Name: Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Erfahren Sie standardisierte Methoden zur Isolierung und Analyse mikrobieller Lebensgemeinschaften aus Boden, Rhizosphäre und Wurzeln. Diese Protokolle ermöglichen reproduzierbare Feldexperimente zur Untersuchung von Pflanze-Mikrobe-Interaktionen.

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Die Entwicklung dieser Handschrift wird von der National Science Foundation EPSCoR Center für Root und Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417 unterstützt. Die Datenerhebung wurde mit Mitteln von der University of Nebraska-Lincoln, landwirtschaftliche Forschung und Entwicklung und durch einen Zuschuss von Hatch USDA unterstützt. Wir anerkennen auch Unterstützung von der USDA-ARS und wurde unterstützt vom Agriculture and Food Research Initiative wettbewerbsfähige Grant Nr. 2011-68005-30411 vom USDA nationalen Institut für Lebensmittelwissenschaften und Landwirtschaft zu etablieren und diese Felder zu verwalten.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Manuskript beschriebenen Methoden sollten Wissenschaftler gelangen Sie bequem das Feld von Boden und Pflanze Metagenomik aktivieren. Im Laufe der Jahre haben wir unsere Methoden verfeinert, seit Durchführung des Experiments in diesem Manuskript beschrieben. Eine Änderung ist, dass wir nun Röhren Pre-label vor dem ausgehen zu Feld zu probieren. Unser Labor verwendet ein Barcode-System und einem Etikettendrucker. Der Etikettendrucker spart nicht nur Zeit, Kennzeichnung Röhren, aber auch macht alles leichter zu verfolgen und zu Proben ohne den Launen der menschlichen Hand schreiben korrekt zu identifizieren. Ein weiterer kritischer Punkt ist, dass wir versuchen, das Material nach bringt es wieder aus dem Feld so schnell wie möglich bearbeiten. Unser Ziel ist es Gefrieren des Bodens für die DNA-Analyse, sterilisieren und frieren die Wurzeln und Filtern und Einfrieren der Rhizosphäre innerhalb von 12 bis 36 Stunden nach der Rückkehr aus dem Feld. Die DNA-Extraktionsverfahren sind langwierig mit vielen Schritten, vor allem für Boden und Rhizosphäre, also kauften wir einen Roboter (Kingfisher Flex, ThermoFisher), das minimiert die Hände auf Zeit für die DNA-Extraktion-Protokolle, reduziert menschliches Versagen, das eingeführt werden kann, Verbesserung der Konsistenz in der Art und Weise verschiedene Chargen von Erde, Wurzeln oder Rhizosphäre werden verarbeitet. Beim Arbeiten mit Pflanzenmaterial ist es wichtig zu entscheiden, der Stammtyp untersucht werden oder eine Vielzahl von Wurzel-Typen zu einer "repräsentativen" zu nehmen. Wurzeln und Blätter in gefrorenem Zustand bei der Durchführung der DNA Extraktionen ist wichtig, da sichergestellt ist, dass es keine Kreuzkontamination zwischen Proben beim 96-Well DNA Extraktion Platten zu füllen. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Anzahl der Wiederholungen beim Feld Versuchsplanung und mit einer kompletten Design randomisiert soweit möglich zu verwendende26. Aufgrund der hohen Feld Variabilität kann es notwendig, eine große Anzahl von Wiederholungen, kleine Unterschiede zu erkennen sein. Schließlich aus unserer Erfahrung ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Böden nicht zu nass sind, wenn die Wurzeln ausgraben. Wenn die Boden wassergesättigt ist nicht nur chaotisch, mit zu arbeiten, aber es ist auch sehr schwierig, die Rhizosphäre zu definieren und die Erde von den Wurzeln zu entfernen.
Eine Änderung, die früh während der Entwicklung dieser Methoden gemacht wurde wurde in Bezug auf statt schütteln die Röhren von hand um die Rhizosphäre zu lösen, die wir ein zu Vortexers angetrieben von einem Gasgenerator Upgrade, der Arbeit in Feld und vieles mehr erleichtern standardisiert. die Zeit und die Art und Weise, dass jedes Rohr aufgeregt war. Eine Einschränkung des Amplikons Sequenzierung Ansatzes ist, dass die taxonomische Auflösung der Ergebnisse oft begrenzt ist und viele OTUs unbekannt oder nur bekannte Ebene der Familie oder Gattung sind. Dieser Bereich der Forschung ist rasant, so ist es wichtig, sich bewusst neue und sich entwickelnde Ansätze, vor allem für die Datenanalyse, die die Auflösung der Ergebnisse verbessern können.
Diese Protokolle sind nur für das Studium nicht Pilze, Bakterien und Archaeen. Die Verwendung von verschiedenen Grundierungen für Verstärkung ermöglicht die Untersuchung von pilzgemeinschaften mit der gleichen DNA-Proben27,28. Diese Methoden erfordern nicht den Kauf von großen Mengen von Ausrüstung, da die Verfahren vereinfacht werden können. Die Methoden, die wir beschreiben hier sind vor allem für die Bestimmung, "Wer ist da", aber das Feld ist schnell weiterentwickelt, in wichtigen Fragen zu Funktion, die angegangen werden kann, mit Schrotflinte sequenziermethoden, Isolierung und testen die Funktionalität der Mikroben, oder ganze mikrobielle Genome Sequencing.
