Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, drei Kompartimente des Wurzelmikrobioms, des Bodens, der Rhizosphäre und der Wurzelendosphäre, unter Verwendung von Community-Profiling des ribosomalen 16S-RNA-Gens zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der mikrobiellen Ökologie zu beantworten, wie z. B. die biotischen und abiotischen Faktoren, die die wesentlichen Treiber der Mikrobiomstruktur sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie jeden Schritt standardisiert, von der Trennung von Wurzel und Rhizosphäre über die DNA-Extraktion bis hin zur Vorbereitung einer Sequenzierungsbibliothek.

Dieses Verfahren wird von Tuesday Simmons, einer Doktorandin im Coleman-Derr-Labor, demonstriert. Zu Beginn des Protokolls werden Bodenproben in großen Mengen mit einem ethanolsterilisierten Bodenkernsammler entnommen, um einen Boden zu erhalten, der frei von Pflanzenwurzeln ist. Sammle einen Kern etwa 23 bis 30 Zentimeter von der Basis der Pflanze entfernt.

Füllen Sie dann den Boden in eine Plastiktüte um, homogenisieren Sie den Boden durch leichtes Schütteln des Beutels, geben Sie ein 600-Milligramm-Aliquot der Bodenprobe in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und legen Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen sofort bis zur DNA-Extraktion auf Trockeneis. Um die Wurzel und die Rhizosphäre zu sammeln, graben Sie die Pflanze mit einer mit Ethanol sterilisierten Schaufel aus und achten Sie darauf, so viel wie möglich von der Wurzel zu erhalten. Schütteln Sie überschüssige Erde vorsichtig von den Wurzeln ab, bis etwa zwei Millimeter Erde an der Wurzeloberfläche haftet.

Bei großen Pflanzen schneide mit einer sterilen Schere einen repräsentativen Unterabschnitt der Wurzeln ab und gib mindestens 500 Milligramm Wurzelgewebe in ein konisches 50-Milliliter-Fläschchen. Fügen Sie genügend Epiphytenentfernungspuffer hinzu, um die Wurzeln zu bedecken, und legen Sie die Probe sofort auf Trockeneis. Um die Rhizosphäre von den Wurzeln zu trennen, tauen Sie die Wurzelprobe auf Eis auf und beschallen Sie dann die Wurzelproben.

Übertragen Sie die Wurzeln mit einer sterilen Pinzette in ein gekühltes, sauberes 50-Milliliter-Röhrchen. Entsorgen Sie das Originalrohr nicht mit Puffer und Erde. Diese enthält die Rhizosphärenfraktion.

Zentrifugieren Sie anschließend das Röhrchen mit dem Puffer und der Rhizosphäre. Dekantieren Sie den Überstand und legen Sie die Rhizosphärenfraktion in Trockeneis. Um die Wurzeln zu waschen, geben Sie etwa 20 Milliliter steriles Wasser mit vier Grad Celsius in die Wurzelfraktion.

Waschen Sie die Wurzel, indem Sie sie 15 bis 30 Sekunden lang kräftig schütteln, dann lassen Sie das Wasser ab. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um schnell 250 Milligramm Erde und Rhizosphäre in separate Entnahmeröhrchen zu überführen, die in einem kommerziellen DNA-Isolationskit für die Bodenextraktion enthalten sind, und fahren Sie dann mit dem Protokoll des Kit-Lieferanten fort. Lagern Sie die DNA nach der Elution bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die Vorbereitung der Amplikonbibliothek bereit ist, und extrahieren Sie dann die DNA aus den Wurzelproben.

Kühlen Sie einen sterilisierten Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff. Messen Sie 600 bis 700 Milligramm Wurzelgewebe ab, geben Sie das Gewebe in den Mörser und fügen Sie vorsichtig so viel flüssigen Stickstoff hinzu, dass die Wurzeln bedeckt sind. Die Wurzeln in kleine Stücke mahlen.

Setzen Sie den Prozess der Zugabe von flüssigem Stickstoff und des Mahlens mindestens zweimal fort, wobei Sie zwischen den Proben konsistent sind, bis die Wurzeln ein feines Pulver sind. Schnell, bevor das Wurzelpulver aufzutauen beginnt, das Wurzelpulver mit einem sterilen Spatel in vorgewogene 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis umfüllen. Notieren Sie das Gewicht der Tube und des Pulvers.

Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um schnell 150 Milligramm Wurzelpulver in das Sammelröhrchen zu überführen, das im kommerziellen DNA-Isolationskit für die Extraktion aus dem Boden enthalten ist, und fahren Sie dann mit der DNA-Isolierung unter Verwendung des Protokolls des Kit-Lieferanten fort. Bereiten Sie ausreichend PCR-Mastermix vor, um jede DNA-Probe in dreifacher Ausfertigung zu amplifizieren. Gießen Sie den Mastermix in ein steriles 25-Milliliter-Mehrkanalpipettenreservoir und verteilen Sie 66 Mikroliter Mastermix in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte.

