Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Das Ziel dieses Videos ist es, eine Methode zu beschreiben, die den Durchsatz erhöht und gleichzeitig Aufwand und Genauigkeit für die Extraktion von Lipiden aus Zellmembranen von Mikroorganismen ausgleicht, um sowohl die Gesamtlipide als auch die relative Häufigkeit von Indikatorlipiden zu charakterisieren, um die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft im Boden zu bestimmen und Studien mit vielen Proben durchzuführen. Vor Ort sollten Sie die Heterogenität des Bodens berücksichtigen, indem Sie Bodenproben so sammeln, dass Ihr Standort repräsentiert wird. Um die mikrobielle Gemeinschaft zum Zeitpunkt der Probenahme zu erhalten, sollten die Proben vom Feld auf Eis transportiert werden.

Zurück im Labor entfernen Sie Wurzeln und Steine und brechen die Erdklumpen durch grobes Sieben auf. Dies dient auch der Homogenisierung Ihrer Probe. Bereiten Sie sich auf die Gefriertrocknung vor, indem Sie die Teilproben in geeignete Behälter geben und so schnell wie möglich gefriertrocknen.

Sobald die Böden gefriergetrocknet sind, lagern Sie sie bis zur Extraktion in einem verschlossenen Behälter mit Trockenmittel. Es ist am besten, tiefgekühlte Böden bei 80 Grad C.As einer Vorbereitung für die Extraktion zu lagern, gefriergetrocknete Böden aus der Lagerung zu nehmen und zu mahlen. Zu den Methoden zum Mahlen gehören Kugelmühle, Kugelmesser oder Mörser und Stößel.

Nachdem Sie die Erde erneut zerkleinert haben, homogenisieren Sie Ihre Bodenproben gründlich und lagern Sie sie im Gefrierschrank. Alle Laborgeräte müssen peinlich sauber sein. Reinigungsmittelreste, Fette oder Schmutz können die Ergebnisse beeinträchtigen, indem sie im endgültigen GC-Chromatogramm als Peak erscheinen.

Die Extraktionen werden in 30-Milliliter-Teflon-Zentrifugenröhrchen durchgeführt, die mit Lösungsmittel gespült werden müssen. Geben Sie zwei bis drei Milliliter Hexan in die Röhrchen und wirbeln Sie sie einige Sekunden lang. Dekantieren Sie das Hexan in ein anderes Röhrchen und wirbeln Sie es ein.

Mit zwei bis drei Millilitern Hexan lassen sich sechs Röhrchen seriell spülen. Lagern Sie mit Hexan gespülte Rohre kopfüber im Abzug und entsorgen Sie das verbrauchte Hexan in einem entsprechenden Abfallbehälter. Glaswaren können unmittelbar vor der Verwendung gedämpft oder mit Lösungsmittel gespült werden.

Die Dämpfung stellt sicher, dass die Gläser durch Oxidation von Rückständen bei hohen Temperaturen sauber sind. Wickeln Sie die Gläser in zwei bis drei Lagen Alufolie ein und legen Sie sie in den Muffelofen. Auf 450 Grad C einstellen und sobald der Ofen den Sollwert erreicht hat, mindestens 4 1/2 Stunden backen.

Lassen Sie mindestens eine Stunde abkühlen, bevor Sie es aus dem Ofen nehmen. Etikettieren und wiegen Sie mit Hexan gespülte Teflonrohre. Geben Sie Erde in Teflon-Zentrifugenröhrchen und wiegen Sie die Bodenmasse erneut.

Stellen Sie immer mindestens zwei Rohlinge pro Charge her und fügen Sie einen Prüfstandard bei, vorzugsweise einen Boden, der zuvor extrahiert wurde, wenn Sie überprüfen möchten, ob die Extraktion korrekt funktioniert hat. Lipid-Extraktionen. Bereiten Sie drei Nachpipetten von fünf bis 10 Millilitern für Phosphatpuffer, Chloroform und Methanol vor.

