Name: Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine in bakteriellen Konjugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Lernen Sie konjugative Mating-Assays zur Analyse von Proteininteraktionen bei der bakteriellen Konjugation. Diese Methode nutzt homologe Rekombination und Plasmidtransfer, um spezifische Genregionen zu identifizieren.

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Diese Forschung wurde von einem Discovery-Stipendium der Naturwissenschaften &amp; Engineering Council of Canada (NSERC) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Bakterielle Konjugation Verfahren liefert ein Mittel, mit dem Bakterien-Gene bietet einen evolutionären Vorteil für das Wachstum in anspruchsvollen Umgebungen, wie die Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzmarker ausbreiten kann. Da viele der konjugativen Plasmiden so groß sind, 12 funktionelle Studien über die beteiligten Proteine in der Montage der Übertragungsvorrichtung durch Mutation von Zielgenen auf dem konjugativen Plasmid selbst sind unhandlich. Die detaillierten Protokolle hierin ein Mittel bereitzus...

Die Übertragung von Genen und Proteinen auf der Mikro-Ebene organismal spielt eine zentrale Rolle bei der bakteriellen Überleben und die Entwicklung sowie Infektionsprozessen. Der Austausch von DNA zwischen Bakterien oder zwischen einem Bakterium und einer Zelle kann durch Transformation, Konjugation oder Vektorübertragung erreicht werden. 1,2 Konjugation im Vergleich zur Transformation und Transduktion, daß während der Konjugation zwischen gram-negative Bakterien wie Escherichia coli, der Transfer von DNA tritt in einem Spender gesteuert , wodurch eine komplexe makromolekulare System verbindet Spender- und Empfängerzellen einzigartig ist. Konjugation ist auch die direkte Weise, in der Bakterienzellen mit Wirtszellen interagieren Genen, Proteinen oder Chemikalien in zu Host-Systemen zu injizieren. 3 Oft hat die Übertragung solcher Mittel bemerkenswerte Effekte auf den Wirt, von der Pathogenese und Karzinogenese Entwicklung und Anpassung an den Host. Es hat sich gezeigt konjugativen recombination erhöht die Rate der Anpassung 3fache in Bakterien mit hoher Mutationsraten unter Bedingungen von Umweltstress. Außerdem 4 ist Konjugation mit Abstand die häufigste Weg , durch die Antibiotika - Resistenzgene in Bakterienstämme verteilt sind. 5,6 Mikroorganismen haben spezialisierte Sekretion Systeme entwickelt, um die Übertragung von Makromolekülen durch Zellmembranen zu unterstützen; gibt es derzeit neun Arten von Sekret Systemen (TSS) in Gram-negativen Bakterien, die beschrieben wurden: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS sowie die Sec (Sekretion) und Tat (zwei-Arginin-Translokation) Wegen. 7,8 Jede Art von Sekretionssystem ist weiter in verschiedene Subtypen unterteilt, eine Notwendigkeit aufgrund Vielfalt von Proteinen und die Unverwechselbarkeit von Wegen beteiligt sind , in verschiedenen Bakterienstämmen. Beispielsweise in dem Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), die Ti und Cag Systeme Effektor Transport während das F-Plasmid zu erleichtern, R27nd pKM101 T4SSs Übertragung eines konjugativen Plasmid erleichtern. 7,9,10 Ein detailliertes Verständnis der Mechanismen , durch die Organismen ihre jeweiligen Sekretionssysteme aus ihren Komponentenproteine montieren und zelluläre Inhalt mit einem Empfänger oder ihrer Umgebung teilen , ist ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von zielgerichteten Strategien pathogene Mikroorganismen und Verfahren zur Bekämpfung von zellulären Infektion. Nach der anfänglichen Identifizierung bakterielle Konjugation in E. coli von Lederberg &amp; Tatum, 11 eine große Anzahl von mobilen und konjugativen Plasmiden identifiziert und charakterisiert wurden. 12 solche mobilen Plasmide zeigen beträchtlichen Bereich Größe (von 1 bis über 200 Kilobasen (kb)), aber alle Mobil Plasmiden eine relaxase enthalten, die den Ursprung der Übertragung erkennt (oriT) wodurch eine Übertragung des Plasmids. Konjugativen Plasmiden weitere Gene kodieren für die Montage eines funktionellen T4SS sowie eine ArtIV Kopplungsprotein. 12 Zum Beispiel das 100 kb F - Plasmid von E. coli codiert alle konjugativer Gene innerhalb einer 33,3 kB - Transfer (tra) Region. 13 Die Gene im tra Region des F - Plasmid codieren alle Proteine , die Pilus - Bildung zu erleichtern, Paarung Paarbildung (MPF), DNA - Transfer und Ausschlussfunktionen während konjugativer Plasmidtransfers. 10,14,15 Ein bedeutender Körper des Wissens ist für konjugativen T4SSs verfügbar, detaillierte jedoch strukturelle Untersuchungen der konjugierende Proteine und Komplexe werden nur in jüngster Zeit verfügbar werden. 16-28 Um einen umfassenden Überblick über den konjugativen Prozess, eine Kopplung von detaillierte Strukturuntersuchungen zusammen Analysen von konjugativen Transfer Proteine ​​Mutations-erforderlich. Dies kann durch konjugativen Paarungs Assays erreicht werden. Für das F - Plasmid, jedes Protein im tra Region codiert spielt eine Rolle in der F-vermittelte conjugation; Daher wird die knockout / Löschung eines Gens , das das Übertragungs konjugativen Kapazität der Zelle (1) aufzuheben. Während kleinere mobile Plasmiden zuträglicher Standardlöschverfahren sind für größere konjugativen Plasmiden wie F, Gen-Knockout more werden leicht durch homologe Rekombination erreicht wobei das Zielgen mit einer Förder eine deutliche antibiotische Resistenzgen ersetzt. In der aktuellen Protokoll verwenden wir eine homologe Rekombination einen Transfer Gen von Interesse mit Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) in der 55-kb-F-Plasmid-Derivat pOX38-Tc zu ersetzen; 29,30 Die sich ergebende Plasmid knockout, pOX38-Tc Δgene :: Cm erleichtert Widerstand gegen die Anwesenheit von Chloramphenicol (Cm) in den Wachstumsmedien. Spenderzellen pOX38-Tc Δgene :: Cm Beherbergung sind nicht in der Lage konjugativen DNA-Transfer / Paarung zu beeinflussen, wie durch die Verwendung eines Gegen Assay beobachtet; die Gegenwirkungsgrad eines pOX38-Tc Δgene :: Cm Spenderzelle und einer normalen recipient wird abnehmen oder, häufiger, abgeschafft werden. Konjugativen Transfer des pOX38-Tc Δgene :: Cm Plasmid kann über eine kleine Erholung Plasmid wiederhergestellt werden, um den gezielten Transfer Gen beherbergt. Diese Erholung Plasmid kann eine sein , die eine konstitutive Expression, wie Plasmid pK184 (pK184-Gen), 31 oder einer bereitstellt , die so lange induzierbare Expression bietet wie das Plasmid richtig , das Gen an die richtige Stelle innerhalb der Zelle (Zytoplasma oder Periplasma) zum Ziel hat . Folglich ist in Paarungs Assays zwischen dieser neuen Spender (Beherbergung pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-Gen-Plasmide) und eine Empfängerzelle ist die Paarungseffizienz zu erwarten nahezu die eines normalen Spender-Empfänger-Paarung Assay wiederherzustellen. Dieses System ermöglicht es, die Funktion des ausgeknockt Gens durch die Erzeugung einer Reihe von pK184-Genkonstrukte (Deletionen oder Punktmutationen) zu sondieren und jedes Konstrukt Fähigkeit Testen der Paarungsfähigkeit des pOX38-Tc Δgene :: Cm Beherbergen wiederherzustellen Spenderzelles.

