Name: Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Isolierung primärer menschlicher Keratinozyten aus adultem Hautgewebe mittels ROCK-Inhibitor Y-27632. Dieses vereinfachte Protokoll liefert hochreine Zellen für Forschung und Klinik.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81772093), der Wissenschaft und Technologie Entwicklung Programm von Suzhou (ZXL2015128), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20161241), und ein Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Menschlichem Gewebe, die in diesem Protokoll verwendeten nach den Richtlinien des Instituts Humanforschung Ethik-Kommission behandelt wurden (NO.2015120401, Datum: 12. Mai 2015).
1. Vorbereitungen
<ol><li>Sammeln frische Erwachsenen Bauchhaut Gewebe verworfen von plastische Chirurgie am Krankenhaus in einen 50-mL-Tube mit 10 mL eiskaltes Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM). Das Präparat kann bei 4 ° C bis zu 72 h ohne erheblichen Auswirkungen auf die Zellviabilität gehalten werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Reagenzien und Kulturmedium wie unten beschrieben vor.<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/L) bis 50 mL von Phosphat-gepufferte Lösung (PBS), die Waschlösung vorzubereiten.</li>
		<li>Bereiten Sie zwei Sätze von Enzym Verdauung Lösungen: (1) bereiten Sie 50 mL Dispase (2,5 mg/mL in DMEM) und 50 mL Typ I Kollagenase (2,5 mg/mL in DMEM) separat für die konventionelle Methode; und (2) bereiten Sie 50 mL einer Mischung aus Dispase und Typ I Kollagenase (auflösen 125 mg Dispase Pulver und 125 mg Typ I Kollagenase Pulver in 50 mL DMEM) für die neue Methode. Hinweis: Alle Enzym Lösungen sollten mit einem 0,22 µm-Sieb gefiltert und at4 ° c gehalten</li>
		<li>Beide Methoden Verdauung Lösungen vorbereiten: Trypsin 0,05 % und 0,25 % Trypsin im Handel gekauft wurden. Bereiten Sie eine 10 mg/mL DNase ich Lösung durch Auflösen von 50 mg DNase ich in 5 mL PBS Pulver, mit einem 0,22 µm-Sieb Filtern und speichern Sie es bei-20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 500 mL des Mediums, die enzymatische Verdauung zu neutralisieren: DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
		<li>500 mL Inokulation Medium (Wachstum-Faktor-haltige Mittel, genannt G-Medium) vorbereiten: DMEM/F12 (3:1) Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin, 40 µg/mL Fungizone, 40 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Zuschlag von 2 % B27.</li>
		<li>100 mm Zellkultur Vorbehandeln Gerichte mit 2 mL der Beschichtung Matrix, Typ enthält ich Kollagen für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. konventionelle Methode
<ol><li>
Haut-Gewebe-Vorbehandlung
	<ol>
<li>Nehmen Sie 1,5 cm2 von Hautgewebe und waschen Sie es 1 X mit 10 mL PBS; dann spülen sie mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 s und inkubieren Sie es 2 X mit 10 mL Waschlösung (PBS, enthält 2 % Penicillin und Streptomycin), 5 min. Hinweis: Alle Waschungen sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze durchgeführt.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere Entfernen der subkutanen Fettschicht in der Kulturschale 100 mm Zelle und dann wiegen das Hautgewebe (das Gewicht beträgt 1 g in diesem Protokoll). Hinweis: Ausreichende Besatz ist sehr entscheidend für die effiziente Trennung der Epidermis von der Dermis. Die gelbliche Fettschicht kann optisch leicht unterscheiden.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf ein weiteres 100 mm steril Gericht mit der Lederhaut Seite nach unten, und dann schneiden Sie das Hautgewebe in 3 bis 4 mm breite Streifen mit einem Skalpellklinge. Hinweis: Die Dermis-Seite mit der Fettschicht ist visuell erkennbar.</li>
		<li>Das Hautgewebe in der Kulturschale 100 mm 10 mL 2,5 mg/mL Dispase-Lösung hinzu und inkubieren Sie dann die Schale über Nacht bei 4 ° C (nicht mehr als 20 h). Hinweis: Die Menge der Dispase Lösung kann berechnet werden, mit 10 mL Dispase-Lösung für die Verdauung von jedem Gramm Gewebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trennung von der Epidermis der Hautgewebe
	<ol>
<li>Am zweiten Tag die Epidermis von der Dermis, die mit einer feinen Pinzette abziehen. Hinweis: Ist es schwierig, die Oberhaut abziehen, war die Dispase Verdauung nicht ausreichend, die ist in der Regel aufgrund unzureichender Trimmen des Gewebes. In diesem Fall braucht das Gewebe eine längere Inkubationszeit.</li>
		<li>Hacken Sie die geschälte Epidermis mit 500 µL Zellkulturmedium in ein Gewebe Gülle mit Skalpellklingen; dann, mit 10 mL von 0,25 % Trypsin in einen 50-mL-Tube Aufschwemmen Sie und inkubieren Sie es 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C mit schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
	<ol>
<li>Neutralisieren Sie die Trypsin-Aktivität durch ein gleiches Volumen der Neutralisierung-Lösung (10 mL in diesem Protokoll) hinzufügen.</li>
		<li>Die epidermalen Zellen durch die Lösung nach oben und unten 20 X mit einer serologischen 10-mL-Pipette pipettieren zu distanzieren und ein 100 µm Zelle Sieb, alle restlichen Gewebe Ablagerungen zu entfernen die Zelle Lösung durchlaufen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 200 X g für 5 min nach der Filtration; Aufschwemmen der Zelle Pellet in Neutralisation Mittel zum Waschen und anschließend Zentrifugieren es wieder bei 200 X g Zelle Pellet zu erhalten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Medium Low-Calcium, serumfreien Keratinozyten (SFM). Nehmen Sie 10 µL dieser Lösung auf die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 106 Zellen mit 10 mL der SFM in 100 mm Zelle Kultur Gerichte vorbehandelt mit Beschichtung Matrix (mit Typ I Kollagen). Hinweis: Die Beschichtung ist ein notwendiger Schritt für die konventionelle Methode.</li>