Chloroform ist eine sehr dichte Flüssigkeit mit einer niedrigen Oberflächenspannung. Achten Sie darauf, dass die Menge, die Sie ausgeben, genau und konsistent ist. Halten Sie die Flasche mindestens zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt.

Geben Sie in der Abzugshaube die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge in den Boden im Teflonrohr, Phosphatpuffer, Chloroform und Methanol. Dies ist die erste physikalische Extraktion von Lipiden aus Ihrem Probenmaterial. Die Rezepturen für Reagenzienlösungen sind im schriftlichen Protokoll enthalten.

Die Lösungsmittelanteile und die Reihenfolge der Zugabe sind wichtig für die richtige Trennung der organischen und der wässrigen Phase. Lassen Sie die Böden nach der Pufferzugabe nass werden, bevor Sie das Chloroform hinzufügen. Wenn es sinnvoll ist, können die Extraktionsmittel kombiniert und als einzelnes Aliquot für die zweite und alle nachfolgenden Extraktionen hinzugefügt werden.

Verschließen Sie die Teflonschläuche fest und decken Sie sie ab, um sie vor Licht zu schützen. Legen Sie sie horizontal auf den Schüttler und achten Sie darauf, dass sie gut befestigt sind. Bei einer Geschwindigkeitseinstellung von hoch schütteln Sie für eine Stunde.

Während die Röhrchen schütteln, bereiten Sie zwei lange Glasröhrchen für jede Probe wie folgt vor. Beschriften Sie das Röhrchen, fügen Sie das gleiche Volumen Chloroform hinzu, das dem Boden zugesetzt wurde, und ein gleiches Volumen Phosphatpuffer. Nachdem Sie die Teflonröhrchen bei 25 °C aus dem Schüttler genommen haben, zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 2.500 U/min.

Dann wird im Abzug bei ausgeschaltetem Licht der Überstand aus dem Teflonrohr in eines der langen Rohre umgefüllt. Die Phasentrennung sollte im Glasrohr sichtbar sein. Die untere Schicht enthält das organische Lösungsmittel, hauptsächlich Chloroform, und die Lipide.

Diese Extraktion wird wiederholt. Gießen Sie den Überstand in das zweite zuvor vorbereitete Röhrchen. Jetzt haben Sie die Lipide zweimal physikalisch aus dem Boden extrahiert.

Für die meisten Böden ist dies ausreichend. Verschließen Sie alle Tuben der langen Klasse sicher mit teflongefütterten Kappen und drehen Sie sie zum Mischen 10 Mal um. Trennen Sie die Phasen über Nacht durch die Schwerkraft.

Lassen Sie die Proben über Nacht ungestört stehen, um die Trennung der beiden Phasen zu vervollständigen. Bewahren Sie dazu die Proben in einem dunklen Schrank oder in Alufolie abgedeckt bei Raumtemperatur auf. Es ist in Ordnung, die Extrakte über das Wochenende trennen zu lassen.

Tag zwei, Isolierung von Lipiden. Am zweiten Tag wird die wässrige Schicht abgesaugt und die Lipide konzentriert, indem das Lösungsmittel in einem Vakuumverdampfungssystem entfernt wird. Die Proben können auch getrocknet werden, indem sie in ein Wasser- oder Sandbad gelegt und mit einem sanften Stickstoffstrahl bestrichen werden.

Die Flüssigkeit in den Röhrchen sollte nun gut abgeschieden und weitgehend klar sein. Wenn nicht, oder wenn die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten besonders dick ist, lassen Sie die Trennung für einen weiteren Tag weitergehen. Richten Sie einen Vakuumsauger in der Haube ein.

Dabei handelt es sich um einen Seitenarmkolben, der mit einer Vakuumpumpe mit einem Blatt-Tygon-Schlauch und einer Weidepipette verbunden ist. Bei laufender Pumpe die wässrige Phase mit der Pipette in den Kolben abziehen. Saugen Sie die oberste Schicht und die Schnittstelle an.

