Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die intrazelluläre und extrazelluläre Proteinstabilität in lebenden Zebrafischembryonen zu messen. Dies wird erreicht, indem ein Protein von Interesse mit einem photokonvertierbaren fluoreszierenden Protein markiert wird und indem mRNA, die für die Fusion kodiert, sowie ein Fluoreszenzfarbstoff in Zebrafischembryonen injiziert wird. Als nächstes wird das photokonvertierbare Fusionsprotein photokonvertiert, wodurch das Protein mit einem Impuls markiert wird.

In diesem Beispiel wird das Fusionsprotein sezerniert, dann wird der Zerfall der intra- und extrazellulären photokonvertierten Fluoreszenzintensität über die Zeit überwacht und mit einer exponentiell abnehmenden Funktion ausgestattet, um die intrazellulären und extrazellulären Halbwertszeiten des Fusionsproteins zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen die in vivo Stabilität von photokonvertierbaren Fusionsproteinen, basierend auf dem Zerfall des Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Zell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten.

Zum Beispiel, wie die Stabilität die Proteinverteilung und -verfügbarkeit beeinflusst. Wir verwenden unsere Software EP für die Analyse von FD DP-Daten. EP ist auf unserer Webseite frei verfügbar: Nach der Erzeugung von gekapselter mRNA in der Kodierung eines kodierenden grün-roten, photokonvertierbaren Fusionsproteins von Interesse übertragen Sie etwa 31 Zebrafischembryonen im Zellstadium in eine mit Glas oder Agar-Rose beschichtete Petrischale aus Glas oder Agar-Rose mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern, die etwa acht Milliliter Embryomedium enthält.

Geben Sie zwei Milliliter der zuvor zubereiteten und aufgetauten Pro-Nay-Brühe in die Schüssel und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Füllen Sie einen Glaslautsprecher mit Embryomedium und übertragen Sie die Embryonen in das Becherglas, indem Sie die Petrischale kippen, während Sie sie in das Medium eintauchen, ohne die Embryonen Luft oder Plastik auszusetzen. Nachdem sich die Embryonen am Boden des Becherglases abgesetzt haben, gießen Sie den größten Teil des Mediums aus und verwenden Sie frisches Medium, um es vorsichtig zu ersetzen.

Das leichte Verwirbeln des frischen Mediums führt dazu, dass die Embryonen ihre geschwächte Hornhaut verlieren. Nachdem Sie den Waschvorgang wiederholt haben, verwenden Sie eine PE-Glaspipette mit einer geflammten Spitze, um die beschichteten Embryonen in eine mit Agarose beschichtete Injektionsschale zu übertragen. Injizieren Sie dann die mRNA und ein drei Kilogramm starkes Alexa 4 88 DExT-Konjugat direkt in das Zentrum der Zelle, um eine gleichmäßige Verteilung von mRNA und Farbstoff zu gewährleisten.

Sobald die Spaltung beginnt, übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine mit Embryo und Medium gefüllte, mit Agarose beschichtete Vertiefung einer Kunststoffschale mit sechs Vertiefungen und inkubieren Sie sie im Dunkeln bei 28 Grad Celsius, bis die Embryonen mit einem Stereomikroskop das späte Kugelstadium erreichen, identifizieren Sie ein bis fünf gesunde Embryonen und verwenden Sie eine PE-Pipette aus Glas mit einer geflammten Spitze, um sie aus der Schale zu entfernen. Werfen Sie die Embryonen vorsichtig in ein Mikrozentrifugenröhrchen aus, das etwa einen Milliliter geschmolzenen Aros mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 1 % in einem x danios Embryomedium enthält. Ziehen Sie als Nächstes die Embryonen zusammen mit einigen Aros zurück in die Pipette.

Werfen Sie dann die Aros und Embryonen vorsichtig auf die Abdeckung aus. Glas einer Glasbodenschale. Um die Glaspipette wiederzuverwenden, reinigen Sie die verbleibenden Arros, um Verstopfungen zu vermeiden, indem Sie das Embryomedium schnell auf und ab pipettieren und schnell arbeiten, bevor sich das Arous verfestigt.

Positionieren Sie die Embryonen mit einer Metallsonde so, dass der Tierpol unter dem Stereomikroskop zum Deckglas zeigt. Überwachen Sie die Positionen der Embryonen und passen Sie sie bei Bedarf nach, bis der Agarro aushärtet. Wenn der Agarro fest geworden ist, verwenden Sie ein x Danios Embryo Medium, um die Glasbodenschale zu füllen.

Um sich auf die Fotokonvertierung vorzubereiten, stellen Sie den Inkubator auf 28 Grad Celsius ein und geben Sie einen großen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv, um sicherzustellen, dass der Ölfilm zwischen Objektiv und Deckglas nicht reißt, wenn sich der Tisch in verschiedene Embryopositionen bewegt. Stellen Sie die Glasbodenschale während der Bildgebung sicher auf den Tisch, damit sich die Schale nicht verschiebt, wenn sich der Tisch bewegt. Definieren Sie als Nächstes im Softwarepaket des konfokalen Mikroskops die Position jedes Embryos.