		<li>Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d. Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion unter dem Mikroskop, vor und nach der Änderung des Kulturmediums.</li>
		<li>Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss. Hinweis: Alle Kultur-Gerichte sind mit der Matrix-Beschichtung vorbehandelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) die neue Methode
<ol><li>
Haut-Gewebe-Vorbehandlung
	<ol>
<li>Sammeln Sie das Gewebe wie beschrieben oben (Schritt 2.1) für die konventionelle Methode.</li>
		<li>Waschen Sie das Hautgewebe 1 X mit 10 mL PBS und dann in einen sterilen Behälter aus Kunststoff durch eine elektronische Waage (das Gewicht ist etwa 1 g in diesem Protokoll) wiegen. Hinweis: Das Mindestgewicht des Gewebes benötigt für dieses Protokoll ist 0,1 g, da es schwierig ist, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, wenn die Gewebeprobe verwendet zu klein ist. Es gibt keine maximale Gewicht des Gewebes für dieses Protokoll, die letztlich die Umschlagskapazität des Betreibers abhängt.</li>
		<li>Pinzette verwenden, um das Hautgewebe mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 spülen s.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gewebe 2 X mit 10 mL Lösung (in Schritt 2.1.1 vorbereitet), für 5 min jedes Mal zu waschen. Hinweis: Alle oben aufgeführten Waschschritte sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze (Gewebekultur Kapuze) durchgeführt.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf eine andere Zelle 100 mm steril Kulturschale.</li>
		<li>Verwendung von Skalpellklingen, Hackfleisch das Gewebe gründlich in ein Gewebe Gülle.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL PBS alle 5 min., um das Gewebe feucht zu halten. Hinweis: Nehmen Sie ca. 15 min für Schritte 3.1.5 - 3.1.7. Die oben genannten Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdauung von Hautgewebe
	<ol>
<li>Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe-Lösung in eine 50-mL-Tube. Fügen Sie 10 mL Enzym Mischung für je 1 g von Hautgewebe. Mischen Sie die Enzyme mit dem homogenisierte Gewebe gründlich.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung mit schütteln in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 h.</li>
		<li>Fügen Sie ein 1/5 Volumen von 0,25 % Trypsin (2,5 mL in diesem Protokoll) auf die Verdauung-Mischung für weitere 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie DNase ich Lösung für das Enzym-Gemisch im Verhältnis 1: 100 (V/V) (250 µL in diesem Protokoll) und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
	<ol>
<li>Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 12,5 mL Neutralisation Medium im Verhältnis 1:1. Pipette die Lösung oben und unten für ungefähr 20 x, mit einer serologischen 10-mL-Pipette, um die Zellen zu trennen.</li>
		<li>Filtern Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 µm Zelle Sieb, das Gewebe Ablagerungen zu entfernen. Zentrifugieren des Überstands 200 X g für 5 min. beobachten das Pellet am Boden des Röhrchens.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und waschen Sie die Zelle Pellet mit 10 mL der Neutralisation Medium und Zentrifuge wieder bei 200 X g für 5 min um die Zellen zu sammeln.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Inokulation Medium (G-Mittel aus Schritt 1.2.5) mit 10 µM Y-27632.</li>
		<li>Nehmen Sie 10 µL der Lösung für die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 106 Zellen mit 10 mL G-Medium in der Kulturschale 100-mm-Zelle. Hinweis: Der precoating Schritt ist nicht erforderlich für die neue Methode, und keine Entfernung der dermalen Schicht ist erforderlich.</li>
		<li>Ersetzen Sie nach 3-d die Inokulation Medium mit Low-Calcium SFM Medium. Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d. Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion, vor und nach dem Ändern des Mediums.</li>
		<li>Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss. Hinweis: Gegebenenfalls Vorbehandeln der Zellen mit 0,05 % Trypsin für 2 min und waschen Sie die Zellen mit PBS, dermale Zellen vor trypsinizing der Epidermiszellen verunreinigen zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Zelle Passagierung
<ol><li>Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie dann 2 mL 0,05 % Trypsin (pro pro 100 mm Schale).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator (37 ° C mit 5 % CO2) für 5 min.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen aus der Kulturschale abgelöst haben.</li>
	<li>Fügen Sie 8 mL DMEM mit 10 % FBS zu neutralisieren die enzymatische Reaktion und dann sammeln die Zellen in einem 15-mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min um die Zelle Pellet zu erhalten.</li>
	<li>Den überstand langsam entfernen dann Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL SFM Medium und die Anzahl der Zellen.</li>
	<li>Platte 1 x 106 Zellen mit 10 mL der SFM in jeder Zelle 100 mm Schale.</li>
	<li>Verändern Sie das Medium jeder 2 d.</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+BIology%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).</li>
<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Kultivierte primäre HKCs haben häufig genutzt, um Wunden in Kliniken mehr als drei Jahrzehnte lang zu behandeln, und seit dieser Zeit wurde es immer wichtig, ausreichende Zahl von Zellen für klinische Anwendungen in einer fristgerechten Weise effizient zu erhalten. Daher erschwert in der Praxis, die herkömmliche Isolierung-Methode, die die Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert, diese Anforderungen durch die geringe Ausbeute an Zellen und die geringe Fähigkeit, adulte Zellen die passage. Hier beschreiben wir ein...

Ziel war es, ein einfaches und effizientes Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten (HKCs) von adulten Geweben, vor allem für klinische Anwendungen isolieren zu entwickeln. Epidermalen Hautstammzellen, lokalisiert in der basalen Schicht der Haut, besitzen ein hohes Potenzial zu vermehren und zu unterscheiden und bieten Keratinozyten zur Aufrechterhaltung der Funktionen der Haut1,2,3, 4. HKCs von Geweben weit für Haut Gewebe-Engineering und Regeneration Zwecke, vor allem in der Reparatur der beschädigten Haut und in der Gentherapie für klinische Anwendungen5,6 verbreitet sindHaut isoliert. Die Schlüsselfrage für HKC-basierten Anwendungen ist es, effizient zu isolieren und zu große Anzahl von HKCs mit hohem Potenzial in-vitro-7,8zu erweitern. Obwohl verschiedene Forschergruppen Methoden entwickelt, um die Kulturen der Stamm-ähnliche HKCs zu produzieren, sind diese Methoden manchmal zeitaufwendig und kompliziert zu führen und andere Einschränkungen, z. B. niedrige Zelle Renditen und durch die Art der Haut Probe begrenzt 9verwendet. Zum Beispiel beinhaltet die traditionelle Methode, HKCs von Hautgewebe zu isolieren eine zweistufigen enzymatischen Verdauung mit einer Trennung der Epidermis von der Dermis-6. Diese Methode funktioniert in der Regel gut für neonatale Gewebe, aber es wird sehr schwierig, wenn verwendet, um Zellen aus adulten Geweben zu isolieren.
Y-27632, ein Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), wurde berichtet, erheblich verbessern die Effizienz der epidermalen Stammzellen isoliert und Kolonie Wachstum10,11,12. In einer früheren Studie entdeckten wir, dass Y-27632 das klonale Wachstum der Epidermiszellen erleichtert sondern den Ertrag der dermalen Zellen verringert durch die differentiell Steuerung des Ausdrucks der Adhäsion Moleküle13. Wir stellte auch ein neues konditionierten Inokulation Medium, genannt G-Medium, das Wachstum und Ertrag von primären epidermalen Zellen unterstützt. Durch die Kombination G-Medium mit Y-27632, kann diese neuartige Methode epidermale und dermale Zellen spontan nach Enzym Verdauung, so dass den Schritt der Epidermis-Dermis Trennung13,14trennen. Basierend auf früheren Berichten, beschreiben wir nun die Einzelheiten des Verfahrens der neuen Methode HKCs von Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>Countess automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen Inc.&nbsp;</td><td>C10227</td><td>Automatische Zellzählung&nbsp;</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>Für die Zellinkubation</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Zellzentrifuge</td></tr><tr><td>Konstanttemperaturschüttler</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>Für Wasserbäder</td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>Für das Wiegen</td></tr><tr><td>von Gewebe Zellkulturschale</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>50ml Zentrifugenröhrchen</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Für Zellzentrifuge</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Corning integriert</td><td>431792</td><td>Zellfiltration</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Lösung</td><td>Solarbio Life Science&nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Waschlösung</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Bestandteil des Neutralisationsmediums</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Kulturmedium für Epidermale Zellen</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Biologische Industrie</td><td>04-001-1AC5</td><td>Bestandteil des Neutralisationsmediums</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>Für HKC-Dissoziation</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin</td><td>Beijing Solarbio Wissenschaft & Technologie</td><td>T1350-100</td><td>Für HKC-Dissoziation</td></tr><tr><td>Beschichtungsmatrix-Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>Für Beschichtungsmatrix</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Für HKC-Isolierung</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>Für HKC-Isolierung</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>Für HKC-Isolierung</td></tr><tr><td>F12 Nährstoffmischung, Schinken</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Bestandteil von G-Medium</td></tr><tr><td>B27 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Wachstumsfaktor in G-Medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Wachstumsfaktor in G-Medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK-Inhibitor</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Vorbereitung für das G-Medium</td></tr><tr><td>EGF Rekombinantes humanes Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Wachstumsfaktor im G-Medium</td></tr><tr><td>Zellzählkit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>Zellproliferations- und Zytotoxizitätsassays</td></tr> Maus <tr><td>Anti-Humanes Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HKCs</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HKCs</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human Vimentin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3390</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung von dermalen Fibroblasten</td></tr><tr><td>Integrin & alpha; 6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>Durchflusszytometrische Analyse von HKCs</td></tr><tr><td>Ratte IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>Negativkontroll-Antikörper von &alpha; 6-integrin&nbsp; in der Durchflusszytometrie-Analyse&nbsp;</td></tr></tbody></table>