Die repräsentativen Ergebnisse unterstreichen die Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaften, die mit den beschriebenen Methoden identifiziert werden können. Mit einem Beta-Diversität Ansatz um die Daten-Analyse-22, wurden kompositorischen Unterschiede zwischen Probentypen gezeigt. Dieser Unterschied in den meisten anderen Studien, wo Endosphere, Rhizosphäre und des Bodens enthalten einzigartige mikrobieller Gemeinschaften3,deutlich beobachtet worden. Die Shannon-Vielfalt-Index wurde berechnet, um die Fülle und Gleichmäßigkeit der mikrobielle Artenvielfalt innerhalb jedes Pflanzenarten in der Endosphere, der Rhizosphäre und Boden bestimmen. In dieser Studie und in vielen anderen gezeigt, dass alpha-Diversität in den Boden, in der Rhizosphäre leicht rückläufig und verringert dann deutlich in der Endosphere3,5,29am höchsten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hier beschriebenen Methoden zur Identifizierung von kompositorischer Änderungen in der Endosphere, der Rhizosphäre und Boden geeignet sind.
Die Dominanz der Proteobakterien ist ein häufiger Befund in Studien über Endosphere und Boden30,31,32. Endosphere hat im Allgemeinen eine geringere Vielfalt an mikrobielle Spezies mit einem höheren relativen Reichtum an der Proteobakterien. Dies zeigt erneut, dass die Ergebnisse repräsentativ für andere Befunde in der Literatur sind. Die behandlungseffekte in dieser Studie waren nicht signifikant unterschiedlich und zwei Hauptgründe dafür können sein, dass die Unterschiede auferlegt durch die Behandlungen nicht groß genug, um ausreichend Variation erkennen zu generieren und diese Auswahl geschah, am Ende der Vegetationsperiode, wenn die Felder gehabt haben ausreichend Zeit, ziehen Sie den Stickstoff auf das Niveau, das ist, was am Ende der Saison gemessen wurde. In einer weiteren Studie mit ähnlichen Befruchtung Raten über einen längeren Zeitraum hinweg waren nur relativ kleine Änderungen in der Zusammensetzung der das Mikrobiom gemessenen33. Andere Studien haben Änderungen in Pilz- und bakteriellen Gemeinschaften durch Stickstoff-Dünger-34,-35gezeigt.
Pflanzenarten sind bekannt, eine Rolle bei der Bestimmung ihrer mikrobiome3,32,36 spielen und auch kleine Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaft Variation zwischen verschiedenen Genotypen innerhalb nachgewiesen haben eine einzelne Arten37. In dieser Studie wurde ein signifikanter Unterschied in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Pflanzenarten gefunden. In alle Probentypen schien es, dass Rutenhirse die markanteste mikrobiellen Zusammensetzung hatten, aber Unterschiede zwischen den Arten nur statistisch signifikant in der Endosphere waren. Rhizosphäre Zusammensetzung kann geworden sind, von Bedeutung, wenn mehr Wiederholungen für Analysen zur Verfügung standen.
Die kombinierten Feld, Labor und analytische Protokolle hier beschriebenen bieten einer leistungsfähigen Methode für das Studium wie verschiedene Faktoren Einfluss die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften in Böden, Rhizosphäre und die Endosphere der Wurzeln36. Es gibt viel Arbeit im Bereich der mikrobiome, insbesondere in landwirtschaftlich genutzten Feldern zu studieren. Wichtige Fragen wie Erträge durch den Boden Microbiome verändert werden sind noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Selbst die grundlegendsten Fragen wie Fruchtfolgen beeinflussen den Boden Mikrobiom, wie Timing das Mikrobiom verändert, wie abiotischem Stress verändert das Mikrobiom wie Bodenart interagiert mit diesen Faktoren, das Mikrobiom zu ändern, und ob es gibt universelle Mikroben in bestimmten Kulturen und Regionen der USA sind alle offenen Fragen. Diese Methoden werden auch nützlich für epidemiologische Studien, die Präsenz und die Persistenz von pathogenen und nützlichen Bakterien zu identifizieren. Eine weitere zukünftige Horizont für diese Methoden werden zu starten, die mit Pflanzen und Mikroben RNA und Metabolit Daten hier beschriebenen DNA-Methoden zu integrieren. Zusätzliche Verbesserung und Erprobung von mehr Variablen werden wichtig für die weitere Optimierung dieser Protokolle.

Microbiome Forschung hat wichtige Implikationen für verstehen und Bearbeiten von Ökosystemprozessen wie Nährstoff Radfahren, organischer Umsatz, und die Entwicklung oder Hemmung der Boden Krankheitserreger1,2. Dieser Bereich der Forschung birgt auch ein großes Potenzial für das Verständnis der Auswirkungen von Bodenmikroben auf die Produktivität der natürlichen Pflanzengesellschaften und Agrarökosystemen. Zwar gibt es viele Studien, die auf dem Boden Microbiome in natürlichen Ökosystemen konzentriert haben, haben weniger auf Pflanze Rhizosphäre und Endosphere Mikroben in Agrarökosystemen3konzentriert. In Nebraska dominiert Landwirtschaft die Landschaft in weiten Teilen des Staates, so dass die Studien dieser Böden landwirtschaftlich wichtige Nutzpflanzen angebaut wo ein wichtiges Thema für die Forschung. Diese Methodenpapiers soll Forscher bieten eine Reihe von Protokollen, die Mikroben in Agrarökosystemen, präsent zu beschreiben, um festzustellen, wie die Pflanzenwurzeln mikrobiellen Gemeinschaften in der Rhizosphäre und Endosphere und schließlich ändern verstehen Sie die Funktionen, die diese Mikroben in gesundheitspolizeilicher und pflanzenschutzrechtlicher Bodenproduktivität zu spielen.
