Name: Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung der Mitose in lebenden Zebrafisch-Embryonen mit fluoreszierend markiertem Chromatin und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Chromosomensegregation und deren Einfluss auf Entwicklung.

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Wir danken Kristen Kwan für die Vektoren pCS2-H2A.F/Z-EGFP und pCS2-mCherry-CAAX. Wir danken Chris Rodesch für die Nachhilfe in der Live-Bildgebung im Zebrafisch. Wir danken Shawn Williams, Erik Malarkey und Brad Yoder für ihre Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung an der UAB und der High Resolution Imaging Facility an der UAB. Die High Resolution Imaging Facility wird durch den UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) und das Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311) unterstützt. J.M.P. wird vom National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105) und Pilotzuschüssen der American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) und des UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148) unterstützt. S.M.P. wird durch das Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28) unterstützt.

1. In Vitro Transcription <ol><li> Linearisieren pCS2-H2A.F / Z-EGFP und / oder pCS2-mCherry-CAAX Vektoren durch NotI - Restriktionsenzym 31 verdauen. Unter Verwendung einer RNA in vitro - Transkription - Kit, erzeugen 5 &#39;mRNA mit Cap - Produkte aus jeder Vorlage, nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Reinige die verkappte mRNA eine Reinigung Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren mit RNase-freiem H 2 O. </li><li> Bestimmung der RNA-Konzentration durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. (OD 260 x Verdünnung x 40 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Verdünnen Sie die RNA zu 100 ng / &amp; mgr; l für jede H2A.F / Z-EGFP und mCherry-CAAX mit RNase-freiem H 2 O. Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, wird die Fluoreszenz vermindert oder abwesend sein. Hellere Proben werden die Bedenken hinsichtlich einer Phototoxizität und Photobleaching verringern. Auf der anderen Seite kann zu viel RNA toxisch und / oder verursachen Tor Wirkungen. Hinweis: Bewahren Sie die restlichengereinigte mRNA in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Zebrabärbling Zucht, Besamungs und mRNA Injection 36-38 <ol><li> Montieren Zuchtbecken mit einer Barriere, den Tank in zwei Bereiche zu trennen und jede Zuchtbecken mit Fischzuchtanlage Wasser zu füllen in der Zebrabärbling-Anlage eingesetzt. </li><li> Um vorzeitige Zucht zu verhindern, legen Sie zwei männliche Fische auf einer Seite der Barriere und zwei weiblichen Fische auf der anderen Seite in der Nacht vor der Zucht. </li><li> Am nächsten Tag, tauen die vorher hergestellten mRNA Mischung auf Eis. Ersetzen Sie das Wasser in Zuchtbecken mit frischem Wasser Aquakultur System und die Hindernisse zu beseitigen. Unmittelbar nachdem die Schranken gezogen werden, erwärmen eine Spritzgießform auf 28,5 ° C und die Ausrüstung für die Mikroinjektion eingerichtet. Hinweis: Weitere Informationen zu Spritzgießwerkzeugen entnehmen Sie bitte Gerlach 36. </li><li> Sammeln Sie alle Eier 10 bis 15 min ein Teesieb mit und spülen Sie die Eier in einen sauberen 100 x 15 mm Petrischale mit E3 Blau (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% Methylenblau). E3 Blau wird verwendet, Pilzwachstum zu verhindern und die richtige Entwicklung von Fischlarven zu gewährleisten. Weitere Informationen über die Paarung und Embryo - Entnahme siehe Gerlach 36 und Porazinkski 37. </li><li> Einbettungs one-Zelle statt Embryonen in einer Spritzgußform erwärmt und die RNA in den Dotter in der gewünschten Menge von Embryos (1A) einzuspritzen. Konto für natürliche Absterben von Embryonen und befruchteten Embryonen, die durch embryonale Injektionen auf 15% mehr Embryonen durchführen als für das Experiment benötigt. Weitere Einzelheiten über die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen, finden Sie in Gerlach 36 und Porazinkski 37. HINWEIS: Bei der ersten Verwendung von mRNA, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve Analyse die optimale Dosis für die Fluoreszenz und die Lebensfähigkeit (definiert als keine grobe Entwicklungsstörungen bis zu 5 dpf) vor der Durchführung der 5D-Bildgebung zu bestimmen. 