eine vereinfachte und effiziente methode zur primären menschlichen keratinozyten aus erwachsenen hautgewebe zu isolieren

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primären menschlichen Keratinozyten aus frischem Hautgewebe und ihre Erweiterung in-vitro- isoliert haben für Laborforschung und klinische Anwendungen weit verbreitet. Die konventionelle Isolationsmethode der menschlichen Keratinozyten beinhaltet ein zweistufiges sequentielle enzymatische Verdauung Verfahren, die sich bewährt hat, als ineffizient bei der Schaffung von Primärzellen von adulten Geweben aufgrund der niedrigen Zelle Wiederfindungsrate und reduzierten Zelle Lebensfähigkeit. Wir berichteten vor kurzem eine fortgeschrittene Methode, menschliche primäre epidermaler Vorläuferzellen von Hautgewebe zu isolieren, die die Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 im Medium nutzt. Im Vergleich mit dem traditionellen Protokoll, diese neue Methode ist einfacher, leichter und weniger zeitaufwendig, und epithelialen Stammzellen Ausbeute erhöht und verbessert ihre Stammzell-Eigenschaften. Darüber hinaus der neuen Methodik erfordert nicht die Trennung der Epidermis von der Dermis, und eignet sich somit für die Isolierung von Zellen aus verschiedenen Arten von adulten Geweben. Diese neue Isolationsmethode überwindet die größten Schwächen der herkömmlichen Methoden und eignet sich eher für die Herstellung von großen Zahlen von epidermalen Zellen mit hoher Potenz für Labor und klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir die neue Methode im Detail.

