in AB und 30 sich teilende Zellen in der Aurora B-Mutante beobachtet.

Um die reduzierte Anzahl von mitotischen Zellen zu erklären, die im Aurora B-mutierten Embryo abgebildet wurden, wurde das Verhältnis der mitotischen Zellen zur Anzahl der abgebildeten Zellen berechnet, was darauf hindeutet, dass es in den Aurora B-mutierten Embryonen keine geringere Anzahl von Zellen gibt, die die Mitose durchlaufen, sondern eher eine geringere Anzahl von Gesamtzellen, die abgebildet werden. Um die mitotische Dauer zu quantifizieren, wird die Anzahl der Zeitintervalle, die eine Zellteilung in Anspruch nehmen, mit dem Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stapeln multipliziert. Wie in dieser Grafik gezeigt, beträgt die durchschnittliche Teilungszeit des AB-Wildtyps 25 Minuten und 58 Minuten für die Aurora B-Mutante.

Wie bei Wildtyp-Embryonen kann jede mitotische Phase unterschieden werden. Im Aurora B-mutierten Embryo werden jedoch mitotische Defekte beobachtet, zu denen ein mitotischer Stillstand und eine filigrane Zytokinese gehören, die zu einer zweikernigen Zelle führen, und die anschließende Bildung von Mikrokernen, die die in dieser Mutante gemessene verlängerte Teilungszeit unterstützen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in einer Stunde durchgeführt werden, vom Screening der Embryonen bis zur Einstellung der konfokalen Mikroskopparameter.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich den Kontext des vorliegenden Experiments zu merken, da er sich auf den interessierenden Bereich, die Zeitdauer, das Zeitintervall und die Z-Tiefe bezieht. Dies trägt dazu bei, die Effizienz zu maximieren und Photobleiche und Phototoxizität zu verhindern. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. Chromosomenspreizungen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Ursache der beobachteten Mitosedefekte zu beantworten, oder die Verwendung einer medikamentösen Behandlung, um die Auswirkungen auf die mitotische Progression, die Dauer oder das Zellschicksal zu bestimmen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus der Biologie den Weg, die Mitose im Rahmen der Entwicklungs- und Krebsbiologie am Beispiel des Zebrafisches zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafischembryonen einbettet, Live-Bilder der Mitose aufnimmt und die Häufigkeit, Dauer und das Schicksal der Mitose analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Hochleistungslasern und Fluoreszenzlicht schädlich für die Augen sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die Vermeidung von direktem Blickkontakt mit den Lasern, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.