150-200 ng / ulInjektion in Embryonen ist oft die optimale Konzentration, daher ist es ein guter Startpunkt für die Endkonzentration ist. </li><li> unter Verwendung eines modifizierten 9 &quot;Glas Pasteur Pipette vorsichtig die injizierten Embryonen aus der Form zu extrahieren. Die Pipette zu ändern, schmelzen das Ende einen Bunsenbrenner, bis er eine Kugel bildet. </li><li> Legen Sie injizierten Embryonen in einer 100 x 15 mm Petrischale in der E3-Blau und Haus in einem 28,5 ° C Inkubator. </li><li> Sechs Stunden nach der Injektion, entfernen Sie alle tot oder unbefruchtete Embryonen aus den Platten und fügen Sie auch saubere E3 Blau. Haus die Embryonen bei 28,5 ° C. </li></ol> 3. Herstellung und Einbettung von Live-Zebrafischembryonen für Imaging (Abbildung 1B) <ol><li> Zwei Stunden vor der Bildgebung, Bildschirm die injizierten Embryonen für die GFP ein fluoreszierendes Binokular mit. Legen Sie hellgrünes GFP-exprimierenden Embryonen in einem neuen 100 x 15 mm Petrischale mit E3-Blau. </li><li> Kochen Sie eine Stammlösung von 1% niedriger Schmelz Agarose durch Zugabe von 1 g niedrigschmelzende Agarose zu 100 ml E3 Blau. Nach der Verwendung des Agarose, decken den Kolben, der mit Aluminiumfolie. Die Stammlösung bleibt für bis zu einem Monat nützlich. </li><li> Aliquot 3 ml der geschmolzenen Agar in einer 17 x 100 mm Kulturröhrchen. in einem 42 ° C Wasserbad bis zur Verwendung Halten Sie die Agarose warm, indem die Kulturröhrchen platzieren. Bereiten Sie eine 15 mM Tricaine Lösung in VE - Wasser , um die Genaktivität zu betäuben 36. HINWEIS: Wenn Bildgebung zu früheren Zeitpunkten gewünscht wird, kann die Konzentration von Agar als niedrig 39 als 0,3% verringert werden. </li><li> Bringen Sie die 15 mM Tricaine, abgeschirmt Embryonen, niedrige Schmelz Agarose, E3 Blau, und ein 35 mm Deckglas Boden Kulturschale zu einer Dissektion Lichtmikroskop. Sorgfältig das Chorion mit # 5 Pinzette des Embryos zu entfernen. Tun Sie dies für drei Embryonen. </li><li> Legen Sie die dechorionated Embryonen in einem separaten Behälter betäubt werden. Der Deckel des Deckglases Bodenschale wird oft für diesen Zweck verwendet. Mit Hilfe einer Transferpipette, fügen Sie drei Tropfen (ungefähr 150 ul)von 15 mM Tricaine in die Schale von 5 ml E3 blau (wenn Sie den Deckel des Deckbodenschale verwenden) oder bis Embryonen ausreichend betäubt wurden. Darüber hinaus fügen Sie 3-4 Tropfen (ca. 150 bis 200 &amp; mgr; l) von 15 mM Tricaine Lösung für das 1% geschmolzener Agarose Rohr. </li><li> Mit einer p200 Pipette mit 1 cm der Pipettenspitze abgeschnitten; übertragen Sie die narkotisierten Embryonen auf dem Deckglas Boden Gericht. Entfernen Sie überschüssiges E3 Blau: Tricaine Lösung. </li><li> Langsam von 5 bis 10 &amp; mgr; l von niedrigschmelzende Agarose: Tricaine Lösung über die Embryonen, jeden Tropfen zu halten trennen die Embryonen versehentlich geschlossen haben, um sicherzustellen, nicht driften zueinander. Achtung: Wenn die Agarose zu warm ist, wird es den Embryo schädigen. Eine gute Temperatur des Agar zu halten, bei 42 ° C. </li><li> Unter Verwendung einer 21 G 1 ½ Nadel auszurichten sanft den Embryo in der Agarose auf die gewünschte Position. Wenn ein inverses Mikroskop für Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung richten Sie die Region of Interest (ROI) so nah an dem Deckglas als possible. Anmerkung: Für allgemeine Zwecke, der Schwanzbereich bietet eine einfache Ausrichtung und Klarheit aufgrund der relativ dünnen Gewebe (1A). Andere Gewebe, wie beispielsweise die Epithelschicht umgeben Eigelb und fin Falten können 28,29 verwendet werden. Diese Gewebe bieten große Klarheit, aber diese Regionen sind nur wenige Zellschichten dick. Für den Zweck dieses Protokolls ist es dem Bild vorteilhaft Schwanzbereich, um so viele Zellteilungen wie möglich