Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Boden-, Rhizosphären- und Wurzelendosphären-Mikrobioms zu beantworten, z. B. wie sich die Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaft als Reaktion auf den Probentyp, die Behandlung und den Pflanzengenotyp verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sich gut für Feldexperimente eignet, die eine große Stichprobenzahl und Replikation erfordern. Das Verfahren wird von mir und Stephanie Futrell, einer Doktorandin und Forschungstechnikerin aus meinem Labor, demonstriert.

Um das Protokoll zu beginnen, beschriften Sie eine Waschwanne und einen Eimer mit einem Haftnotizzettel mit Details zur Pflanzenprobe. Tragen Sie den beschrifteten Eimer zur Parzelle und lassen Sie die Waschpfanne am eingerichteten Arbeitsplatz auf dem Feld. Wählen und sammeln Sie zufällig zwei Pflanzen pro Parzelle aus verschiedenen Bereichen innerhalb der Parzelle.

Stechen Sie dann mit einer Schaufel bis zu einer Tiefe von 30 Zentimetern in die Erde, um alle Seitenwurzeln abzuschneiden, die die Pflanze in der Erde halten. Graben Sie die Pflanzenwurzeln mit der Schaufel aus und legen Sie den Wurzelballen in den beschrifteten Eimer. Bringen Sie die Schaufel zurück zum Arbeitsplatz im Feld.

Schütteln Sie die Wurzeln und verwenden Sie einen Spaten oder eine Handhacke, um Erde von den Wurzeln zu entfernen. Tragen Sie Handschuhe und platzieren Sie die Wurzeln in der Nähe der Verarbeitungsstation. Nach dem Schütteln der Wurzeln die Erde in der Waschpfanne mischen und die Erdklumpen mit einer Handhacke aufbrechen.

Legen Sie eine Probe der Erde, die frei von Schmutz ist, in eine beschriftete, 17,7 x 19,5 Zentimeter große Aufbewahrungstasche mit Reißverschluss und legen Sie sie auf Eis. Sterilisieren Sie die Gartenschere in 70% Ethanol. Verwenden Sie die sterile Schere, um eine Vielzahl von Wurzeln zu schneiden, etwa vier bis sechs Wurzeln pro Pflanze und jede Wurzel etwa neun bis 12 Zentimeter lang.

Geben Sie die herausgeschnittenen Wurzeln in ein beschriftetes 50-Milliliter-Röhrchen mit 35 Millilitern autoklaviertem Phosphatpuffer mit einem Tensid wie Silwet L-77. Schütteln Sie die Röhren zwei Minuten lang, um die Rhizosphäre von der Oberfläche der Wurzeln freizusetzen. Verbessern Sie das Schütteln mit einem Generator und einem Vortexer.

Entfernen Sie mit einer Pinzette, die in 70%igem Ethanol sterilisiert ist, die Wurzeln aus der Tube, tupfen Sie sie kurz auf Küchenpapier ab und legen Sie sie in eine neue, beschriftete 50-Milliliter-Tube. Legen Sie sowohl die Röhre mit der Rhizosphäre als auch die mit den Wurzeln auf Eis. Geben Sie etwa 35 Milliliter 50 % Bleiche plus 0,01 % Tween 20 in die 50-Milliliter-Röhrchen mit den auf dem Feld gesammelten Wurzeln.

Wirbeln oder schütteln Sie die Röhrchen 30 bis 60 Sekunden lang. Gießen Sie das Bleichmittel ab, fügen Sie 35 Milliliter 70%iges Ethanol hinzu und wirbeln oder schütteln Sie die Wurzeln weitere 30 bis 60 Sekunden lang. Gießen Sie nach dem Schütteln das 70%ige Ethanol ab und fügen Sie 35 Milliliter steriles Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie die Probe eine Minute lang vor oder schütteln Sie sie.

Wiederholen Sie den Spülschritt mit Wasser noch zwei Mal, sodass die Wurzel insgesamt drei Spülungen mit sterilem Reinstwasser erhält. Tupfen Sie die Wurzeln auf trockene, saubere Papiertücher und verwenden Sie für jede Probe ein sauberes Papiertuch. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sterilen Pinzette und einer Gartenschere in etwa fünf Millimeter große Stücke, legen Sie die abgeschnittenen Wurzeln in ein sauberes, beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius.

Schütteln Sie die 50-Milliliter-Röhrchen mit Rhizosphärenproben aus dem Feld 20 bis 30 Sekunden lang, um die gesamte Probe wieder zu suspendieren. Filtrieren Sie die resuspendierte Probe mit einem sterilen 100-Mikron-Netz-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen bei 3.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Den Überstand sofort abgießen und entsorgen. Legen Sie die Rhizosphären-Pellets in die 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter sterilen Phosphatpuffer ohne Tensid zu den Rhizosphärenpellets und wirbeln Sie sie vortexen, um die Probe wieder zu suspendieren.

Pipettieren Sie die suspendierte Flüssigkeit in ein sauberes, beschriftetes Zwei-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Die Tuben bei 15.871 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur drehen. Gießen Sie den Überstand sofort ab und lassen Sie die Schläuche auf sauberen Papiertüchern abtropfen.

Lagern Sie die Pellets bis zur Weiterverarbeitung bei minus 20 Grad Celsius. Füllen Sie mit einem sterilen Metallspatel ein sauberes, beschriftetes Zwei-Milliliter-Röhrchen mit etwa drei Gramm Erde für die DNA-Extraktion und vermeiden Sie kleine Wurzelstücke und Ablagerungen. Spülen Sie den Metallspatel zwischen jeder Probe mit 70 % Ethanol ab.

Lagern Sie diese Bodenprobe bei minus 20 Grad Celsius. Leeren Sie den Beutel mit der Erde in einer sauberen Waschpfanne in gestapelte Siebe, wobei das größere Sieb auf dem kleineren Sieb liegt, und sieben Sie die Erde manuell durch beide Siebe. Verwenden Sie eine Bürste, um die Siebe zwischen den Proben vorsichtig zu reinigen.

Legen Sie 100 bis 125 Gramm gesiebte Erde in einem 17,7 x 19,5 Zentimeter großen Reißverschlussbeutel für zukünftige physikalisch-chemische und Texturanalysen des Bodens beiseite. Stellen Sie die Säcke mit Erde bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung ein. Gießen Sie dann flüssigen Stickstoff mit sauberen Spachteln und in einen sauberen Mörser.

Legen Sie das gefrorene Taschentuch in den Mörser und zerkleinern Sie es mit dem Stößel zu einem feinen Pulver. Fügen Sie während des Mahlens kontinuierlich flüssigen Stickstoff hinzu, um die Proben eingefroren zu halten. Übertragen Sie das gemahlene Gewebe mit einem Spatel in ein sauberes, beschriftetes Zwei-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie das Gewebe dann bei minus 80 Grad Celsius.

Wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol und 1 % Haushaltsbleiche ab. Entnehmen Sie die Bodenproben aus dem bei minus 20 Grad Celsius warmen Lager und tauen Sie sie in einem Eiskübel auf. Entfernen Sie die Abdeckung der Dichtungsmatte von einer 96-Well-Extraktionsplatte und legen Sie die Abdeckung zwischen zwei Papiertücher, um sie bei Nichtgebrauch sauber zu halten.

Decken Sie die 12 Säulen der Platte mit selbstklebenden 8-Well-PCR-Streifen ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Fassen Sie einen sterilen, kleinen Wiegetrichter auf eine Waage und wiegen Sie 200 bis 250 Milligramm Erde ab. Heben Sie den Klebestreifen vorsichtig an, legen Sie den Hals des gefüllten Wiegtrichters in die entsprechende Vertiefung und führen Sie die Bodenprobe vorsichtig in die entsprechende Vertiefung.

Bringen Sie den Klebestreifen wieder an, um die Vertiefung abzudecken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung und verwenden Sie für jede Probe einen neuen sterilen Trichter. Bringen Sie die Abdeckung der Dichtungsmatte wieder auf die Extraktionsplatte und lagern Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die DNA-Extraktion bereit ist.

Entnehmen Sie die Rhizosphärenproben aus dem bei minus 20 Grad Celsius warmen Lager und tauen Sie sie in einem Eiskübel auf. Bereiten Sie die DNA-Extraktionsplatte wie im vorherigen Abschnitt voran vor. Legen Sie ein sauberes Papiertuch auf eine Waage und tarieren Sie dann einen sterilen Metallspatel auf der Waage.

Schöpfen Sie mit dem Spatel vorsichtig einen Teil des Rhizosphären-Pellets aus einem Probenröhrchen heraus. Wiegen Sie zwischen 200 und 250 Milligramm der Rhizosphärenprobe. Heben Sie den Klebestreifen vorsichtig an, um die erste Vertiefung der Extraktionsplatte freizulegen.

Winkeln Sie den gefüllten Spachtel in die Vertiefung an und kratzen Sie das Rhizosphärenmaterial mit einem sterilen Zahnstocher in die entsprechende Vertiefung ab. Spülen Sie den Metallspatel mit Wasser ab, gefolgt von 70 % Ethanol zwischen den Proben. Wiederholen Sie diesen Vorgang abschließend für jede Vertiefung der Platte, bis die Platte gefüllt ist, und lassen Sie eine Vertiefung als Extraktionsblindkontrolle leer

In diesem repräsentativen Datensatz gab es hochsignifikante Unterschiede zwischen den Probentypen, und die Rhizosphäre und der Boden scheinen sich in ihrer Zusammensetzung ähnlicher zu sein als die Wurzel. Weitere Analysen zeigen, dass es auch hochsignifikante Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Rhizosphäre und Boden gab. Die Alpha-Diversitätsanalyse zeigt, dass die mikrobiellen Gemeinschaften in der Endosphäre geringer waren als die Gemeinschaften im Boden und in der Rhizosphäre.

Der einzige signifikante Unterschied in der Diversität zwischen den Grasarten bestand zwischen den Endosphärenproben von großem Blaustängel und Rutenhirse. Die relative Abundanzanalyse unterstreicht die Dominanz von Proteobakterien, gefolgt von Actinobakterien in allen Probentypen. Boden und Rhizosphäre werden von Acidobakterien und Chloroflexi dominiert, während die Wurzeln eine größere relative Abundanz an Bacteriodeten aufwiesen.

Die PERMANOVA-Analyse aller Probentypen ergab einen hochsignifikanten Unterschied in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft aufgrund der Pflanzenarten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Reihe von Schritten durchführen, die bei der Untersuchung von Boden-, Endosphären- und Rhizosphären-Mikrobiomen verwendet werden können. Wir danken dem Nebraska EPSCoR und der National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 für die teilweise Finanzierung dieses Lehrvideos.