Eine Methode zur Erhaltung von Feuchtgebietswurzeln und Rhizosphären für die Elementarbildgebung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Probenahme, Erhaltung und Sektionierung intakter Wurzeln und des umgebenden Rhizosphärenbodens aus Feuchtgebieten unter Verwendung von Reis(Oryza sativa L.) als Modellart. Nach der Konservierung kann die Probe mit elementaren bildgebungstechnischen Verfahren wie der chemischen Synchrotron-Röntgenfluoreszenz (RFA) analysiert werden.

Diese Methode bietet Forschern eine neue Möglichkeit, Wasserpflanzenwurzeln, die umgebende Rhizosphäre und den Massenboden für elementare Bildgebungsverfahren vorzubereiten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ schnell und erschwinglich ist und gleichzeitig die Verteilung und Artbildung von elementen von Interesse genau beisetzt. Diese Technik kann verwendet werden, um Fragen zu vielen Elementen und Pflanzensystemen zu beantworten, von Nährstoffen in landwirtschaftlichen Systemen bis hin zu Verbleib und Transport von Schadstoffen in Fesselsystemen.

Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten und gleichzeitig auf den gewünschten Bereich oder die Bereiche des Wurzelsystems für die Probenahme zu achten. Und nehmen Sie mehrere Proben pro Wurzelsystem. Um die Slam-Gefriergeräte für ein Experiment vorzubereiten, legen Sie zwei, fünf mal fünf mal 15 Zentimeter große Kupferblöcke horizontal in einen sauberen Kühler, der flüssigen Stickstoff halten kann.

Und mit der entsprechenden PSA genug flüssigen Stickstoff in den Kühler gießen, um die Blöcke zu tauchen. Sobald das Sprudeln nachlässt, platzieren Sie einen Abstandhalter an jedem Ende eines Kupferblocks. Dann, mit zangen und kryogenen Handschuhen, stellen Sie den anderen Kupferblog an seinem Ende, um die Rückholung zu erleichtern, wenn die Probe an Ort und Stelle ist.

Um die Probe zu sammeln, verwenden Sie entweder eine Topfpflanze oder verwenden Sie eine Schaufel, um die gewünschte Pflanze und Rhizosphäre aus dem nassen Boden zu extrahieren, wobei Sie darauf achten, dass das gegrabene Loch viel größer ist als das gewünschte Wurzelvolumen. Verwenden Sie eine Stahlklinge, um überschüssigen Boden wegzuschneiden, und achten Sie darauf, den Boden innerhalb des gewünschten Bereichs nicht zu stören. Wenn die gewünschten Bereiche erreicht sind, schneiden Sie einen etwa drei mal drei mal zwei Zentimeter großen Wurzelwürfel und setzen Sie den Würfel sofort zwischen die beiden Abstandshalter auf den horizontalen Kupferblock.

Für ein Slam-Einfrieren der Probe wurden die kryogenen Handschuhe verwendet, um den vertikalen Kupferblock für etwa fünf Minuten auf die Abstandshalter zu legen. Wenn das Sprudeln nachlässt, wird die gefrorene Rhizosphärenwürfelprobe in ein Stück vorbeschriftetes Aluminiumfolienquadrat übertragen. Um die Bodenwürfel gefrieren zu trocknen, wenn der Gefriertrockner den richtigen Vakuumdruck und die richtige Temperatur erreicht hat, legen Sie eine gefrorene Rhizosphärenwürfelprobe für sauberes und säuregewaschenes 50-Milliliter-Rohr oder direkt in den Gefriertrockner und verwenden Sie ein sauberes Einwegtuch, um zu verhindern, dass Staub in die Vakuumpumpe gelangt.

Legen Sie die Proben mindestens einige Tage in das Gefriertrocknergefäß, bis sie trocken sind. Wenn die Gewebe gefriergetrocknet wurden, verwenden Sie eine Stahlklinge, um die Bodenwürfel auf eine für die Analyse geeignete Größe zu trocknen, bevor Sie die Würfel in etikettierte Formen in einem Vakuumausscheider legen. Nachdem Sie Epoxid gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet haben, verwenden Sie einen Tropfer, um der Form auf einer Seite des Bodens langsam Epoxid hinzuzufügen, bis das Epoxid die Probe vollständig bedeckt.

Der Boden verdunkelt sich in der Farbe, wenn das Epoxid den Boden benetzt. Sobald die Formen mit Epoxidharz gefüllt sind, schließen Sie den Austrocknungsmittel und schalten Sie das Vakuum ein. Überprüfen Sie den Epoxidgehalt alle 30 bis 90 Minuten für die ersten ein bis vier Stunden und fügen Sie bei Bedarf zusätzliches Epoxid hinzu.

Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, entfernen Sie die Probe. Verwenden Sie nach dem Einbetten eine Diamantklingen-Präzisions-Nasssäge, um die Probe zu schneiden. Schneiden Sie die Probe in eine andere Richtung, wenn im vorherigen Schnitt keine Wurzeln erhalten wurden.

Nach dem Trimmen die Schnittseite jeder Probe manuell mit zunehmend feinerem Schleifpapier für 30 Sekunden pro Körnungsgröße abschleifen. In dieser Abbildung können mehrere Wurzeldurchmesser innerhalb der Bodenmatrix als Querschnitte beobachtet werden. Die Wurzeln können unterschiedliche Qualitätsniveaus aufweisen.

In diesem Bild können beispielsweise eine gut erhaltene Wurzel, eine durch den Gefriertrocknungsprozess verzerrte Wurzel und eine Wurzel, die während des Dünnschnittprozesses herausgezogen wurde, beobachtet werden. Die Analyse dieses Wurzeltransversalschnitts mit einer lateralen Wurzel im Längsschnitt mittels Synchrotron-Röntgenfluoreszenzbildgebung, wie gezeigt, ermöglicht den Nachweis von Eisen, Mangan und Arsen. Das Vorhandensein von Eisen im Boden und um die Wurzel in der Eisenplatte ist auch in den Lichtmikroskopischen Bildern sichtbar.

Mangan ist einzigartig im Kortex der lateralen Wurzel vorhanden, ko-lokalisiert sich aber auch mit Eisen in einigen Bereichen innerhalb der Eisenplaque als grün-blauer Farbton. Arsen wird hauptsächlich im Gefäßsystem der seitenseitigen Wurzel gefunden, die in das Gefäßsystem der Primärwurzel überführt. Die chemische Artbildung zeigt eine Variabilität in der Lokalisation der Arsenspezies.

Wie in diesem dreifarbigen Diagramm beobachtet, sind Arsenit und Arseniterglutathion eng im Gefäßsystem verbunden, während Arsenat hauptsächlich in der Außenseite der Wurzel lokalisiert ist, die mit der Eisenplaque verbunden ist. Bestimmen Sie vor der Probenentnahme den gewünschten Teil des Wurzelsystems für die Elementarbildgebung. Dadurch wird die Positionsausrichtung des entfernten Stammschlüssels bestimmt.

Nach diesem Protokoll können Proben im Mikrometerbereich oder gröber mit einer Vielzahl von Techniken abgebildet werden, abhängig von den spezifischen Forschungsfragen, elementen des Interesses oder der verfügbaren Instrumentierung.