Die hier vorgestellte Methode unterscheidet sich geringfügig von den Methoden, die von anderen Benutzern4,5 , dass dieses Papier gerichtet ist, zu lernen, welche Mikroben sind ausschließlich im Inneren der Wurzel und wie sie sich unterscheiden von den Mikroben sofort außerhalb der Wurzel in der Rhizosphäre. Die Amplifikate Sequenzierung in dieser Studie verwendeten weist die mikrobielle Taxa in die DNA-Probe gefunden und ermöglicht die Ermittler zu bestimmen, wie die Gemeinden je nach Probentyp oder Behandlung ändern. Einer der Hauptunterschiede zwischen dieses Protokoll und ein sehr ähnliches Protokoll von Lundberg Et Al. verwendet 6 ist, dass anstelle von Beschallung, dieses Protokoll Oberfläche Sterilisation mit Bleichmittel und Ethanol verwendet, um die Rhizosphäre von den Wurzeln zu entfernen. Andere haben auch effektiv Oberfläche Sterilisation verwendet7,8,9,10. Diese Methoden sind nicht günstiger als andere Methoden, aber etwas anders. Diese Methoden eignen sich besonders gut für große Feldversuche, denn mit genügend Leute es möglich ist, über 150 Feld-Handlungen pro Tag, bis zu ca. 450 Proben, wenn in Endosphere, Rhizosphäre und Boden partitioniert fügt zu verarbeiten. Dieses Manuskript beschreibt im Detail die Methoden zur Probe im Feld, verarbeiten das Material im Labor, zu extrahieren und die DNA-Sequenz, und bietet eine kurze Übersicht über die Schritte, die Sequenzierungsdaten zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>Extraktionsset für Boden und Rhizosphäre</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4</td><td>Extraktionsset für Wurzeln</td></tr><tr><td>D-Handle Grabschaufel, 101 cm L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Tiller, 40 cm L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>Ziploc Bags, 17,7 cm x 19,5 cm</td><td>Ziploc</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Kühler</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Waschwanne</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Plastikeimer</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe (Arbeit und Labor)</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>20 cm Durchmesser Erdsieb #8, 2360 &mu; m Maschenweite</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>Erdsieb mit 20 cm Durchmesser #4, 4750 &mu; m Maschenweite</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td>tragbarer Generator</td><td>Marke Honda funktioniert gut</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Zellsiebe 100 &mu; m Maschenweite</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td><td>Tensidautoklaven</td></tr><tr><td></td><td>Alle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA-Trockenöfen</td><td>Alle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA-Waagen</td><td>Alle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleichmittel</td><td>CLOROX - Haushaltsstärke</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Alle</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td>Alle</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Trockeneispellets</td><td>Alle</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Alle</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>11 cm Präzisionspinzette mit feiner Spitze</td><td>Fisher</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18 cm Zange mit gerader Spitze</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>13,5 cm Gartenschere</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Röhrchen</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>15 mL PP konisches Röhrchen</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP konisches Röhrchen</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, Q-POD</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Für die DNA-Quantifizierung von entnommenen Proben</td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Für die DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>96-Well Schwarz mit durchsichtigen flachen Bodenplatten</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>Genomische DNA aus der mikrobiellen Scheingemeinschaft B (auch niedrige Konzentration) v5.1L, für 16s rRNA Gensequenzierung</td><td>BEI Resources</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>Klebstoff 8 Well-Streifen für Platten</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlkügelchen, 3,2 mm Durchmesser</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Assay-Block (DNA-Extraktionsplatte für den Qiagen/MoBio Dneasy </td><td>CoStar</td><td>3959</td><td></td></tr><tr><td>antistatischer PP-Wiegtrichter, Größe klein für Boden/Rhizosphäre</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>antistatischer PP-Wiegtrichter, Größe x-klein für Wurzel/Blatt</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Adapter für 50 mL Röhrchen</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>Mörser (100 mL) und Stößel</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metall-Mikrospatel</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>Antistatische Einweg-Mikroskopspatel</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>Braune Papiertüte 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)</td><td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 Zentrifuge für 2 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge für 96-Well-Platte</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor für 50 mL Röhrchen</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA-Polymerase</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und analyse der mikrobiellen lebensgemeinschaften im boden, rhizosphäre und wurzeln in mehrjährige grass experimente

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Pflanzen- und Bodenproben Microbiome Studien werden immer wichtiger für das Verständnis spielen die Rollen Mikroorganismen in der landwirtschaftlichen Produktivität. Dieses Manuskript soll geben Sie Details wie schnell Boden, Rhizosphäre und Endosphere von replizierten Feldversuche und analysieren Sie Veränderungen, die bei der mikrobiellen Gemeinschaften aufgrund Probenart, Behandlung und Pflanze Genotyp auftreten. Das Experiment verwendet, um diese Methoden zu veranschaulichen besteht aus replizierten Feld-Handlungen mit zwei reinen, warmen Jahreszeit Gräser (Panicum Virgatum und Andropogon Gerardii) und eine niedrig-Vielfalt Grasmischung (A. Gerardii, Sorghastrum Nutans, und Bouteloua Curtipendula). Kurz, Pflanzen ausgegraben, eine Vielzahl von Wurzeln schneiden in Phosphatpuffer gelegt und dann geschüttelt, um die Rhizosphäre sammeln. Wurzeln werden im Labor auf Eis und Oberfläche mit Bleichmittel und Ethanol (EtOH) sterilisiert gebracht. Die Rhizosphäre ist gefiltert und durch Zentrifugation konzentriert. Bodenaushub aus um den Wurzelballen ist platziert in Plastiktüten und brachte in das Labor, wo eine kleine Menge des Bodens für DNA Extraktionen genommen wird. DNA wird aus Wurzeln, Boden- und Rhizosphäre extrahiert und dann verstärkt mit Primer für die V4-Region von der 16 s rRNA-gen. Amplifikate sequenziert, dann mit open-Access-Bioinformatik analysiert. Diese Methoden erlauben Forschern, wie die mikrobiellen Gemeinschaft Vielfalt und Zusammensetzung variiert aufgrund der Probentyp, Behandlung, zu testen und Genotyp zu Pflanzen. Mit diesen Methoden zusammen mit statistischen Modellen, zeigen die repräsentativen Ergebnisse, gibt es erhebliche Unterschiede bei mikrobieller Gemeinschaften von Wurzeln, Rhizosphäre und Boden. Hier vorgestellte Methoden bieten eine komplette Reihe von Schritten wie Feldproben zu sammeln, zu isolieren, zu extrahieren, zu quantifizieren, verstärken und DNA-Sequenz und mikrobiellen Gemeinschaft Vielfalt und Komposition in replizierten Feldversuche zu analysieren.

