Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mitochondriale Dysfunktion im Zusammenhang mit Müdigkeit bei Krebspatienten zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der unterstützenden Krebsbehandlung zu beantworten, z. B. ob eine mitochondriale Dysfunktion mit Müdigkeit bei Krebspatienten nach einer Strahlentherapie verbunden ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie weniger invasiv ist und in der Klinik leicht eingesetzt werden kann, um Patienten mit einem Risiko für Toxizitäten aus der Krebstherapie zu identifizieren.

Diese Technik verbessert nicht nur unser Verständnis der Rolle der mitochondrialen Dysfunktion bei krebsbedingter Müdigkeit, sondern kann auch die Beurteilung verbessern und deren Behandlung optimieren. Obwohl diese Methode einen Einblick in die zugrunde liegenden Mechanismen krebsbedingter Müdigkeit geben kann, kann sie auch auf andere ermüdende Krankheitszustände wie Stoffwechsel- und Entzündungszustände angewendet werden. Im Allgemeinen kann es für Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, eine Herausforderung darstellen, Atemhemmer ohne vorherige visuelle Demonstration ordnungsgemäß in jeden Anschluss der Sensorkartusche zu injizieren.

Dieses Verfahren wird von Herrn Quang Nguyen, einem Postbac-Stipendiaten aus unserem Labor, demonstriert. Um die Sensorpatrone mit Feuchtigkeit zu versorgen, nehmen Sie sie zuerst aus der Verpackung. Geben Sie dann 200 Mikroliter kalibrierende Lösung in jede Vertiefung der Utility-Platte.

Füllen Sie außerdem jeden Graben mit 400 Mikrolitern kalibrierter Lösung. Setzen Sie dann die Sensorplatte wieder auf die Versorgungsplatte ein und beginnen Sie über Nacht mit der Hydratisierung der Kartusche in einem Inkubator ohne Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Messen Sie den Grad der Ermüdung auf der Grundlage der 13-Punkte-Funktionsbewertung der Therapie chronischer Krankheiten.

Ermüdung zu Studienbeginn, in der Mitte, bei Abschluss der EBRT und ein Jahr nach der EBRT. Bereiten Sie zunächst das Testmedium für die Messung der mitochondrialen Funktion vor. Nach der Zubereitung des Mediums auf 37 Grad Celsius erwärmen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Testmedium am Tag des Experiments vorbereitet und auf 37 Grad erwärmt wird, bevor der PH-Wert auf 7,4 eingestellt wird. Als nächstes säen Sie die PBMCs in jeder Vertiefung, um eine Konfluenz von 80 bis 90 Prozent zu erreichen. Dann die Platte 2 Minuten lang mit dem 200-fachen g drehen, damit die Zellen am Boden der Vertiefungen haften.

Entfernen Sie nach dem Schleudern das Medium aus jedem Well und spülen Sie die Wells einmal mit dem Assay-Medium aus. Geben Sie 180 Mikroliter Testmedium in jede Vertiefung, einschließlich der Hintergrundvertiefungen. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator für 45 bis 60 Minuten.

Um die Arzneimittel zu rekonstituieren, fügen Sie dem Arzneimittel 252 Mikroliter Testmedium hinzu, um eine 50 Mikromolare Stammlösung von Oligomycin zu erzeugen. Geben Sie 288 Mikroliter Testmedium zum Arzneimittel, um eine 50 Mikromolare Stammlösung von FCCP zu erzeugen. Zum Schluss fügen Sie 216 Mikroliter Testmedium hinzu, um eine 25 Mikromolare Stammlösung von Antimycin a/rotenon zu erzeugen.

Nach der Rekonstitution aller drei Arzneimittel ist die Wirkstoffsuspension eine Minute lang vortexen und dann die Arbeitslösungen verdünnt. Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter 10 mikromolare Oligomycin in Anschluss A bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar in jeder Vertiefung. Pipettieren Sie anschließend 22 Mikroliter 10 mikromolare FCCP in Anschluss B bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar in jeder Vertiefung.

Zum Schluss pipettieren Sie 25 Mikroliter 5 mikromolare Antimycin a/rotenon in Port C bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Mikromolar in jeder Vertiefung. Wählen Sie dann den Mito-Stresstest auf dem extrazellulären Flussmittelmessgerät aus. Setzen Sie anschließend die Sensorpatrone gemäß der Geräteaufforderung ein.

Das Instrument führt automatisch eine Sensorkalibrierung durch. Sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist, setzen Sie die Zellplatte für das Instrument ein, um den Rest des Assays zu beenden. Zur Herstellung der Zellproliferations-Assay-Lösung werden 5,76 Mikroliter Nukleinsäurefärbung und 28,8 Mikroliter Hintergrundsuppressor zu 1,405 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung hinzugefügt.

Nachdem der Mito Stresstest beendet ist, geben Sie 180 Mikroliter 2x Arbeitslösung direkt in das Medium in jede Vertiefung. Dann inkubieren Sie die Zellen mit der Zellproliferations-Assay-Lösung bei 37 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten. Quantifizieren Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Plattenlesegerät bei 508 Nanometern Anregung und 527 Nanometern Emission, gefolgt von der Normalisierung der OCR-Daten.

Bei der Durchführung der FCCP-Titration ist ein Mikromolar die optimale Wirkstoffkonzentration, die zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion des PBMC verwendet wird. Untersuchungen der mitochondrialen Atmung und frisch isolierter PBMCs zeigen, dass die OCR nach drei Stunden abnimmt und bis acht Stunden anhält. Die maximale Atmung, die durch die FCCP-Injektion ausgelöst wird, überschreitet jedoch auch nicht den basalen OCR-Wert.

Hier wird eine Normalisierung der mitochondrialen Funktion gezeigt, bei der die Zellen von zwei gesunden Individuen isoliert werden. Tatsächlich ist die OCR, die auf lebende Zellen normalisiert wird, die durch den grünen Fluoreszenz-DNA-Bindungsfarbstoff dargestellt werden, bei beiden gesunden Personen ähnlich. Tatsächlich wird kein signifikanter Unterschied in der basalen OCR zwischen einem gesunden und einem erschöpften Probanden beobachtet.

Der erschöpfte Proband zeigt jedoch im Vergleich zur Kontrolle einen verringerten maximalen Sauerstoffverbrauch und freie Atemkapazitäten. Es werden keine Unterschiede im nicht-mitochondrialen und ATP-bezogenen Sauerstoffverbrauch oder in der Kopplungseffizienz zwischen gesunden und erschöpften Probanden gefunden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zuerst die optimale Zelldichte und die FCCP-Konzentrationen zu bestimmen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Isolierung verschiedener Zellpopulationen, durchgeführt werden, um zukünftige mechanistische Untersuchungen, die sich auf bestimmte Zelltypen konzentrieren, zu leiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der unterstützenden Pflege, um die Rolle der mitochondrialen Dysfunktion bei erschöpften Krebspatienten zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mitochondriale Funktion und klinische Proben misst, die auch verwendet werden können, um proaktiv Patienten mit einem Risiko für die Entwicklung von Toxizitäten im Zusammenhang mit der Krebsbehandlung, einschließlich Müdigkeit, zu identifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Atemwegshemmern wie Oligomycin und Rotenon äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden.