Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Betazellen zu verstehen. Wie zum Beispiel die Funktion der heterogenen IT zwischen einzelnen Beta-Zellen innerhalb einer Insel. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die räumliche und zeitliche Auflösung, die durch die Live-Bildgebung der Betazellen ermöglicht wird.

Wir können die Kalziumschwingungen innerhalb einzelner Betazellen erfassen. Nachdem Sie einen Fisch gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, übertragen Sie ihn in eine Petrischale, die HBSS-Lösung mit Kalzium und Magnesium enthält. Unter einem Stereomikroskop, das mit einer Fluoreszenzlampe und einem roten Filterwürfel ausgestattet ist, schneiden Sie dann mit einer scharfen Pinzette die Haut vom Mund bis zur Analflosse.

Ziehe die Schnitte auf der rechten Seite ab, um den Bauch freizulegen, wodurch die inneren Organe freigelegt werden. Verwenden Sie dann die rote Fluoreszenz, um die mKO2-Expression in Betazellen zu identifizieren, und lokalisieren Sie die Inseln. Reinigen Sie die primäre Insel, indem Sie das umgebende Gewebe wie Leber und Adipozyten vorsichtig entfernen.

Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die Insel nicht zu verletzen oder zu stoßen. Pipettieren Sie anschließend einen 30-Mikroliter-Tropfen HBSS in die Mitte einer Schale mit Glasboden. Übertragen Sie dann das sezierte Inselchen in den Tropfen.

Waschen Sie das Inselchen bei HBSS einmal vorsichtig und verwenden Sie dann 30 Mikroliter Fibrinogen-Arbeitslösung, um es einmal zu waschen. Vermeiden Sie es, das Inselchen während der Waschschritte zu trocknen, da dies zum Zelltod führen könnte. Geben Sie langsam und vorsichtig 10 Mikroliter von 10 Einheiten pro Milliliter Thrombinlösung auf die Insel.

Lassen Sie das Inselchen und das Gericht 15 bis 20 Minuten unberührt. Beobachten Sie, dass der Fibrinogen-Thrombin-Tropfen viskos und stabil wird. Es muss ausreichend Zeit eingeräumt werden, damit das Thrombin in der Fibrinogenlösung polymerisieren kann.

Andernfalls bietet die Form während der Bildgebung keine Stabilität. Um eine Ex-vivo-Live-Bildgebung der GCaMP-Fluoreszenz durchzuführen, geben Sie 200 Mikroliter HBSS auf die Form und platzieren Sie die Schale vorsichtig auf dem Plattenhalter des konfokalen Mikroskops. Suchen Sie dann mit einem 20X 0,8 NA-Fehlerobjektiv und der Hellfeldoption die Insel.

Wenn Sie den Filter für die rote Fluoreszenz verwenden, um die nukleare mKO2-Fluoreszenz in Betazellen zu betrachten, konzentrieren Sie sich auf die Insel. Einzelne Zellkerne sollten gut sichtbar sein. Suchen Sie eine klare Bildgebungsebene, indem Sie sich manuell durch die Dicke der Insel entlang der Z-Achse bewegen.

Stellen Sie sicher, dass die Bildgebungsebene 50 bis 100 Betazellen für die Bildgebung enthält und die Helligkeit der nuklearen mKO2-Fluoreszenz gleichmäßig ist, insbesondere in der Mitte des Inselchens. Richten Sie als Nächstes im Smart-Setup-Menü eine sequenzielle Erfassung für GCaMP6- und mKO2-Fluoreszenz mit den folgenden Einstellungen ein. Für GCaMP6 wählen Sie eine Anregung von 488 Nanometern und eine ungefähre Emission von 500 bis 555 Nanometern.

Wählen Sie unter Falschfarbe die Option GFP aus. Für mKO2 wählen Sie eine Anregung von 561 Nanometern und eine Emission von 570 bis 630 Nanometern. Für die Falschfarbe wählen Sie mCherry.

Legen Sie im Aufnahmemodus die Bildauflösung auf 1.024 x 1.024 Pixel, die Geschwindigkeit auf 10 und die Mittelwertbildung auf eins fest. Starten Sie eine kontinuierliche Aufzeichnung, indem Sie die Option für Zeitreihen auswählen und die Dauer auf 500 Zyklen mit einer Erfassungszeit von ca. zwei Sekunden pro Frame einstellen. Behalten Sie den Bildgebungszyklus im Auge.