Die repräsentativen Ergebnisse präsentiert in dieser Handschrift stammen aus der Wiese, gegründet im Jahr 2012 an der University of Nebraska-Lincoln Landwirtschaft Research Division Farm in der Nähe von Mead, ne vor dem Versuch, die Website hatte es geschafft worden, als eine Mais-Soja-rotation . Das Untersuchungsgebiet befand sich auf drei verschiedene Arten von Böden, aber die Daten wurden analysiert, als wären alle Änderungen in gemessene Bodeneigenschaften durch die Behandlungen verhängt.
Die Wiese enthielt zwei reine, steht der Rutenhirse (p. Virgatum cv Liberty) und große Bluestem (A. Gerardii) sowie eine Low-Vielfalt Grasmischung mit großen Bluestem, Indiangrass (S. Nutans) und "Butte" Sideoats Grama ( B. Curtipendula). Die drei warmen Jahreszeit Rasen Grundstücke wurden in einem randomisierten komplette Blockdesign, die drei mal repliziert wurde. In drei verschiedenen Rasen Grundstücke verschachtelt wurden zwei Stickstoff (N) Befruchtung Behandlungen, die waren 56 (N1) und 112 (N2) kg N ha-1 angewandte Harnstoff. Zum Zeitpunkt des Mikrobiom Probenahme am Ende der Vegetationsperiode Boden enthaltenen 8.0 ± 1,1 (Mittelwert ± SD) ppm Nitrat in den Parzellen befruchtet mit 112 kg N ha-1 und 6,8 ± 0,7 (Mittel + SD) ppm Nitrat in den Parzellen befruchtet mit 56 kg N ha-1. Die Parzellen hatten jährlich befruchtet worden. Der warmen Jahreszeit Rasen, die Grundstücke als Haupt Handlungen (8000 m2) und N-Behandlungen ausgewiesen waren waren die geteilten Parzellen (4000 m2). Große Bluestem wurde als eine 50: 50 Mischung aus "Bonanza" und "Goldmine" ausgesät und Indiangrass wurde als eine 50: 50 Mischung von "Scout" und "Krieger" ausgesät. Die Grundstücke wurden im Jahr 2012 gepflanzt, und die erste N-Anwendung ereignete sich im Frühjahr 2013.
Der Boden und die Wurzel Probenahme wurde am 15. September 2014 durchgeführt. Die unten beschriebene Arbeiten wurde auf einem Feld durchgeführt, die als Split-Plot-randomisierten Design mit drei Wiederholungen (Abbildung 1) eingerichtet wurde. Die durchschnittliche Sequenzierung Tiefe aller Proben für Endosphere wie folgt waren: 4871 ± 5711 (Mittelwert ± SD), Rhizosphäre: 40726 ± 14684, Boden: 38184 ± 9043. Eine der größten Quellen der Variation in diesen Experimenten, die mit den Methoden beschrieben, ist der Unterschied in der mikrobiellen Lebensgemeinschaften zwischen Probentypen (Abbildung 2). In dieser repräsentativen Datensatz erscheinen die Rhizosphäre und Boden ähnlicher Zusammensetzung zueinander als die Endosphere (Abbildung 2A). Allerdings gab es auch hoch signifikant (p = 0,001) Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Rhizosphäre und Boden (Abb. 2 b). Die totale Variation entfielen in diesen Experimenten von Probentyp analysiert waren 26 %.
Alpha-Diversität Analyse zeigte, dass die mikrobielle Gemeinschaften in der Endosphere in der Probe Vielfalt im Vergleich zu Boden und Rhizosphäre (Abbildung 3) niedriger waren. Nur signifikante Unterschiede in der Vielfalt zwischen der Grasarten in jedem Fach wurden zwischen den Endosphere Proben von großen Bluestem und Rutenhirse mit Rutenhirse mit deutlich höheren mikrobielle Artenvielfalt (Abbildung 3). Die relative Häufigkeit Analyse (Abbildung 4) zeigt die Dominanz der Proteobakterien gefolgt von Actinobacteria in alle Probentypen. Boden und Rhizosphäre sind auch Acidobacteria Chloroflexi dominieren und während der Endosphere eine größere relative Häufigkeit von Bacteroiditenhatte.