Schematische Darstellungen der neuen Methode (Abbildung 1A) und der konventionellen Methode (Abbildung 1 b) sind in Abbildung 1dargestellt. Die konventionelle Methode ist eine zweistufige Verdauung, die eine 2-Tages-Verfahren erfordert. Die neue Methode ist dagegen eine einstufige Verdauung, die dauert rund 3 Stunden durchzuführen. Wichtig ist, erhalten die neue One-Step-Methode zwei Populationen (ep...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Das allgemeine Ziel dieses Videos ist es, eine neue, einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Epidermiszellen aus einem adulten Hautgewebe vorzustellen. Diese fortschrittliche Methode eignet sich besser für die Herstellung einer großen Anzahl von Epidermiszellen mit hohem Potenzial sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen. Waschen Sie das Taschentuch vor dem Wiegen mit PBS.Wiegen Sie das Hautgewebe mit einer elektronischen Waage. Spülen Sie das Hautgewebe 30 Sekunden lang mit 70% Ethanol ab. Inkubieren Sie das Gewebe in PBS zweimal für jeweils fünf Minuten mit Antibiotika.Übertragen Sie das Tuch in eine andere sterile Schale und homogenisieren Sie es gründlich mit Skalpellklingen. Fügen Sie alle fünf Minuten 200 Mikroliter PBS hinzu, um das Gewebe feucht zu halten. Übertragen Sie das homogenisierte Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Fügen Sie 10 Milliliter Enzymmischung pro Gramm Hautgewebe hinzu. Mischen Sie die Enzyme gründlich mit den homogenisierten Geweben. Inkubieren Sie die Mischung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Schütteln.Fügen Sie danach 1/5 des Volumens von 0,25% Trypsin hinzu. Setzen Sie die Inkubation für 30 M

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Keratinozyten – den prominentesten Zellen der Epidermisschicht der menschlichen Haut, indem eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischen Aufschlussmethoden angewendet wird. Diese Methode hilft bei der bevorzugten Züchtung von Keratinozyten gegenüber anderen Hautzelltypen unter Verwendung eines selektiven Wachstumsmediums.

Keratinozytenisolierung in der menschlichen Haut: Eine Methode zur Kultivierung primärer Keratinozyten aus Hautproben

Wir berichten über eine Methode, um naive multipotent Haut stammenden Vorläufer (SKP) Zellen aus primären humanen Fibroblasten Kulturen zu isolieren. Wir zeigen, dass diese SKPs von Fibroblastenkulturen abgeleitet ähnliche Stammzellen Eigenschaften teilen, die, die direkt aus der menschlichen Haut Biopsien abgeleitet. Diese Zellen exprimieren die Neuralleisten Marker Nestin, zusätzlich zu der multipotenten Marker wie OCT4 und Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen. Eine Bewertungsmethode unter Verwendung von Immunfärbung wird ebenfalls berichtet.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von frisch gewonnenen (Passage 0) Keratinozyten für die Verwendung in der Lebendzellbildgebung.

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Isolierung primärer menschlicher Keratinozyten aus adultem Hautgewebe mittels ROCK-Inhibitor Y-27632. Dieses vereinfachte Protokoll liefert hochreine Zellen für Forschung und Klinik.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

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