<table><tbody><tr><td>GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Gel Extraktionskit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet PCR Aufreinigungskit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenese Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>Küvetten haben einen Spalt von 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td></td><td></td><td>Endkonzentrationen</td></tr><tr><td>Chloramphenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Nalidixinsäure (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Rifampicin (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Tetracyclin (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 & Mikro; g/mL</td></tr></tbody></table>

konjugative mating assays für sequenzspezifische analyse der Übertragung beteiligten proteine ​​in bakteriellen konjugation

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Der Transfer von genetischem Material durch bakterielle Konjugation ist ein Prozess, der über Komplexe stattfindet, die von spezifischen Transferproteinen gebildet werden. In Escherichia coli bilden diese Transferproteine eine DNA-Transfermaschinerie, die als Paarbildung oder DNA-Transferkomplex bekannt ist und den konjugativen Plasmidtransfer erleichtert. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode bereitzustellen, die verwendet werden kann, um die Rolle eines spezifischen Transferproteins zu bestimmen, das an der Konjugation beteiligt ist, indem eine Reihe von Deletionen und/oder Punktmutationen in Kombination mit Paarungsassays verwendet wird. Das Zielgen wird auf dem konjugativen Plasmid ausgeschaltet und dann in trans durch die Verwendung eines kleinen Wiederherstellungsplasmids, das das Zielgen beherbergt, bereitgestellt. Mutationen, die das Zielgen auf dem Wiederherstellungsplasmid betreffen, können Informationen über funktionelle Aspekte des Zielproteins offenbaren, die zu einer Veränderung der Paarungseffizienz von Spenderzellen führen, die das mutierte Gen beherbergen. Veränderungen in der Paarungseffizienz geben Aufschluss über die Rolle und Bedeutung des jeweiligen Transferproteins oder einer Region darin bei der Erleichterung des konjugativen DNA-Transfers. Die Kopplung dieses Paarungsassays mit detaillierten dreidimensionalen Strukturstudien wird ein umfassendes Verständnis der Funktion des konjugativen Transferproteins ermöglichen und ein Mittel zur Identifizierung und Charakterisierung von Regionen der Protein-Protein-Interaktion bieten.

