Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorbiologie zu den Mikrometastasen bei Darmkrebspatienten zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen hochsensitiven Nachweis von Mikrometastasen ermöglicht, die durch GFP-markierte, von Patienten stammende Dickdarmkrebs-Organoide in den Mäusen induziert werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig sein kann, von Dickdarmtumor-Organoiden abgeleitete Mikrometastasen in entfernten Organen bei Mäusen zu erkennen.

Kosuke Mizukoshi und Yu Koyama, beide Doktoranden und Chirurgen aus meiner Gruppe, werden das Verfahren mit Yu Okazawa vorführen. Um menschliche Organoide für Darmkrebszellen zu erzeugen, geben Sie zunächst 150 Mikroliter künstliche extrazelluläre Matrix pro Vertiefung auf eine 12-Well-Platte auf Eis. Wenn alle Vertiefungen beschichtet sind, inkubieren Sie die Platte 30 bis 60 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius und 5 % CO2-Inkubator, um die Gele zu verfestigen.

Als nächstes resuspendieren Sie ein vom Patienten stammendes Tumor-Xenotransplantat-Zellpellet in frischem Darmkrebs-Organoid-Kulturmedium, das mit 5 % fötalem Kälberserum oder FCS ergänzt ist, um eine Konzentration von dreimal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter zu erreichen, und säen Sie einen Milliliter Zellen auf jede künstliche extrazelluläre Matrix. Bringen Sie die Zellen dann wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück. Am nächsten Morgen werden die Kulturüberstände, einschließlich der schwimmenden Zellen, vorsichtig in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, um sie zu zentrifugieren, und die Pellets in 70 Mikrolitern frischer künstlicher extrazellulärer Matrix auf Eis resuspendiert.

Um die Lebensfähigkeit von Darmkrebszellen zu erhöhen, überlagern Sie die schwimmende Tumorzelle mit künstlicher extrazellulärer Matrix zurück auf die mit künstlicher extrazellulärer Matrix beschichteten Wells und inkubieren Sie die Tumorzellkulturen 30 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator. Wenn sich das neue extrazelluläre Matrixgel verfestigt hat, füttern Sie die Kulturen mit einem Milliliter frischem organoiden Zellkulturmedium für Darmkrebs, das mit 1 %FCS ergänzt ist, und geben Sie die Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach sieben bis 10 Tagen Kultur lösen Sie die Organoide mechanisch mit einem sterilen Zellschaber ab und überführen Sie die Organoide zur Zentrifugation in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Anschließend werden die Pellets in 500 Mikrolitern PBS durch leichtes Klopfen für eine weitere Zentrifugation resuspendiert. Um die Darmkrebs-Organoide zu dissoziieren, geben Sie 500 Mikroliter proteolytische und kollagenolytische Enzymlösung in die Röhrchen und mischen Sie sie mit leichtem Klopfen. Geben Sie nach 10 Minuten bei Raumtemperatur 500 Mikroliter Medium, das mit 1% FBS ergänzt ist, zu den Zellen und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals sehr vorsichtig, um die Organoide aufzubrechen.

Das schonende Pipettieren von humanen CRC-Organoiden während der Verarbeitung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer intakten Sphäroidbildung in Kulturen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern 5-fachem GFP-Lentivirus-Stamm und 400 Mikrolitern frischem Darmkrebs-Organoid-Kulturmedium. Es ist wichtig, die humanen Darmkrebs-Organoide mit einem hohen Titer von GFP-Lentiviren zu infizieren, insbesondere um eine nahezu 100%ige Infektion mit Darmkrebs zu erreichen.

Passen Sie das Volumen in jedem Röhrchen an, um eine fünffache 10 bis fünf dissoziierte Tumorzellen pro 500 Mikroliter mittlerer Konzentration zu erreichen, und plättieren Sie 500 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer künstlichen, mit extrazellulärer Matrix beschichteten 12-Well-Platte, wie gezeigt. Nach 18 Stunden im Zellkultur-Inkubator werden die schwimmenden, zellhaltigen Überstände zur Zentrifugation in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, gefolgt von der Resuspension der Pellets in 70 Mikrolitern künstlicher extrazellulärer Matrix pro Röhrchen auf Eis. Um die Lebensfähigkeit der Darmkrebszellen zu verbessern, überlagern Sie die tumorzellhaltige künstliche extrazelluläre Matrix auf die Tumororganoide in der 12-Well-Platte und legen Sie die Platte für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.