In diesem Experiment Pflanzen wurden mit zwei verschiedenen Mengen von N-Dünger angebaut und daher analysieren wir die Daten, um festzustellen, ob es behandlungseffekte gab. Behandlungseffekte entfielen 12 % der gesamten Variation aber waren nicht signifikant unterschiedlich, obwohl die beiden Behandlungen in der Ordination verschiedene (Abbildung 5) aussehen. Dies unterstreicht die Bedeutung von statistischen Analysen für diese Datensätze statt Sichtprüfung oder qualitative Urteile.
Pflanze beeinflusst Unterschiede in das Mikrobiom von Pflanzengewebe und Boden wurden mit einer eingeschränkten Methode der Ordination visualisiert. Statistische Unterschiede waren bestimmt mit einer PERMANOVA Analyse um zu testen, ob bestimmte Variablen, wie zum Beispiel Arten, deutlich verschiedene mikrobielle Gemeinschaft Zusammensetzung zwischen Proben führen. Als alle Probentypen zusammen analysiert wurden, fand man ein hoch signifikanten Unterschied in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft aufgrund von Pflanzenarten (Abbildung 6). In diesem Experiment wurde der Betrag der Streuung von Pflanzenarten entfielen 6,7 %. Schließlich war jeder Probentyp einzeln analysiert, um festzustellen, welche der Probe die bedeutende Anlage Arten Wirkung fahren könnte. Nur in der Endosphere war es ein sehr signifikanter Unterschied (p = 0,001) zwischen der mikrobiellen Gemeinschaft Kompositionen der verschiedenen Pflanzenarten (Abbildung 7). In den anderen Probentypen war der Arten-Effekt nicht signifikant wenn einzeln analysiert. In der Endosphere war die prozentuale Variation durch Arten 27 %, während es in der Rhizosphäre (18 %) und Erde (15 %) geringer war. Dies unterstreicht weiter die Bedeutung jeder Gewebetyp einzeln zu analysieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Abbildung 1: Beispiel für die experimentelle feldmuster. Experimentelle feldmuster illustriert eine randomisierte komplette Block-Design in dreifacher Ausfertigung der Wiese befindet sich an der University of Nebraska-Lincoln Eastern Nebraska Forschung und Extension Center in der Nähe von Mead, NE. Vollständige Website Beschreibung finden Sie unter dem Abschnitt "Ergebnisse". N1 ist die geringe (56 kg N ha-1 Harnstoff) und N2 (112 kg N ha-1 Harnstoff) ist die höhere Stickstoff-Rate, die angewendet wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Abbildung 2: Beta-Vielfalt Analyse die mikrobiellen Zusammensetzung in den verschiedenen Probenarten einschließlich Endosphere, Rhizosphäre und des Bodens von der ewigen Grass Probenahme im Jahr 2014 zu vergleichen. Die Auswertung erfolgte mit einem Python-Skript in QIIME1.9.1, um Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix zu produzieren. Wichtigsten Koordinaten Analyse (HKoA) auf der Grundlage der Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix wurde in RStudio visualisiert. PCoA1 und PCoA2 zeigen die erste und zweite größte Varianz erklärt sich durch die HKoA-Analyse. PERMANOVA statistische Analyse wurde durchgeführt, um die Bedeutung zwischen Probentypen zu bestimmen, und der p -Wert wird auf der rechten oberen Ecke angezeigt. Jedes Symbol in den Figuren repräsentieren die gesamte mikrobiellen Gemeinschaft für jede Probe. (A) Endosphere, Rhizosphäre und Boden Probentypen wurden gemeinsam analysiert. Alle 87 Proben wurden 486 Sequenzen pro Probe verdünnt. (B) die Rhizosphäre und Bodenproben wurden gemeinsam analysiert. Alle 59 Proben wurden mit 8231 Sequenzen verfeinert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Abbildung 3: Alpha-Vielfalt-Analyse mit Shannon-Index für die einzelnen Arten in der Endosphere, Rhizosphäre und Boden. Die Auswertung erfolgte mit einem Python-Skript in der QIIME1.9.1. Verdünnung wurde für die Endosphere, Rhizosphäre und Bodenarten Probe bzw. mit 486, 17154 und 8231 Sequenzen pro Probe gemacht. Kästchen zeigen an den 25. und 75. Perzentile (erster und Dritter Quartile). Die horizontale Linie innerhalb der Box bezeichnet den Median und den roten plus zeigt den Mittelwert. Schnurrhaare zeigen die Bandbreite der die Daten ohne Ausreißer (die als schwarze Punkte dargestellt sind), die mehr als das 1,5-fache der interquartilbereich fiel (n = 6 für jede Probe außer mix für Sideoats Grama wo n = 5). Der Shannon-Index aller fünf Arten in der Endosphere waren niedriger als Rhizosphäre und Boden. Nicht-parametrische Wilcoxon Rang Summe Test wurde verwendet, um die Bedeutung zwischen den Arten zu bestimmen und nur signifikante Unterschiede zwischen den Arten wurden auf den Feldern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Abbildung 4: Relative Häufigkeit auf der Ebene der Phylum in der Endosphere, der Rhizosphäre und Boden. Proben wurden analysiert, um die Fülle der mikrobielle Stämme unter verschiedenen Proben Arten vergleichen (n = 29 für jede Probe). Die Auswertung erfolgte mit einem Python-Skript in QIIME1.9.1 aus der OTU-Tabelle. Die verschiedenen Farben im Inneren des Kreisdiagramms bezeichnen die Stämme. Der Prozentsatz gibt die relative Häufigkeit der einzelnen Phylum in den jeweiligen Probe. Die Phylum Informationen wurde kommentiert mit der ribosomalen Datenbankprojekt Klassifikator (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Abbildung 5: Analyse mit Behandlung als einschränkende Faktor zwischen alle Probentypen. Kanonische Analyse der wichtigsten Koordinaten (CAP) Analyse wurde durchgeführt, um festzustellen, ob gab es Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen den Behandlungen. Für jede Behandlung von N, n = 42 für N1 (56 kg N ha-1) und n = 45 für N2 (112 kg N ha-1). Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix wurde mit einem Python-Skript in der QIIME1.9.1 erstellt. Gap Analyse anhand der Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix erfolgte durch die Behandlung als Faktor der RStudio einschränken. PERMANOVA-Analyse wurde durchgeführt, um festzustellen, ob Behandlung Unterschiede signifikant waren, und der p -Wert wird auf der rechten oberen Ecke angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Abbildung 6: Analyse mit Pflanzenarten als einschränkende Faktor zwischen alle Probentypen. Analyse wurde durchgeführt, um festzustellen, ob es Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Pflanzenarten in alle Probentypen. Wichtigsten Koordinaten Ordination und Gap-Analyse der alle Probentypen (Endosphere, Rhizosphäre und Boden) erfolgten mit einer Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix. Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix wurde mit der Python-Skript in QIIME1.9.1 erstellt. Gap-Analyse anhand der Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix erfolgte durch Einschränken der Pflanzenarten als Faktor der RStudio. PERMANOVA statistische Analyse wurde durchgeführt, um die Bedeutung zwischen Pflanzenarten zu ermitteln, und der P-Wert wird auf der rechten oberen Ecke angezeigt. Jedes Symbol in den Abbildungen stellt die gesamte mikrobiellen Gemeinschaft für diese Probe. n = 18 für die einzelnen Arten in alle Probentypen außer n = 15 für den Sideoats Grama Mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Abbildung 7: Beispiel für die GAP-Analyse mit Arten als einschränkende Faktor für jede Probe individuell. Wichtigsten koordinieren Ordination und CAP Analyse jeder Probenart (Endosphere, Rhizosphäre und Boden) mit Bray-Curtis Unähnlichkeit Matrix. Jede Probentyp wurde 486, 17154 und 8231 Lesevorgänge pro Probe bzw. in Endosphere, Rhizosphäre und Boden verfeinert. Arten wurde als der Faktor verwendet, um die Ordination zu beschränken. PERMANOVA statistische Analyse wurde durchgeführt, um die Bedeutung von Pflanzenarten in den jeweiligen Probe bestimmen, und der p -Wert wird auf der rechten oberen Ecke angezeigt. Jedes Symbol in der Abbildung stellt die gesamte mikrobielle Gemeinschaft für jede Probe. Stichprobengröße ist n = 29 für jede Probe, n = 6 für jede Pflanzenart in den jeweiligen Probe mit Ausnahme der Sideoats Grama Mix (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Ausgrabung der Pflanzenwurzeln aus dem Bereich sowie Verarbeitung von Proben in Endosphere, Rhizosphäre und Boden sind im Detail beschrieben, einschließlich DNA-Extraktion und Analyse-Methoden. Dieses Papier soll anderen Labors, diese Techniken für die Untersuchung von Böden, Endosphere und Rhizosphäre mikrobiome zu ermöglichen.

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Boden-, Rhizosphären- und Wurzelendosphären-Mikrobioms zu beantworten, z. B. wie sich die Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaft als Reaktion auf den Probentyp, die Behandlung und den Pflanzengenotyp verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sich gut für Feldexperimente eignet, die eine große Stichprobenzahl und Replikation erfordern. Das Verfahren wird von mir und Stephanie Futrell, einer Doktorandin und Forschungstechnikerin aus meinem Labor, demonstriert.Um das Protokoll zu beginnen, beschriften Sie eine Waschwanne und einen Eimer mit einem Haftnotizzettel mit Details zur Pflanzenprobe. Tragen Sie den beschrifteten Eimer zur Parzelle und lassen Sie die Waschpfanne am eingerichteten Arbeitsplatz auf dem Feld. Wählen und sammeln Sie zufällig zwei Pflanzen pro Parzelle aus verschiedenen Bereichen innerhalb der Parzelle.Stechen Sie dann mit einer Schaufel bis zu einer Tiefe von 30 Zentimetern in die Erde, um alle Seitenwurzeln abzuschneiden, die die Pflanze in der Erde halten. Graben Sie die Pflanzenwurzeln mit der Schaufel aus und legen Sie den Wurzelballen in den beschrifteten Eimer. Bringen Sie die Schaufel zurück zum Arbeitsplatz im Feld.Schütteln Sie die Wurzeln und verwenden Sie einen Spaten oder eine Handhacke, um Erde von den Wurzeln zu entfernen. Tragen Sie Handschuhe und platzieren Sie die Wurzeln in der Nähe der Verarbeitungsstation. Nach dem Schütteln der Wurzeln die Erde in der Waschpfanne mischen und die Erdklumpen mit einer Handhacke aufbrechen.Legen Sie eine Probe der Erde, die frei von Schmutz ist, in eine beschriftete, 