Fügen Sie als Nächstes sechs Mikroliter von fünf Nanogramm DNA pro Mikroliter von der normalisierten DNA-Platte in die Master-Mix-Platte hinzu. Geben Sie dann 1,5 Mikroliter 10 Mikromolare Vorwärtsprimer in die Masterplatte, sodass jede Spalte einen anderen Vorwärts-Barcode hat, und 1,5 Mikroliter 10 Mikromolar Reverse Primer, so dass jede Zeile einen anderen Rückwärts-Barcode hat. Decken Sie die Platte mit Folie ab und schleudern Sie die Platte kurz bei 3.000 RCF herunter.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Inhalt vorsichtig zu mischen, teilen Sie ihn dann auf drei Platten mit 25 Mikrolitern Reaktionsgemisch auf und decken Sie die Platten mit PCR-Film ab. Amplifizieren Sie die DNA in jeder Platte mit einem Thermocycler. Nach der Amplifikation fassen Sie die drei Replikationsplatten in einer einzigen 96-Well-Platte zusammen.

Berechnen Sie mit Hilfe einer Computertabelle das Volumen von 100 Nanogramm jeder Probe sowie das durchschnittliche Volumen für alle Proben. Geben Sie für jedes Blanko-PCR-Produkt das berechnete durchschnittliche Volumen in ein einzelnes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Für die erfolgreich amplifizierten Proben werden 100 Nanogramm jeder Probe in dasselbe Röhrchen gepoolt, dann die Konzentration des gepoolten Produkts mit einem Tischfluorometer gemessen und 600 Nanogramm DNA in molekularem Wasser auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen eluiert.

Lagern Sie das restliche gepoolte Produkt bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie vor der Reinigung des 600-Nanogramm-DNA-Aliquots 600 Mikroliter frisches 70%iges Ethanol vor. Befolgen Sie den etablierten PCR-Aufreinigungsprozess mit paramagnetischen Kügelchen.

Schütteln Sie die Tube mit den magnetischen Kügelchen, um die Kügelchen, die sich am Boden absetzen, wieder aufzuhängen. Fügen Sie 1x Volumen, 100 Mikroliter, Bead-Lösung zu dem 600-Nanogramm-Aliquot der DNA hinzu. Mischen Sie die Lösung und die Kügelchen gründlich, indem Sie sie 10 Mal pipettieren.

Nach gründlichem Mischen die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Röhrchen für zwei Minuten oder bis die Lösung klar ist, auf den Magnetständer, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen. Lassen Sie das Rohr im Ständer, saugen Sie den durchsichtigen Überstand vorsichtig an, ohne die Magnetperlen zu berühren, und entsorgen Sie ihn.

Lassen Sie die Tube im Ständer, geben Sie 300 Mikroliter 70%iges Ethanol in die Tube und inkubieren Sie die Kügelchen 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Saugen Sie das Ethanol ab und entsorgen Sie es. Wiederholen Sie diesen Vorgang und entfernen Sie nach der zweiten Wäsche das gesamte Ethanol

Nehmen Sie die Tube vom Magnetständer und trocknen Sie den Inhalt fünf Minuten lang an der Luft. Geben Sie 30 Mikroliter molekulares Wasser zu den getrockneten Kügelchen und mischen Sie sie, indem Sie sie 10 Mal pipettieren. Zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Stellen Sie das Röhrchen für eine Minute wieder auf den Magnetständer, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen. Übertragen Sie das Eluat in ein neues Röhrchen. Messen Sie die Endkonzentration der gereinigten, gepoolten DNA mit einem Tisch-Fluorometer.

Ein Aliquot wird auf 10 Nanomolar in einem Endvolumen von 30 Mikrolitern oder auf die von der Sequenziereinrichtung bevorzugte Konzentration und das von der Sequenziereinrichtung bevorzugte Volumen verdünnt. Im Anschluss an den Amplifikationsschritt wurde eine Sequenzierung durchgeführt, um die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft jeder Probe zu bestimmen. Ein Abgleich der PNA-Sequenz mit jedem Chloroplasten und mitochondrialen 16S-ribosomalen RNA-Gen für den untersuchten pflanzlichen Wirt sollte keine Diskrepanzen aufzeigen.

Eine einzige Fehlanpassung an die 13-Basenpaar-PNA-Sequenz kann die Wirksamkeit drastisch reduzieren, wie im Fall der bereitgestellten Chloroplasten-PNA-Sequenz und des Chloroplasten 16S ribosomalen RNA-Gens von Lactuca sativa oder Salat. Da pro Probe die gleiche Menge an amplifizierter DNA gepoolt wurde, wurde nach der Sequenzierung eine gerade Anzahl von Reads, die mit bakteriellen Taxa übereinstimmen, pro Probe erhalten, sortiert nach ihrem Barcode-Index. Einmal gemeistert, kann diese Technik für acht Pflanzen in etwa acht Stunden durchgeführt werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, zwischen den Experimenten konsistent zu sein. Kleine Details wie Änderungen der DNA-Extraktionsmethode und des PCR-Mastermixes können zu Verzerrungen führen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Metatranskriptomik verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Mikroben aktiv sind und welche Gene sie exprimieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA getroffen werden sollten.