Passen Sie die Z-Tiefe für jeden Embryo an und versuchen Sie, mit den Lasern mit 4 88 und 5 43 Nanometern ungefähr die gleiche Ebene in jedem Embryo anzuvisieren. Erfassen Sie Bilder vor der Fotokonvertierung. Konfigurieren Sie dann die Konfokalmikroskop-Software so, dass jede der zuvor definierten Positionen mit den entsprechenden Bildgebungsbedingungen abgebildet wird.

Alle 10 oder 20 Minuten oder einen fünfstündigen Zeitkurs wird das Fusionsprotein in ein 10-faches Objektiv umgewandelt, und Gruppen von Embryonen werden zwei Minuten lang dem UV-Licht der Quecksilberlampe mit einem Filter von etwa 300 bis 400 Nanometern bei 100 % Leistung ausgesetzt. Verschieben Sie den Fokus entlang der Z-Achse, um eine gleichmäßige Fotokonvertierung nach der Fotokonvertierung zu fördern. Schalten Sie sofort wieder auf das 25 x oder 40 x Objektiv um und bestätigen Sie, dass die zuvor definierten Positionen noch korrekt sind.

Wenn sich die Schale während der Fotokonvertierung verschoben hat, definieren Sie die Positionen der Embryonen neu. Starten Sie den Imaging-Zeitkurs und lassen Sie ihn fünf Stunden lang laufen. Notieren Sie die Zeit, die zwischen der Fotokonvertierung und dem Beginn der Bildgebung für jeden Embryo verstrichen ist.

Überprüfen Sie gelegentlich das Experiment und überwachen Sie den Füllstand von Danielles Medium und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Beginnen Sie mit der visuellen Inspektion der Zeitverlaufsdatensätze von jedem Embryo. Verwerfen Sie Datensätze von Embryonen, die während der Bildgebung gestorben sind, sich signifikant verschoben haben, die ein sehr geringes Niveau an photokonvertierten Signalen aufweisen oder die Zellregionen enthalten, die ungewöhnlich aussehen und sich nicht mehr bewegen und teilen.

Mit dem Python-basierten Softwarepaket erstellt PI F DAP eine Maske unter Verwendung des Alexa 4 88-Signals, das streng intrazellulär ist. Um intrazelluläre und extrazelluläre photokonvertierte Signale zu trennen, wenden Sie die Maske auf das entsprechende Rotkanalbild an, um zu verhindern, dass intrazelluläre Pixel berücksichtigt werden. Wenn Sie die durchschnittliche extrazelluläre Intensität berechnen, um die durchschnittliche intrazelluläre Intensität zu messen, invertieren Sie die Maske, zeigen Sie die erzeugten maskierten Bilder an und überprüfen Sie sie visuell und verwerfen Sie Datensätze, in denen Masken den intrazellulären vom extrazellulären Raum nicht genau unterscheiden.

Verwenden Sie PI F DAP, um die durchschnittliche extrazelluläre und intrazelluläre Fluoreszenzintensität für jedes Bild zu berechnen. Passen Sie dann die Fluoreszenzdaten wie hier gezeigt gemäß den Richtlinien im Textprotokoll an und berechnen Sie das extrazelluläre und intrazelluläre Protein. Halbwertszeiten tau aus der Aufklärungsrate.

Constance K Schielen ist ein sezerniertes Protein, das die Expression von mis-endodermalen Genen während der Embryogenese von Zebrafischen induziert. In diesem Experiment wurden Embryonen mit Alexa 4 88 Dextran und mRNA, die für Squint DENDRA two kodiert, co-injiziert und dem F DAP-Assay unterzogen. Wie hier gezeigt, nimmt die Intensität des extrazellulären photokonvertierten Signals mit der Zeit ab.

Mit Hilfe von PI F dap wurden extrazelluläre Intensitätsprofile von 23 Embryonen erstellt und die Daten mit einem Clearance-Modell erster Ordnung versehen. Die Ergebnisse deuten auf eine durchschnittliche Halbwertszeit tau von 116 Minuten hin. Ähnliche Intensitätsprofile und Proteine.

Halbwertszeiten wurden erhalten, wenn die Intervalle zwischen den Bildgebungen 10 oder 20 Minuten betrugen. Dies deutet darauf hin, dass Photobleaching oder versehentliche Fotokonversion nicht signifikant zu den Intensitätsänderungen beigetragen haben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Fluoreszenzzerfall nach der Fotokonvertierung verwenden können.

Zur Messung in vivo. Halbwertszeiten von photokonvertierbaren Fusionsproteinen in lebenden Zebrafischembryonen.