Wenn sich die künstliche extrazelluläre Matrixbeschichtung verfestigt hat, füttern Sie die Kulturen mit einem Milliliter frischem CRC-Organoid-Kulturmedium, das mit 1 %FCS ergänzt ist, und stellen Sie die Zellen für drei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück. Beobachten Sie dann die infizierten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie, um eine nahezu 100%ige GFP-Positivität zu bestätigen, und bringen Sie die Zellen für weitere vier bis sechs Tage in den Inkubator zurück. Um ein Mausmodell für spontane Metastasen von von Darmkrebspatienten stammenden Tumor-Xenotransplantaten zu etablieren, die GFP-markierten Organoide wie demonstriert zu dissoziieren und die einzelnen Tumorzellsuspensionen fünfmal 10 auf die fünf Tumorzellen pro 50 Mikroliter PBS zu verdünnen, ergänzt mit einer Konzentration von 50 % künstlicher extrazellulärer Matrix.

Laden Sie 50 Mikroliter Zellen pro Maus in eine Spritze, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und legen Sie die Tumorzellen auf Eis. Bestätigen Sie als Nächstes, dass die Zehen nicht reagieren, und platzieren Sie die erste anästhesierte NOG-Maus in Rückenlage auf dem Labortisch. Ziehen Sie mit einer sterilen Pinzette die Rektumschleimhaut vorsichtig aus dem After und injizieren Sie die Tumorzellen sofort in die rektale Submukosa.

Um ein experimentelles Metastasenmodell von von Darmkrebspatienten abgeleiteten Tumor-Xenotransplantaten zu etablieren, verdünnen Sie die einzelnen Tumorzellsuspensionen in einer Konzentration von viermal 10 auf die vier Zellen pro 50 Mikroliter und laden Sie 50 Mikroliter Zellen pro Maus in eine Spritze, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Platzieren Sie die erste betäubte NOG-Maus in Bauchlage auf der Bank und machen Sie einen kleinen Schnitt im unteren Bereich der linken Flanke. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um das Bauchfell vorsichtig zu durchtrennen und die Milz freizulegen, und verwenden Sie die Pinzette, um das an der Milz haftende Fett zu greifen.

Injizieren Sie dann langsam 50 Mikroliter der Tumorzellsuspension in die Milz und achten Sie darauf, dass keine Leckage beobachtet wird. Nachdem alle Mäuse injiziert und bei Bedarf genäht wurden, bringen Sie die Tiere in ihre Heimatkäfige zurück und prüfen Sie einen Tag nach der Abgabe der Tumorzellen auf Nahtlecks und Lebensfähigkeit. Verwenden Sie Messschieber, um die Tumoren wöchentlich zu messen und die Primärtumoren und relevanten Gewebe bis zu den entsprechenden experimentellen Endpunkten zu entnehmen.

Übertragen Sie die präparierten Tumore und Organe in eine 10 Zentimeter große Petrischale auf Eis in fünf Milliliter eiskaltes PBS und beobachten Sie das präparierte Gewebe unter einem Stereofluoreszenzmikroskop, um ihre GFP-Expression zu beurteilen. Eine Darmkrebs-Organoid-Infektion mit GFP-Lentiviren führt, wie gezeigt, dazu, dass fast alle Organoide sehr helles GFP exprimieren. Die orthotope und intrasplenische Injektion der GFP-markierten Organoide in sekundäre NOG-Empfängermäuse zeigt die Bildung von GFP-positiven Primärtumoren an der orthotopen Stelle sowie in der Lunge der Mehrzahl der untersuchten Mäuse 2,5 Monate nach der Injektion.

Mehr Lebermetastasen werden bei NOG-Empfängertieren einen Monat nach der intrasplenischen Injektion beobachtet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Mikrometastasen von GFP-markierten menschlichen Darmkrebszell-Organoiden nach ihrer Einführung in Empfängermäuse nachgewiesen werden können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Tumor- und Metastasen-Homing-Effizienz von menschlichen Dickdarmkrebszell-Organoiden bei Mäusen weitgehend von der interpatientischen Variabilität der ursprünglichen Tumorzellen abhängt.