Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren
August 25th, 2018
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.
Das allgemeine Ziel dieses Videos ist es, eine neue, einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Epidermiszellen aus einem adulten Hautgewebe vorzustellen. Diese fortschrittliche Methode eignet sich besser für die Herstellung einer großen Anzahl von Epidermiszellen mit hohem Potenzial sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen. Waschen Sie das Taschentuch vor dem Wiegen mit PBS.
Wiegen Sie das Hautgewebe mit einer elektronischen Waage. Spülen Sie das Hautgewebe 30 Sekunden lang mit 70% Ethanol ab. Inkubieren Sie das Gewebe in PBS zweimal für jeweils fünf Minuten mit Antibiotika.
Übertragen Sie das Tuch in eine andere sterile Schale und homogenisieren Sie es gründlich mit Skalpellklingen. Fügen Sie alle fünf Minuten 200 Mikroliter PBS hinzu, um das Gewebe feucht zu halten. Übertragen Sie das homogenisierte Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen.
Fügen Sie 10 Milliliter Enzymmischung pro Gramm Hautgewebe hinzu. Mischen Sie die Enzyme gründlich mit den homogenisierten Geweben. Inkubieren Sie die Mischung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Schütteln.
Fügen Sie danach 1/5 des Volumens von 0,25% Trypsin hinzu. Setzen Sie die Inkubation für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad fort. Fügen Sie der Mischung Dnase I-Lösung im Verhältnis eins zu 100 hinzu.
Dann weitere fünf Minuten inkubieren. Stoppen Sie den Aufschlussprozess, indem Sie die gleiche Menge Neutralisationsmedium hinzufügen. Pipettieren Sie die Lösung etwa 20 Mal auf und ab.
Filtern Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb, um Gewebeablagerungen zu entfernen. Bei 200 g fünf Minuten zentrifugieren. Beobachte das Pellet am Boden des Rohrs.
Entfernen Sie die Überstände und waschen Sie das Küvettenpellet mit 10 Millilitern Neutralisationsmedium. Dann bei 200 g fünf Minuten lang zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Impfmedium mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.
Platten Sie zweimal 10 bis zu den sechsten Zellen in eine 100-Millimeter-Kulturschale. Ersetzen Sie nach drei Tagen das Impfmedium durch serumfreies Keratinozytenmedium. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage.
Wenn die Zellen etwa 80% der Dichte erreicht haben, passieren Sie die Zellen. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Falls erforderlich, trypsinisieren Sie zwei Minuten lang und waschen Sie die Zellen mit PBS, um kontaminierte Hautzellen zu entfernen.
Fügen Sie das gleiche Volumen des Neutralisationsmediums hinzu. Bei 200 g fünf Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie abschließend die Überstände und resuspendieren Sie das Zellpellet
.Die isolierten Keratinozyten aus menschlichem Hautgewebe wurden getrennt nach zwei Methoden inkubiert. Die herkömmliche Methode ist ein zweistufiger Aufschluss, der ein zweitägiges Verfahren umfasst. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der neuen Methode um einen einstufigen Aufschluss, der etwa drei Stunden dauert.
Am dritten Tag können wir leicht viele Zellcluster finden, die mit der neuen Methode kultiviert wurden, während dieses Phänomen bei der herkömmlichen Methode nicht auftritt. Am fünften Tag wurde beobachtet, dass die neue Methode eine größere Menge an Primärzellen produzierte. Um den Differenzierungsstatus von kultivierten Keratinozyten zu testen, analysierten wir den Basalzellmarker K5 und den terminalen Differenzierungsmarker Loricrin.
Wir fanden heraus, dass 90% der gesamten Zellen K5-positiv waren, aber weniger als 10% der Zellen Loricrin in der dritten Passage exprimierten, was darauf hindeutet, dass es sich um undifferenzierte Keratinozyten handelt. Wir überprüften die Expression von Vimentin, das im dermalen Fibroblasten exprimiert wird, um die Kontamination der Hautzellen während der Isolierung zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass etwa 3% der Hautzellen in der ersten Passage auftraten, aber nur etwa 0,02% der Hautzellen in der dritten Passage nachgewiesen wurden, was auf eine hohe Reinheit der Epidermiszellen nach der Passage hinweist.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein vereinfachtes Protokoll zur Isolierung primärer humaner Keratinozyten aus erwachsenem Hautgewebe. Die Methode nutzt den ROCK-Inhibitor Y-27632, um die Trennung von Epidermiszellen von Dermiszellen zu erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Dermatologie
- Regenerative Medizin
Hintergrund
- Primäre humane Keratinozyten sind für verschiedene Forschungsanwendungen unerlässlich.
- Herkömmliche Isolationsmethoden können komplex und zeitaufwendig sein.
- Die Verwendung von ROCK-Inhibitor Y-27632 bietet einen effizienteren Ansatz.
- Isolierte Keratinozyten können sowohl in Labor- als auch in klinischen Umgebungen eingesetzt werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer effizienteren Methode zur Isolierung von Epidermiszellen.
- Verbesserung der Ausbeute an epidermalen Zellen mit hohem Potenzial.
- Erleichterung der Forschung und klinischen Anwendungen mit Hautzellen.
Verwendete Methoden
- Hautgewebe vor dem Wiegen mit PBS waschen.
- Das Hautgewebe mit einer elektronischen Waage wiegen.
- Das Gewebe 30 Sekunden lang mit 70% Ethanol abspülen.
- Das Gewebe zweimal für jeweils fünf Minuten in PBS mit Antibiotika inkubieren.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll isoliert erfolgreich primäre Keratinozyten.
- Es wurden hohe Ausbeuten an lebensfähigen Epidermiszellen erhalten.
- Die Methode ist reproduzierbar und effizient.
- Die isolierten Zellen können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode vereinfacht die Isolierung primärer Keratinozyten.
- Sie bietet einen zuverlässigen Ansatz für Forscher in diesem Bereich.
- Die Verwendung von ROCK-Inhibitor verbessert die Zellausbeute und -lebensfähigkeit.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