Der Prozess des F - Plasmid-driven bakterielle Konjugation ist ein koordinierter Prozess, der Transferproteine innerhalb des tra Region des F-Plasmids umfasst , das eine T4SS assembliert Pilus - Synthese und DNA konjugativen Transfer zu erleichtern. Das Protein TRAF (GenBank accession # BAA97961; UniProt ID P14497) für die konjugierende F-Pilus Bildung erforderlich. 10,14,35 - 37 Das Protein enthält eine C-terminale Thioredoxin-ähnliche Domäne, o...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Gen von Interesse auszuschalten, das an der Plasmidkonjugation beteiligt ist, und anschließend die Auswirkungen seiner Abwesenheit mit Hilfe von Paarungsassays zu analysieren. Die Funktion des Gens wird mit Hilfe von Deletions- oder Punktmutationen auf eine bestimmte Region seiner Sequenz weiter untersucht.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Das übergeordnete Ziel dieses Paarungsassays ist es, die Auswirkungen von Mutationen innerhalb des konjugativen Transfergens auf seine Fähigkeit zu bewerten, den Plasmidtransfer im Rahmen eines funktionellen Typ-4-Sekretionskomplexes zu beeinflussen. Diese Methode ermöglicht es, proteinspezifische Fragen zu stellen, wie z.B. die Identifizierung von Regionen mit Protein-Protein-Wechselwirkungen, die zwischen Transferproteinen auftreten, wenn sie ein funktionelles Typ-4-Sekretionssystem in der bakteriellen Konjugation zusammensetzen. Bei dieser Technik werden Gene auf großen konjugativen Plasmiden durch homologe Rekombination ausgeschaltet.Die Genfunktion wird bewertet, indem das Zielgen den Knockouts auf einem kleineren Plasmid zur Verfügung gestellt wird. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Organisation und Einrichtung der Schlüssel zur erfolgreichen Durchführung dieses Verfahrens sind. Eine ordnungsgemäße experimentelle Vorbereitung ist notwendig, um interpretierbare Ergebnisse zu erhalten.Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Vorbereitung des verdauten pBAD33-Plasmids, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Quelle: Erdogan, F., et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Übertragung eines F-Plasmids von Spender- auf Empfänger-E. coli-Zellen unter Verwendung eines Rettungsplasmids und der Selektion von Transkonjuganten durch duale Antibiotikaresistenz. Der Prozess umfasst das Mischen von Bakterienkulturen, die Inkubation ohne Schütteln, das Unterbrechen von...

F Plasmidtransfer und duale Antibiotikaauswahl in E. coli

Wir beschreiben hier drei verschiedene Protokolle für die in vitro Untersuchung der Konjugation, Transduktion, Transformation und natürliche in Staphylococcus aureus.

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Mit dem Ziel, die Verhaltensweisen der verschiedenen bakteriellen konjugative DNA-Elemente unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen, beschreiben wir ein Protokoll für die Unterschiede in der Konjugation Frequenz mit hoher Auflösung, einzuschätzen, wie effizient das Spender-Bakterium Konjugation initiiert.

Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Die Konjugation vermittelt den horizontalen Gentransfer, indem sie Plasmid-DNA über zwei verschiedene Zellen mobilisiert und so die Verbreitung nützlicher Gene erleichtert. Diese Arbeit beschreibt eine weit verbreitete Methode zur effizienten Detektion des konjugativen Plasmidtransfers, die auf der Verwendung von Differentialmarkern im konjugativen Plasmid, Spender und Empfänger basiert, um die Transkonjugation zu erkennen.

Nachweis eines horizontalen Gentransfers, der durch natürliche konjugative Plasmide in E. coli vermittelt wird

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die funktionelle Charakterisierung von Gen- und Promotorkonstrukten im sekundären Stammgewebe von Bäumen mit mittlerem bis hohem Durchsatz innerhalb vergleichsweise kurzer Zeiträume ermöglicht. Es ist effizient, einfach zu bedienen und vielseitig einsetzbar für eine Reihe von Baumarten.

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Lernen Sie konjugative Mating-Assays zur Analyse von Proteininteraktionen bei der bakteriellen Konjugation. Diese Methode nutzt homologe Rekombination und Plasmidtransfer, um spezifische Genregionen zu identifizieren.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

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