erfassen. </li><li> Lassen Sie ein paar Minuten zur teilweisen Verfestigung des Agar. Verwenden Sie die Nadel ein kleines Stück Agar auseinander zu brechen, um seine Verfestigung zu testen. Wann kann ein Stück Agar weg aus dem Drop gezogen werden, gehen Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Decken Sie die gesamte Deck mit niedriger Schmelz Agar eine Kuppel über den eingebetteten Embryonen zu bilden. Lassen Sie das Agar , bevor die Schale für die konfokale Abbildung (Abbildung 1A) zu festigen. </li><li> Während der Agar Erstarrungsprozesses (ca. 10 min dauert), bereiten Sie 3 ml of E3 Blaue Lösung mit fünf Tropfen (etwa 250 &amp; mgr; l) 15 mM Tricaine auf über den eingebetteten Embryonen während der Bildgebung platziert werden. </li></ol> 4. 5D konfokale Bildgebung von Live Zebrafischembryonen 40,41 HINWEIS: Siehe Ariga 40 und O&#39;Brien 41 für Details, wie 5D Bildgebung mit anderen konfokale Systeme durchzuführen. Für Z-Intervall, Z-Stack, Z-Tiefe, Zeitintervall und 5D Definitionen siehe Abbildung 1C. <ol><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und stellen Sie das Mikroskop 60x NA 1,4 Objektivlinse. Bewerben Sionsöl auf die Objektivlinse und legen Sie die Kulturschale in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Mit Hilfe der Achsensteuerung, zentriert um den Embryo von Interesse über der Objektivlinse und bringen nach oben in die Objektivlinse die Kulturschale zu erfüllen. </li><li> Klicken Sie auf das Okular-Symbol und wechseln Sie in das GFP-Filter auf dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf den ROI. Die Konzentration auf das Gewebe am nächsten an der Deck wird offer die besten Bildergebnisse. </li><li> Entfernen Sie die Verriegelung. Wählen Sie die GFP und mCherry Kanäle (voreingestellten Wellenlängen in Software) und stellen Sie die Zeile mit durchschnittlich Option normal. </li><li> Verwenden Sie &quot;Ansicht / Erfassungs-Bedienelemente / A1 Scanbereich&quot; Befehl auf der A1 Scanbereich Werkzeug zu öffnen. </li><li> Beginnen Sie das Scanning. Unter Verwendung des Achs-Controller, positionieren Sie den Embryo, so dass der Scan-Bereich mit so viel von der Zebrabärbling wie möglich gefüllt ist. Die Laserleistung muss nicht zu diesem Zeitpunkt optimal. Senken Sie die Laserleistung, um unnötige Photobleichens vermeiden. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Ansicht / Acquisition Kontrollen / ND Erwerb&quot; Befehl, um die ND Erwerb Systemsteuerung zu öffnen. </li><li> Beginnen Sie das Scannen der Z-Stack-Parameter einzustellen. Stellen Sie den Z-Stack obere Grenze, wo die Zellen sind nicht im Fokus und untere Grenze, wo Zellen sind nicht mehr sichtbar. Ermöglichen eine 3 um Raum oberhalb der Probe für das Wachstum und die Zellbewegung, die in das Bildfeld erweitern kann. Der Z-Stack für die Figuren in diesem Pro gezeigtkoll bedeckt eine Z-Tiefe von 40 &amp; mgr; m im Embryo Schwanz. </li><li> Stellen Sie den Z-Intervall bis 2 um Schrittweite. Im Durchschnitt eine Zelle ist 10 &amp; mgr; m im Durchmesser; daher 2 &amp; mgr; m werden fünf Intervallen von Abbildungsdaten zu erzeugen für jede Zelle analysiert werden. HINWEIS: Die Tiefe des Bildes, das abhängig von der Z-Intervall erfasst werden können. Z Auflösung wird geopfert Bild so viele Zellen, um die Gesamttiefe in der Z-Dimension zu gewinnen Mitose wie möglich (große Z-Tiefe) unterzogen. Die inverse wahr ist, daß durch die Schrittgröße abnimmt, wird Z Auflösung gewonnen, während Z-Tiefe (kleine Z-Tiefe) geopfert wird. </li><li> Stellen Sie das Bild Laserleistung, HV, und Ebenen ausgeglichen. Für die Experimente in diesem Protokoll demonstriert, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Pegel an den entsprechenden Ebenen versetzt sind, jeweils für die GFP-Kanal; 2 bis 5, 120-140, und -9 bis -11. Für den mCherry Kanal, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Offset-Pegel sind; 3 bis 6, 120-140, und -3 bis-8. Nachdem die Parameter eingestellt sind, schalten Sie die Scan unnötig Laserbelichtung zu verhindern, die Phototoxizität und Photobleaching der Probe führen kann. </li><li> Wählen Sie die Mittelungs Symbol 2x Linie. &quot;Nein Lungs&quot; erzeugt ein körniges Bild, während &quot;4x Linie durchschnittlich&quot; drastisch erhöht die Scan-Zeit. Die Verwendung von 2x Linie Lungs bietet die beste Bildqualität und schnellste Scan-Zeit. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Zeitintervall und Zeitdauer, die für das Experiment. Für Wildtyp - Divisionen, zwei-Minuten - Zeitintervalle für 2 Stunden ist am besten für mitotische Dauer Bestimmung (verwendet in den 1, 2, 3A und 3B). Räume, die die Spindelanordnung Kontrollpunkt für länger als 30 Minuten sind besser geeignet für alle fünf Minuten für vier Stunden aktivieren , um Fluoreszenz zu erhalten , wie in 3C gezeigt. </li><li> Überprüfen Sie die &quot;Datei speichern&quot; ein und benennen Sie die Datei automatisch die Datei zu speichern, wie es erworben wird. Überprüfen Sie alle pametern richtig und drücken Sie &quot;Start Run&quot; gesetzt. </li><li> Nach dem Erwerb abgeschlossen ist, wird die Datei in einem dreidimensionalen Format, klicken Sie auf die Lautstärkeschwelle Symbol anzuzeigen. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht eine Kernhülle Abbau, Bildung einer Metaphase Platte durch Mikrotubuli-kinetochore Anhänge und Segregation von Schwesterchromatiden zu schließen zwei neue Zellen in vivo zu bilden , und in einer zeitabhängigen Weise. Die Fähigkeit, die Mitose in Zebrabärbling zu beobachten ist vorteilhaft gegenüber fixierten Proben und Zellkultur-Systeme, da die Zellen in die natürliche Physiologie abgebildet wird, das Gewebe transparent ist, die für fluoreszierende Proteine ​​können ...

Mitose ist ein wichtiger zellulärer Prozess essentiell für das Wachstum, Differenzierung und Regeneration in einem lebenden Organismus. Von der genauen Zubereitung und Replikation von DNA in der Interphase, wird die Zelle zu unterteilen grundiert. Die erste Phase der Mitose Prophase, wird durch die Aktivierung von Cyclin B / Cdk1 eingeleitet. Prophase wird durch Kondensation von Chromatin Material in Chromosomen charakterisiert. Kernhülle Schlag erfolgt am Übergang zwischen der Prophase und Prometaphase. In Prometaphase, Zentrosomen, die Keimzentrum für Spindelbildung, beginnen zu entgegengesetzten Polen während Verlängerung Mikrotubuli auf der Suche nach kinetochore Anlage zu migrieren. Nach Befestigung, bis Ende auf Conversions Mikrotubuli Befestigung und Spannungskräfte orientieren die Chromosomen eine Metaphaseplatte 1 bildet. Wenn alle Chromosomen korrekt, wird die Spindelanordnung Kontrollpunkt zufrieden, cohesin Ringe halten die Schwesterchromatiden zusammen gespalten gebunden sind, und Mikrotubuli verkürzen Schwester zu ziehenChromatiden zu entgegengesetzten Polen während der Anaphase 2,3. Die letzte Phase, Telophase beinhaltet Dehnung der Zelle und Rückbildung der Kernhülle um die beiden neuen Kernen. Zytokinese vervollständigt den Teilungsprozess durch das Zytoplasma der beiden neuen Tochterzellen 4-6 trennt. Änderung der Schlüssel mitotischen Wege (dh Spindelanordnung Kontrollpunkt, Zentrosom Vervielfältigung, Schwester-Kohäsion, usw.) Kann in der Metaphase Verhaftung missegregation von Chromosomen führen, und genomische Instabilität 7-10. Letztlich können Defekte in Wege steuern Mitose verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs, erfordert die Visualisierung von Mitose und ihre Mängel in einem Live, Wirbel mehrzelligen Organismus 16.10. Zebrabärbling-Embryonen dienen als große Modellorganismus für die Live-Darstellung aufgrund des transparenten Gewebe, einfache Mikroinjektion und schnelle Entwicklung. Mit Zebrabärbling, ist das übergeordnete Ziel dieses Manuskriptein Verfahren der lebenden 5D (Abmessung X, Y, Z, Zeit und Wellenlänge) Abbilden von Mitose 17 (1C) beschreiben. Die Verwendung von Mutanten Zebrabärbling defekt in verschiedenen mitotischen Bahnen zeigen die Folge solcher Defekte. Für dieses Protokoll, Aurora B und ESCO2 Mutanten wurden diese Mängel zu illustrieren gewählt. Aurora B ist eine Kinase, die ein Teil des Chromosoms Fahrgast Komplex (CPC), die zur Spindelbildung und