17,7 x 19,5 Zentimeter große Aufbewahrungstasche mit Reißverschluss und legen Sie sie auf Eis. Sterilisieren Sie die Gartenschere in 70% Ethanol. Verwenden Sie die sterile Schere, um eine Vielzahl von Wurzeln zu schneiden, etwa vier bis sechs Wurzeln pro Pflanze und jede Wurzel etwa neun bis 12 Zentimeter lang.Geben Sie die herausgeschnittenen Wurzeln in ein beschriftetes 50-Milliliter-Röhrchen mit 35 Millilitern autoklaviertem Phosphatpuffer mit einem Tensid wie Silwet L-77. Schütteln Sie die Röhren zwei Minuten lang, um die Rhizosphäre von der Oberfläche der Wurzeln freizusetzen. Verbessern Sie das Schütteln mit einem Generator und einem Vortexer.Entfernen Sie mit einer Pinzette, die in 70%igem Ethanol sterilisiert ist, die Wurzeln aus der Tube, tupfen Sie sie kurz auf Küchenpapier ab und legen Sie sie in eine neue, beschriftete 50-Milliliter-Tube. Legen Sie sowohl die Röhre mit der Rhizosphäre als auch die mit den Wurzeln auf Eis. Geben Sie etwa 35 Milliliter 50 % Bleiche plus 0,01 % Tween 20 in die 50-Milliliter-Röhrchen mit den auf dem Feld gesammelten Wurzeln.Wirbeln oder schütteln Sie die Röhrchen 30 bis 60 Sekunden lang. Gießen Sie das Bleichmittel ab, fügen Sie 35 Milliliter 70%iges Ethanol hinzu und wirbeln oder schütteln Sie die Wurzeln weitere 30 bis 60 Sekunden lang. Gießen Sie nach dem Schütteln das 70%ige Ethanol ab und fügen Sie 35 Milliliter steriles Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie die Probe eine Minute lang vor oder schütteln Sie sie.Wiederholen Sie den Spülschritt mit Wasser noch zwei Mal, sodass die Wurzel insgesamt drei Spülungen mit sterilem Reinstwasser erhält. Tupfen Sie die Wurzeln auf trockene, saubere Papiertücher und verwenden Sie für jede Probe ein sauberes Papiertuch. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sterilen Pinzette und einer Gartenschere in etwa fünf Millimeter große Stücke, legen Sie die abgeschnittenen Wurzeln in ein sauberes, beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius.Schütteln Sie die 50-Milliliter-Röhrchen mit Rhizosphärenproben aus dem Feld 20 bis 30 Sekunden lang, um die gesamte Probe wieder zu suspendieren. Filtrieren Sie die resuspendierte Probe mit einem sterilen 100-Mikron-Netz-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen bei 3.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Den Überstand sofort abgießen und entsorgen. Legen Sie die Rhizosphären-Pellets in die 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter sterilen Phosphatpuffer ohne Tensid zu den Rhizosphärenpellets und wirbeln Sie sie vortexen, um die Probe wieder zu suspendieren.Pipettieren Sie die suspendierte Flüssigkeit in ein sauberes, beschriftetes Zwei-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Die Tuben bei 15.871 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur drehen. Gießen Sie den Überstand sofort ab und lassen Sie die Schläuche auf sauberen Papiertüchern abtropfen.Lagern Sie die Pellets bis zur Weiterverarbeitung bei minus 20 Grad Celsius. Füllen Sie mit einem sterilen Metallspatel ein sauberes, beschriftetes Zwei-Milliliter-Röhrchen mit etwa drei Gramm Erde für die DNA-Extraktion und vermeiden Sie kleine Wurzelstücke und Ablagerungen. Spülen Sie den Metallspatel zwischen jeder Probe mit 70 % Ethanol ab.Lagern Sie diese Bodenprobe bei minus 20 Grad Celsius. Leeren Sie den Beutel mit der Erde in einer sauberen Waschpfanne in gestapelte Siebe, wobei das größere Sieb auf dem kleineren Sieb liegt, und sieben Sie die Erde manuell durch beide Siebe. Verwenden Sie eine Bürste, um die Siebe zwischen den Proben vorsichtig zu reinigen.Legen Sie 100 bis 125 Gramm gesiebte Erde in einem 17,7 x 19,5 Zentimeter großen Reißverschlussbeutel für zukünftige physikalisch-chemische und Texturanalysen des Bodens beiseite. Stellen Sie die Säcke mit Erde bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung ein. Gießen Sie dann flüssigen Stickstoff mit sauberen Spachteln und in einen sauberen Mörser.Legen Sie das gefrorene Taschentuch in den Mörser und zerkleinern Sie es mit dem Stößel zu einem feinen Pulver. Fügen Sie während des Mahlens kontinuierlich flüssigen Stickstoff hinzu, um die Proben eingefroren zu halten. Übertragen Sie das gemahlene Gewebe mit einem Spatel in ein sauberes, beschriftetes Zwei-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie das Gewebe dann bei minus 80 Grad Celsius.Wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol und 1 % Haushaltsbleiche ab. Entnehmen Sie die Bodenproben aus dem bei minus 20 Grad Celsius warmen Lager und tauen Sie sie in einem Eiskübel auf. Entfernen Sie die Abdeckung der Dichtungsmatte von einer 96-Well-Extraktionsplatte und legen Sie die Abdeckung zwischen zwei Papiertücher, um sie bei Nichtgebrauch sauber zu halten.Decken Sie die 12 Säulen der Platte mit selbstklebenden 8-Well-PCR-Streifen ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Fassen Sie einen sterilen, kleinen Wiegetrichter auf eine Waage und wiegen Sie 200 bis 250 Milligramm