Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Das übergeordnete Ziel dieses Paarungsassays ist es, die Auswirkungen von Mutationen innerhalb des konjugativen Transfergens auf seine Fähigkeit zu bewerten, den Plasmidtransfer im Rahmen eines funktionellen Typ-4-Sekretionskomplexes zu beeinflussen. Diese Methode ermöglicht es, proteinspezifische Fragen zu stellen, wie z.B. die Identifizierung von Regionen mit Protein-Protein-Wechselwirkungen, die zwischen Transferproteinen auftreten, wenn sie ein funktionelles Typ-4-Sekretionssystem in der bakteriellen Konjugation zusammensetzen. Bei dieser Technik werden Gene auf großen konjugativen Plasmiden durch homologe Rekombination ausgeschaltet.

Die Genfunktion wird bewertet, indem das Zielgen den Knockouts auf einem kleineren Plasmid zur Verfügung gestellt wird. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Organisation und Einrichtung der Schlüssel zur erfolgreichen Durchführung dieses Verfahrens sind. Eine ordnungsgemäße experimentelle Vorbereitung ist notwendig, um interpretierbare Ergebnisse zu erhalten.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Vorbereitung des verdauten pBAD33-Plasmids, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen Sie jeden Aufschluss auf einem Agarosegel aus. Schneiden Sie mit einem UV-Schrank und einem sterilen Rasierer das 2,8 Kilo schwere Basisband, das der Kathetersequenz entspricht, aus dem Gel heraus.

Arbeiten Sie schnell, um die UV-Belastung der DNA zu minimieren. Extrahieren Sie die DNA aus der ausgeschnittenen Gelscheibe mit einem Gelextraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zur Amplifikation der extrahierten Katzenkassette durch Polymerase-Kettenreaktion oder PCR.

Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem sterilen PCR-Röhrchen vor. Verwenden Sie Primer, die Überhänge enthalten, die homolog zur Zielgensequenz für die homologe Rekombination sind. Es wird eine Negativkontrolle eingerichtet, die die gleichen Bestandteile enthält, außer dass die Matrizen-DNA durch doppelt destilliertes Wasser ersetzt wird.

Richten Sie außerdem eine Positivkontrolle mit Template-DNA und Primern ein, die sich in einer PCR-Reaktion als wirksam erwiesen haben. Mischen Sie alle Reaktionsinhalte vorsichtig durch Pipettieren. Amplifizieren Sie dann die extrahierte Katzenkassette mit den im Textprotokoll aufgeführten PCR-Parametern.

Verwenden Sie nur fünf Mikroliter jeder Reaktion, um die korrekte Größe der Amplifikation durch Agarose-Gelelektrophorese zu bestätigen. Reinigen Sie das PCR-Amplikon mit einem PCR-Aufreinigungskit nach dem Protokoll des Herstellers. Geben Sie 300 Nanogramm der amplifizierten Katzenkassette in 50 Mikroliter elektrokompetente DY330R-Zellen, die das pOX38-Tc-Plasmid auf Eis beherbergen.

Zum Mischen vorsichtig auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem unmodifizierten pBAD33-Plasmid als Positivkontrolle. Übertragen Sie die Zellen dann in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette von einem Millimeter

Elektropopolieren Sie die Zellen bei 1,8 Kilovolt mit einer Zeitkonstante von 5,5 Millisekunden mit einem Elektroporator. Unmittelbar nach dem Anlegen des Impulses werden die Zellen mit einem Milliliter SOC-Medium verdünnt und in ein frisches Mikrofugenröhrchen überführt. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 32 Grad Celsius.

Als nächstes aliquotieren Sie 100 Mikroliter jeder Probe auf Agarplatten, die 10 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin und 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthalten. Verteilen Sie das Aliquot mit einem sterilen Streuer auf der Platte. Inkubieren Sie die Platte kopfüber bei 32 Grad Celsius über Nacht.

Wählen Sie am nächsten Tag die erfolgreichen Rekombinanten aus. Die in die Zelle eingeführte Katzenkassette wird eine homologe Rekombination mit dem interessierenden Gen durchlaufen und bildet den pOX38-Tc-Chloramphenicol-Knock-out-Klon. Trennen Sie das Elektroporat von 300 Nanogramm des pK184-Gens oder des pK184-Genmutanten in 50 Mikroliter elektrokompottierte DY330R-Zellen, die wie zuvor das pOX38-Tc-Chloramphenicol-Knock-out-Plasmid enthalten.

Um die XK1200-Donorzellen zu erzeugen, führen Sie eine konjugative Paarung gefolgt von einer Elektroporation durch, um XK1200-Zellen zu erzeugen, wobei sowohl das Chloramphenicol-Knock-out als auch das PK184-Plasmid harporiert werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Vorbereitung einer Übernachtkultur dieser XK1200-Spenderzellen in 20 Millilitern sterilem LB mit Chloramphenicol und Kanamycin. Bereiten Sie auch MC4100-Empfängerzellen in 50 Millilitern LB mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin vor, indem Sie Zellen aus einem Glycerinstamm oder aus einer einzelnen Kolonie auf einer Agarplatte verwenden.

Züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Geben Sie Glukose bis zu einer Endkonzentration von 100 Millimolar in alle Spenderzellen. Machen Sie am nächsten Tag 1 von 70 Verdünnungen aus jeder Übernachtkultur separat in zwei Milliliter sterilem LB mit den gleichen Antibiotika.

Wachsen Sie die Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Zentrifugieren Sie die Zellkultur, um die Zellen zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie dann das Zellpellet einmal mit kaltem sterilem LB, um die Antibiotika zu entfernen.

Nach einer zweiten Zentrifugation wie zuvor suspendieren wir die Zellen in zwei Millilitern kaltem sterilem LB.In Duplikat, aliquotieren 100 Mikroliter Spenderzellen und 100 Mikroliter Empfängerzellen zu 800 Mikrolitern sterilem LB-Medium für ein Milliliter Gesamtvolumen. Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln paaren. Nach einer Stunde wirbeln Sie die Zellen 30 Sekunden lang durch, um die Paarungspaare zu stören.

Legen Sie die Zellen dann 10 Minuten lang auf Eis, um eine weitere Paarung zu verhindern. Bereiten Sie unter Verwendung der Mid-Log-Kulturen und frischer steriler LB sechs serielle Verdünnungen der Spender- und Empfängerzellen von 1 und 100 auf 1 und 10 Millionen vor. Auf jede der beiden Hälften einer Agarplatte, die Naladixinsäure, Chloramphenicol und Kanamycin enthält, werden 10 Mikroliter Aliquots jeder Verdünnung von XK1200-Spenderzellen aufgetragen.

Wiederholen Sie die Schmierblutung für die Verdünnungen der Empfängerzellen MC4100 auf Agarplatten, die Streptomycin enthalten. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie anschließend mit der Wirbelmischung und frischem sterilem LB sechs Verdünnungen der Transkonjugate vor.

Wählen Sie für die transkonjugierenden MC4100-Zellen aus, die das pOX38-Tc-Chloramphenicol-Knock-out-System enthalten, indem Sie zehn Mikroliter-Aliquots jeder Verdünnung auf jeder Hälfte der Agarplatten mit Streptomycin und Chloramphenicol aufdecken. Wiederholen Sie den Vorgang für beide doppelten Mischungen. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Berechnen Sie die Paarungseffizienz, indem Sie die Anzahl der Kolonien aus der gleichen Verdünnungsfleckenbildung für jede Spender-, Empfänger- und Transkonjugantenzelle auf ihren jeweiligen Platten zählen. Zählen Sie auch die Empfängerkolonien, um auf Verzerrungen zu testen, die sich aus einer größeren Anzahl von Transkonjuganten als Empfängern bei dieser gegebenen Verdünnung ergeben. Berechnen Sie die Paarungseffizienz als die Anzahl der transkonjuganten Kolonien dividiert durch die Anzahl der Spenderkolonien, multipliziert mit 100, um den Effizienzwert pro 100 Spenderzellen zu erhalten.

Wenn das Typ-4-Sekretionssystem gene-tra-F aus dem pOX38-Tc-Plasmid ausgeschaltet wird, führt dies zu einem Verlust des konjugativen Transfers des pOX38-Tc traF-Chloramphenicol-Plasmids von den Spenderzellen zu den Empfängerzellen. Wenn jedoch das traF-Gen in trans durch das PK184 traF-Plasmid und die Spenderzellen bereitgestellt wird, wird eine Wiederherstellung des konjugativen Transfers des pOX38-Tc traF-Chloramphenicol-Knock-out-Plasmids beobachtet. Bei Bereitstellung von Verdünnungsmutanten von traF und dem PK184-Plasmid in den Spenderzellen kann ein Verlust des konjugativen Transfers des pOX38-Tc traF-Chloramphenicol-Knock-out-Plasmids beobachtet werden.

Der Verlust des konjugativen Transfers gibt an, welche Region des Proteins für Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des konjugativen Typ-4-Sekretionssystems wichtig ist. Dieser Bereich kann dann durch Punktmutationen, die die Effizienz für den Transfer beeinflussen, genauer untersucht werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem einzigen Arbeitstag mit erwarteten Wachstumszeiten durchgeführt werden.

Dieses Protokoll kann an anderen als den hier gezeigten Zellen durchgeführt werden. Der entscheidende Aspekt an dieser Stelle ist, dass Spender- und Empfängerzellen das Plasmid von Interesse nicht beherbergen. Wenn Sie also das Knock-out-Plasmid hinzufügen, erhalten Sie keine widersprüchlichen Ergebnisse.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sehr gut organisiert zu sein, da es unterschiedliche Wachstumsbedingungen und Antibiotika für Spender-, Empfänger- und transkonjugierte Zellen gibt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Kristallographie, NMR oder Massenspektrometrie durchgeführt werden, um ein detailliertes strukturelles und funktionelles Bild des interessierenden Proteins zu erhalten.