Mikrotubuli Befestigungs ist. Es ist auch für Spaltungsfurche Bildung in Zytokinese 18,19 erforderlich. In Zebrabärbling führt Aurora - B - Mangel zu Defekten in Furche Induktion, Zytokinese und Chromosomensegregation 20. ESCO2, andererseits ist eine Acetyltransferase, die Schwester - Chromatid - Kohäsions 21,22 wesentlich ist. Es acetyliert cohesin auf dem SMC3 Abschnitt des Rings so cohesin 23 korrekte Chromosomensegregation in der Metaphase-Anaphase Übergang zu gewährleisten stabilisieren. Der Verlust der ESCO2 in Zebrabärbling führt zu chromosome missegregation, vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden, genomische Instabilität und p53-abhängige und unabhängige Apoptose 24,25. Aufgrund der Verfügbarkeit, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 mutant Zebrabärbling (nachfolgend als Aurb m / m und ESCO2 m / m, jeweils) werden verwendet , um 25-27 um diese Technik zu veranschaulichen. Die Kopplung der konfokalen Mikroskopie mit Fluoreszenz-markierten Zellmaschinerie hat Forscher aktiviert Chromatin und Zellmembran Dynamik während der Mitose 25,28,29 visualisieren. Fluorescent-markierte Histone haben in der Vergangenheit verwendet wurden Chromatin sichtbar zu machen. Histone sind Kernproteine ​​bestehen aus vier verschiedenen Paaren (H2A, H2B, H3 und H4), die für die Nukleosomenstruktur verantwortlich sind, die 30 Chromosomen komponiert. Während H2B ist wohl das am häufigsten verwendete Histon für fluoreszierende ProteineMaus und Zellkultur, die Verwendung von Histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) ist für den Einsatz in Zebrabärbling 31,32 gut bewährt. Concanavalin A und Casein - Kinase - 1-gamma beispielsweise lokalisiert auf der Zellmembran und haben in Visualisierung der Zellmembran in Seeigeln und drosophila 33,34 vorher wirksam erwiesen. Andere Studien haben gezeigt , dass die CAAX fluoreszierend-markierte Protein bezeichnet die Zellmembran und war erfolgreich in Zebrabärbling 31. CAAX ist ein Motiv, das durch post-translationale Modifikationsenzyme wie Farnesyltransferasen und geranylgeranyltransferases erkannt wird. Änderungen durch diese Enzyme verursachen Proteine ​​membranassoziiertes zu werden, wodurch die Zellmembran Markierung 35. Aufgrund der Vorbenutzung in Zebrabärbling, wählte dieses Protokoll H2A.F / Z und CAAX zu etikettieren Chromatin und die Zellmembran zu verwenden. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht es dem Forscher Mitose auf Einzelzellebene zu überwachen einzelnen Chromosom zu beobachtenDynamik, sowie gleichzeitig mehrere Zellteilungen zu überwachen, die Gewebedifferenzierung und Entwicklung auswirken können. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Abbildung der Dynamik von Chromosomensegregation während der Mitose auf Einzelzellebene. Innerhalb dieses Manuskript, die Fähigkeit, mehrere mitotische Teilungen zu beobachten, Teilungszeit berechnen und die mitotische Phänotypen entziffern wird dargestellt und diskutiert werden. Durch die Verwendung dieser Parameter kann, physiologisch relevanten Daten durch mitotische Mängel betroffen mehrere Krankheitszustände gesammelt und angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>pCS2-Vektoren</td><td>Geschenk von K. Kwan</td><td></td><td>Für Plasmide von Interesse</td></tr><tr><td>NotI-HF-Restriktionsenzym</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>Für den Restriktionsverdau von Plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Für in vitro Transkription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Für die Aufreinigung von mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Für die Unterbringung von Embryonen</td></tr><tr><td>Mikroinjektionsform</td><td>hausgemacht</td><td></td><td>Zum Halten von Embryonen während der Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>Zum Einbetten von Embryonen</td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Zur Betäubung von Embryonen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Für Embryowasser (E3 Blau), gelöst in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Für Embryowasser (E3 Blau), gelöst in UltraPure H2</td></tr><tr><td>O CalciumchloridDihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Für Embryowasser (E3 Blau), gelöst in UltraPure H2</td></tr><tr><td>O Magnesiumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>Für Embryowasser (E3 Blue), gelöst in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>Für Embryowasser (E3 Blue), gelöst in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 mm Kulturröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>Für geschmolzenes Agar</td></tr><tr><td>35 mm Glasdeckglas Bodenkulturschale</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>Nr. 0, 20 mm Glas, Zum Einbetten von Embryonen</td></tr><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>Für die Dechorionierung von Embryonen</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 Gauge</td><td>Nadel Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Für die Positionierung von Embryonen in Agar</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>Für das Screening und Einbetten von Embryonen eignet sich jedes Präparierfernrohr</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>Für Zeitrafferaufnahmen</td></tr><tr><td>Konfokale Software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>Für die Bilderfassung und -bearbeitung</td></tr></tbody></table>

beobachten mitose und dynamik in einer live zebrafischembryo

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitose ist entscheidend für organismal Wachstum und Differenzierung. Der Prozess ist sehr dynamisch und erfordert Ereignisse bestellt richtige Chromatin-Kondensation, Mikrotubuli-kinetochore Befestigung, Chromosomensegregation und Zytokinese in einem kleinen Zeitrahmen zu erreichen. Fehler in der heiklen Prozess kann in der menschlichen Krankheit, einschließlich Geburtsschäden und Krebs führen. Traditionelle Ansätze menschlicher Zustände mitotischen Krankheit untersuchen verlassen sich oft auf Zellkultursysteme, die die natürliche Physiologie und Entwicklungs / gewebespezifischen Kontext vorteilhaft fehlt, wenn die menschliche Krankheit zu studieren. Dieses Protokoll überwindet viele Hindernisse, die durch einen Weg, um sichtbar zu machen, mit hoher Auflösung, Chromosomendynamik in einem Wirbeltier-System, das Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ausführlich ein Ansatz, der verwendet werden kann , dynamische Bilder von sich teilenden Zellen zu erhalten, die Folgendes umfassen: In - vitro - Transkription, Zebrabärbling Zucht / Sammeln, Embryo Einbettung und Zeitraffer-Bildgebung. Optimierung und modifikationen dieses Protokolls werden ebenfalls untersucht. Mit H2A.F / Z-EGFP (Etiketten Chromatin) und mCherry-CAAX (Etiketten Zellmembran) mRNA-injizierten Embryonen, die Mitose in AB - Wildtyp, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 Mutante Zebrabärbling visualisiert. Hochauflösende Live-Bildgebung in Zebrabärbling ermöglicht eine mehrere Mitosen zu beobachten, statistisch zu mitotischen Defekten und den Zeitpunkt der mitotischen Progression zu quantifizieren. Darüber hinaus Beobachtung der qualitativen Aspekte , die unsachgemäß mitotische Prozesse definieren (dh congression Defekte, missegregation der Chromosomen, etc.) und falsche Chromosomen Ergebnisse (dh Aneuploidie, Polyploidie, Mikronuklei, etc.) beachtet werden . Dieser Assay kann zur Beobachtung der Gewebedifferenzierung / Entwicklung angewendet werden und ist zugänglich für die Verwendung von mutierten Zebrafisch und pharmakologischen Mitteln. Visualisierung, wie Mängel in der Mitose zu Krebs und Entwicklungsstörungen führen wird starkVerständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern.

Abbildung 2 zeigt die Fähigkeit , viele Zellteilungen mit einem weiten Feld Ansicht eines AB Wildtyp Zebrabärbling Schwanz zu beobachten. Über sieben mitotischen Zellen werden in einem 14 min Zeitrahmen (Film 1) abgebildet. Innerhalb der zwei Stunden Zeitverlauf über 40 mitotische Ereignisse wurden gefangen genommen. Im Durchschnitt 50 teilende Zellen wurden in der AB und 30 teilende Zellen in aur B m / m Embryonen (2...