Erde ab. Heben Sie den Klebestreifen vorsichtig an, legen Sie den Hals des gefüllten Wiegtrichters in die entsprechende Vertiefung und führen Sie die Bodenprobe vorsichtig in die entsprechende Vertiefung.Bringen Sie den Klebestreifen wieder an, um die Vertiefung abzudecken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung und verwenden Sie für jede Probe einen neuen sterilen Trichter. Bringen Sie die Abdeckung der Dichtungsmatte wieder auf die Extraktionsplatte und lagern Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die DNA-Extraktion bereit ist.Entnehmen Sie die Rhizosphärenproben aus dem bei minus 20 Grad Celsius warmen Lager und tauen Sie sie in einem Eiskübel auf. Bereiten Sie die DNA-Extraktionsplatte wie im vorherigen Abschnitt voran vor. Legen Sie ein sauberes Papiertuch auf eine Waage und tarieren Sie dann einen sterilen Metallspatel auf der Waage.Schöpfen Sie mit dem Spatel vorsichtig einen Teil des Rhizosphären-Pellets aus einem Probenröhrchen heraus. Wiegen Sie zwischen 200 und 250 Milligramm der Rhizosphärenprobe. Heben Sie den Klebestreifen vorsichtig an, um die erste Vertiefung der Extraktionsplatte freizulegen.Winkeln Sie den gefüllten Spachtel in die Vertiefung an und kratzen Sie das Rhizosphärenmaterial mit einem sterilen Zahnstocher in die entsprechende Vertiefung ab. Spülen Sie den Metallspatel mit Wasser ab, gefolgt von 70 % Ethanol zwischen den Proben. Wiederholen Sie diesen Vorgang abschließend für jede Vertiefung der Platte, bis die Platte gefüllt ist, und lassen Sie eine Vertiefung als Extraktionsblindkontrolle leer.In diesem repräsentativen Datensatz gab es hochsignifikante Unterschiede zwischen den Probentypen, und die Rhizosphäre und der Boden scheinen sich in ihrer Zusammensetzung ähnlicher zu sein als die Wurzel. Weitere Analysen zeigen, dass es auch hochsignifikante Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Rhizosphäre und Boden gab. Die Alpha-Diversitätsanalyse zeigt, dass die mikrobiellen Gemeinschaften in der Endosphäre geringer waren als die Gemeinschaften im Boden und in der Rhizosphäre.Der einzige signifikante Unterschied in der Diversität zwischen den Grasarten bestand zwischen den Endosphärenproben von großem Blaustängel und Rutenhirse. Die relative Abundanzanalyse unterstreicht die Dominanz von Proteobakterien, gefolgt von Actinobakterien in allen Probentypen. Boden und Rhizosphäre werden von Acidobakterien und Chloroflexi dominiert, während die Wurzeln eine größere relative Abundanz an Bacteriodeten aufwiesen.Die PERMANOVA-Analyse aller Probentypen ergab einen hochsignifikanten Unterschied in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft aufgrund der Pflanzenarten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Reihe von Schritten durchführen, die bei der Untersuchung von Boden-, Endosphären- und Rhizosphären-Mikrobiomen verwendet werden können. Wir danken dem Nebraska EPSCoR und der National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 für die teilweise Finanzierung dieses Lehrvideos.

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Umwelt

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Linking Prädationsrisiko, Herbivore Physiologische Stress und mikrobielle Zersetzung des Pflanzenstreu

Das Verständnis der Rolle von Umwelt Heterogenität in der Art Koexistenz ist in der Regel auf Arten von Heterogenität, die äußerlich der Gemeinde Artenzusammensetzung sind konzentriert. Wir bieten neue Methoden für die Erstellung detaillierter Bodenheterogenität Behandlungen mit Böden unterliegen Pflanze-Boden Feedback Anlage, oder intrinsische Heterogenität der Community Komposition.

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Der Artikel beschreibt eine Methode, die den Durchsatz erhöht, während der Aufwand und die Genauigkeit für die Extraktion von Lipiden aus den Zellmembranen von Mikroorganismen zur Verwendung bei der Charakterisierung sowohl der Gesamtlipide als auch der relativen Häufigkeit von Indikatorlipiden zur Bestimmung der mikrobiellen Bodenstruktur in Studien mit vielen Proben ausgeglichen werden.

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Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Probenahme, Erhaltung und Sektionierung intakter Wurzeln und des umgebenden Rhizosphärenbodens aus Feuchtgebieten unter Verwendung von Reis(Oryza sativa L.) als Modellart. Nach der Konservierung kann die Probe mit elementaren bildgebungstechnischen Verfahren wie der chemischen Synchrotron-Röntgenfluoreszenz (RFA) analysiert werden.

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Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.

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Erfahren Sie standardisierte Methoden zur Isolierung und Analyse mikrobieller Lebensgemeinschaften aus Boden, Rhizosphäre und Wurzeln. Diese Protokolle ermöglichen reproduzierbare Feldexperimente zur Untersuchung von Pflanze-Mikrobe-Interaktionen.

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