Nach den ersten 50 Bildern, ohne die Bildaufnahme zu stören, pipettieren Sie vorsichtig fünf Mikroliter 200 Millimolare D-Glukoselösung auf das Gel, das die Insel hält. Nehmen Sie dann 150 Bilder mit 10 Millimolar Glukose auf. Die ersten 50 Bilder der Zeitreihe entsprechen der Betazellaktivität bei fünf Millimolare Glukose.

Das ist die basale Aktivität. Eine reagierende Beta-Zelle zeigt mit der Zeit ein Zunehmen und Abnehmen der grünen Fluoreszenz. Erhöhen Sie bei 200 Bildern die Glukosekonzentration auf 20 Millimolar, indem Sie vorsichtig 10 Mikroliter 200 Millimolare D-Glukose hinzufügen.

Nehmen Sie dann 150 Bilder mit einer Konzentration von 20 Millimolar auf. Um die Bilddatei in FIJI zu öffnen, wählen Sie Plugin, LSM Toolbox, show LSM Toolbox. Klicken Sie in der LSM Toolbox auf Open LSM und wählen Sie die Bilddatei aus.

Öffnen Sie unter Tools im Menü Analysieren den ROI-Manager. Zeichnen Sie mit dem Polygonauswahlwerkzeug in der Symbolleiste manuell den ROI. Zeichnen Sie den ROI im roten Kanal, so dass er einen Bereich abdeckt, der größer als ein Zellkern ist, um einen Teil des Zytoplasmas der Zelle einzuschließen.

Stellen Sie sicher, dass die ROI-Position zwischen den Frames konsistent ist, und passen Sie die Position bei Bedarf an. Fügen Sie die ausgewählten ROIs zum ROI-Manager hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken. Wählen Sie mehrere ROIs aus und fügen Sie sie hinzu, um Daten in mehreren Zellen zu erhalten.

Wählen Sie anschließend im Menü "Analysieren" die Option "Messungen festlegen" aus. Wählen Sie dann Integrierte Dichte, um die Extraktion der Gesamtfluoreszenzintensität innerhalb des Bereichs festzulegen. Wechseln Sie zu dem grünen Kanal, der die GCaMP-Fluoreszenz enthält, und wählen Sie im ROI-Manager Multi Measure aus.

Dadurch werden die Intensitätsmessungen für die Zellen in der gesamten Zeitreihe bereitgestellt. Speichern Sie die FIJI-Ausgabe als kommagetrennte Textdatei. Rufen Sie aus der LSM Toolbox die Zeitstempel der Bildrahmen ab.

Verwenden Sie Apply Stamps, Apply t-stamps, File Name, Dump to textfile, um die Zeitstempel zu erhalten. Speichern Sie die Zeitstempel mit der Option Speichern unter oder kopieren Sie sie in die Tabelle. Wenn Sie die Intensitätswerte für alle Zellen kompiliert haben, führen Sie die Analyse Zelle für Zelle oder automatisch durch.

Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. In diesem Experiment wurden einzelne primäre Insel-Betazellen aus 45 DPF transgenen Linien, die nukleäres mKO2 und GCaMP6 spezifisch in Beta-Zellen exprimieren, mit einer Glukoserampe stimuliert und dann mit Kaliumchlorid depolarisiert. Die Aktivität der Zellen wurde analysiert.

Mit Hilfe von FIJI und Datenanalysesoftware wurde die GCaMP6-Fluoreszenzintensität einzelner Betazellen extrahiert und normalisiert. Wie aus dieser Spur der Fluoreszenzintensität ersichtlich ist, zeigen einzelne Betazellen Oszillationen in der GCaMP6-Fluoreszenz, wenn sie mit Glukose stimuliert werden, und die Zugabe von Kaliumchlorid stabilisiert die Fluoreszenz. Die Technik bietet eine zelluläre Auflösung der Glukosereaktionsfähigkeit der Betazellen und einen Einblick in ihre Funktionalität.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lebensfähigkeit der Betazellen zu überprüfen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z.B. genetische Manipulationen, durchgeführt werden, um die Rolle bestimmter Gene für die Funktion von Betazellen zu verstehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Glukosereaktion innerhalb einzelner Betazellen misst.