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genauigkeit der Chromosomensegregation während der Mitose in einem lebenden Zebrafischembryo mithilfe fluoreszenzmarkierter Chromatin- und Zellmembranproteine zu überwachen, die mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie erfasst werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mitose zu beantworten, beispielsweise wie mitotische Defekte zu Entwicklungsstörungen oder Tumorbildung in einem lebenden Wirbeltierorganismus führen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus beobachtet wird, wodurch physiologisch relevante Daten gewonnen werden können.Nach der Züchtung erwachsener Zebrafische und der Injektion von Eiern mit H2A.F/Z-EGFP und/oder pCS2 mCherry-CAAX-RNA identifizieren Sie etwa zwei Stunden vor der Bildaufnahme mithilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskops GFP-positive Embryonen. Übertragen Sie stark grün leuchtende, GFP-exprimierende Embryonen in eine neue Petrischale mit den Maßen 100 mal 15 Millimeter, die mit E3-Blau-Medium gefüllt ist.Kochen Sie eine Stammlösung mit 1 % Low-Melt-Agarose in E3-Blau. Portionieren Sie drei Milliliter der geschmolzenen Agarose in ein Kulturrohr mit den Maßen 17 mal 100 Millimeter. Halten Sie die Agarose warm, indem Sie das Kulturrohr bis zur Verwendung in ein Wasserbad mit 42 Grad Celsius stellen.Sammeln Sie 15-Millimolar-Tricain, selektierte Embryonen, Low-Melt-Agarose, E3-Blau und eine 35-Millimeter-Kultur-Schale mit Deckglasboden sowie ein Stereomikroskop. Entfernen Sie anschließend mit Pinzette Nummer fünf vorsichtig die Chorionhüllen von drei Embryonen und legen Sie die Embryonen in einen separaten Behälter zur Anästhesie. Geben Sie danach mit einer Transferpipette drei Tropfen 15-Millimolar-Tricain in die Schale, die die Embryonen und fünf Milliliter Medium enthält. Geben Sie drei bis vier Tropfen einer 15-millimolaren Tricain-Lösung zu dem Gefäß mit 1% geschmolzenem Agarose hinzu. Sobald die Embryonen ausreichend anästhesiert sind, überführen Sie die anästhesierten Embryonen mit einer P200-Pipette, bei der ein Zentimeter der Pipettenspitze abgeschnitten wurde, auf die mit Deckgläsern ausgekleidete Schale. Entfernen Sie überschüssige Mengen an der E3-blauen Tricain-Lösung. Fügen Sie langsam fünf bis 10 Mikroliter der Low-Melt-Agarose-Tricain-Lösung über den Embryonen hinzu, wobei jeder Tropfen getrennt bleiben sollte, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht zueinander wandern. Drehen Sie die Embryonen anschließend mit einer 21-Gauge-ein-und-ein-halb-Nadel vorsichtig in der Agarose in die gewünschte Position, wobei der interessierende Bereich, falls ein invertiertes Mikroskop verwendet wird, so nah wie möglich an der Deckglasoberfläche ausgerichtet werden sollte. Aufgrund möglicher Verschiebungen kann es erforderlich sein, zu jedem Embryo erneut zurückzukehren, um sicherzustellen, dass er in der erforderlichen Position verbleibt.Dieser Vorgang muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, bis die ideale Position erreicht ist, während das Agar erstarrt. Nach einigen Minuten, um zu überprüfen, ob es fest ist, verwenden Sie eine Nadel, um ein kleines Stück Agarose aufzubrechen. Wenn es sich von dem Tropfen lösen lässt, verwenden Sie zusätzliche Low-Melt-Agarose, um eine Kalotte über die eingebetteten Embryonen zu bilden, die die gesamte Deckglasabdeckung bedeckt.Während sich das Agarose verfestigt, bereiten Sie drei Milliliter E3-Blaumedium mit fünf Tropfen 15-millimolarer Tricainlösung vor, das während der Bildgebung über die eingebetteten Embryonen gegeben wird. Um eine 5D-Konfokalbildgebung lebender Zebrafisch-Embryonen durchzuführen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und stellen das Mikroskop auf ein 60X-Objektiv mit numerischer Apertur 1,4 ein. Geben Sie Immersionsöl auf das Objektiv und platzieren Sie die Kulturschale im Objektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch.Positionieren Sie mit dem Achsenregler das gewünschte Embryo über der Objektivlinse und heben Sie die Linse an, bis sie die Kulturschale erreicht. Gießen Sie die E3-blaue Lösung mit Tricain über die in Agar eingebetteten Embryonen. Klicken Sie anschließend auf das Augenport-Symbol, um die Embryonen durch das Okular zu betrachten.Deaktivieren Sie die Augenport-Auswahl und wählen Sie Ansicht, Aufnahme-Steuerungen, A1-Scan-Bereich, um das Werkzeug für den A1-Scan-Bereich zu öffnen. Wählen Sie den GFP-Kanal aus, starten Sie den Scan neu und fokussieren Sie auf einen interessierenden Bereich in der Nähe des Deckglases. Beenden Sie den Scan, wählen Sie die GFP- und mCherry-Kanäle aus und stellen Sie die Zeilenmittelungs-Option auf normal.Wählen Sie nun Ansicht, Aufnahmesteuerung, ND-Aufnahme, um das ND-Aufnahmewerkzeug A1 zu öffnen. Beginnen Sie mit der Abtastung. Positionieren Sie dann mithilfe des Achsencontrollers die Embryonen so, dass der Scan-Bereich so weit wie möglich mit dem Zebrafisch ausgefüllt wird.Stellen Sie die obere Grenze des Z-Stapels dort ein, wo die Zellen außerhalb der Fokusebene liegen, und berücksichtigen Sie zusätzlich einen Freiraum von drei Mikrometern über der Probe für Wachstum und Zellbewegung. Danach setzen Sie die untere Grenze dorthin, wo die Zellen nicht mehr sichtbar sind, und legen Sie die Z-Intervall-Schrittweite auf zwei Mikrometer fest. Für die hier dargestellten Experimente stellen Sie jeweils die Leistung des Abbildungslasers, die HV- oder Verstärkungseinstellung sowie die Offset-Werte wie unten aufgeführt ein.Wenn die Parameter eingestellt sind, schalten Sie den Scanvorgang ab, um eine unnötige Laserexposition zu verhindern, die Phototoxizität und Photobleaching der Probe verursachen könnte. Wählen Sie nun das Symbol für die 2-fache Zeilenmittelung aus, das die beste Bildqualität und die schnellste Scanzeit bietet. Wählen Sie das für das Experiment erforderliche Zeitintervall und die erforderliche Versuchszeitdauer aus.Für die Zellteilungen des Wildtyps sind Zwei-Minuten-Zeitintervalle über einen Zeitraum von zwei Stunden ausreichend, um die Mitosedauer zu bestimmen. Für Teilungen, die die Spindelkontrollpunktkontrolle länger als dreißig Minuten aktivieren, eignen sich Vier-bis-Fünf-Minuten-Intervalle über vier Stunden besser, um die Fluoreszenz zu schonen, wie hier gezeigt. Um die Datei automatisch während der Aufnahme zu speichern, aktivieren Sie das Kontrollkästchen „In Datei speichern“ und benennen Sie die Datei. Überprüfen Sie abschließend, ob alle Parameter korrekt eingestellt sind, und klicken Sie auf „Jetzt ausführen“. Nach Abschluss der Aufnahme klicken Sie auf das Symbol „Volumenschwelle“, um die Datei im dreidimensionalen Format anzuzeigen. Diese Abbildung zeigt die Möglichkeit, zahlreiche Zellteilungen mithilfe eines weiten Sichtfelds am Schwanz eines AB-Wildtyp-Zebrafischs zu beobachten.Die Zellteilungen sind mit Sternchen markiert. Der entsprechende Film wird hier gezeigt. Im Durchschnitt wurden 50 teilende Zellen in AB und 30 teilende Zellen im Aurora-B-Mutanten beobachtet.Um die geringere Anzahl an in der Aurora-B-Mutante beobachteten mitotischen Zellen zu berücksichtigen, wurde das Verhältnis der mitotischen Zellen zur Gesamtanzahl der beobachteten Zellen berechnet. Dies deutet darauf hin, dass nicht weniger Zellen die Mitose durchlaufen, sondern dass insgesamt weniger Zellen abgebildet werden. Zur Quantifizierung der Mitosedauer wird die Anzahl der Zeitintervalle, die eine Zellteilung umfassen, mit dem Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stacks multipliziert. Wie in diesem Diagramm gezeigt, beträgt die durchschnittliche Teilungszeit der AB-Wildtyp-Zelle 25 Minuten und 58 Minuten in der Aurora-B-Mutante.Wie bei Wildtyp-Embryonen kann jede mitotische Phase unterschieden werden. Bei dem Aurora B-Mutanten-Embryo treten jedoch mitotische Defekte auf, die eine mitotische Arrestierung und eine fehlgeschlagene Zytokinese umfassen, was zu einer binukleären Zelle führt, sowie zur anschließenden Bildung von Mikrokernen, was die bei diesem Mutanten gemessene verlängerte Teilungsdauer unterstützt. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Stunde durchgeführt werden – von der Untersuchung der Embryonen bis zur Einstellung der Parameter am konfokalen Mikroskop.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den experimentellen Kontext zu berücksichtigen, insbesondere hinsichtlich des interessierenden Bereichs, der Beobachtungsdauer, des Zeitintervalls und der Z-Tiefe. Dies trägt zur Maximierung der Effizienz bei und hilft, Photobleaching sowie Phototoxizität zu vermeiden. Nach Abschluss dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Chromosomenausstriche angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Ursachen beobachteter Mitosestörungen zu klären, oder es kann eine Behandlung mit Wirkstoffen erfolgen, um deren Auswirkungen auf den Verlauf, die Dauer der Mitose oder das Zellschicksal zu untersuchen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biologie den Weg, um die Mitose im Kontext der Entwicklungs- und Krebsbiologie unter Verwendung von Zebrafischen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafischembryonen einbettet, Live-Bildaufnahmen der Mitose erstellt und die Häufigkeit, Dauer und Zellgeschicke der Mitose analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit leistungsstarken Lasern und fluoreszierendem Licht schädlich für die Augen sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Vermeiden von direktem Augenkontakt mit den Lasern sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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