Dies wird ungefähr 2/3 des Weges nach unten sein. Mach das mit den zwei bis drei Sätzen Glasröhren. Die oberste Schicht kann einige Erdpartikel enthalten.

Entfernen Sie diese, wenn möglich. Kombinieren Sie den Extrakt aus dem zweiten und/oder dritten Satz Röhrchen mit dem aus den ersten beiden, indem Sie ihn vorsichtig dekantieren. Versuchen Sie, das Gießen von festem Material auszuschließen und spülen Sie die Wände des Rohrs durch Drehen.

Verwenden Sie für jede Probe eine saubere Pipette und wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Proben. Sobald die Chloroform-Extrakte kombiniert wurden und einige Minuten eingewirkt haben, untersuchen Sie die Oberfläche der Flüssigkeit. Oft bildet sich eine dünne Schicht Restwasser.

Wenn dies der Fall ist, aspirieren Sie, bevor Sie fortfahren. Restwasser kann Fettsäure-Doppelbindungen angreifen, aber eine sehr kleine Menge sollte beim Trocknen der Proben mit den Lösungsmitteln mitverdampfen. Trocknen Sie alle Proben mit dem Vakuumverdampfungsgerät.

Verschließen Sie die Röhrchen fest und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank bei 80 Grad C.Dritter Tag, Verseifung und Methylierung. Schalten Sie zuerst die Wasserbäder ein. Überprüfen Sie den Wasserstand und stellen Sie das erste Bad auf 95 °C und das zweite auf 80 °C ein.Geben Sie mit einer erneuten Pipette einen Milliliter des Verseifungsreagenz, Reagenz 1, zu den getrockneten Lipiden.

Den Deckel fest verschließen, kurz vortexen und auf ein Gitter legen. Sobald Sie mit diesem Schritt fertig sind, legen Sie das Gestell mit den Röhrchen in das 95 Grad Celsius heiße Wasserbad und warten Sie fünf Minuten. Nehmen Sie das Gestell mit den Schläuchen aus der Badewanne und überprüfen Sie die Schläuche auf Undichtigkeiten.

Dies wird dadurch angezeigt, dass Blasen wie ein Schaum in der Röhre aufsteigen. Ziehen Sie die Kappen der undichten Schläuche wieder fest oder setzen Sie sie wieder auf. Erhitzen Sie die Röhren im Wasserbad für weitere 10 Minuten.

Reduzieren Sie die Temperatureinstellung am Wasserbad auf 80 Grad C und setzen Sie die Inkubation für weitere 15 Minuten fort. Entfernen Sie die Röhrchen und kühlen Sie es ab, indem Sie das Gestell in einen Topf mit Leitungswasser stellen. Verwenden Sie kein Eiswasser.

Sobald die Proben abgekühlt sind, geben Sie zwei Milliliter des Methylierungsreagenzes (Reagenz 2) zu jeder Probe. Auch hier wieder fest verschließen und fünf bis 10 Sekunden lang vortexen. Körnige Salze können als Fällungsmittel in der Lösung sichtbar werden, was manchmal aufgrund von überschüssigen Reagenzien geschieht.

Stellen Sie das Gestell in das 80 Grad heiße Wasserbad und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Nehmen Sie das Gestell mit den Röhrchen aus dem Wasserbad und legen Sie es zum Abkühlen in einen Topf mit Leitungswasser. Bewegen Sie das Rack, um den Abkühlprozess zu beschleunigen.

Geben Sie mit einer erneuten Pipette 1,25 Milliliter Hexan und Methyltertiärbutylether, Reagenz 3, in jedes Röhrchen, um die Phase zu extrahieren. Verschließen Sie die Verschlüsse fest und legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten auf einen Shaker. Lassen Sie das Gestell mit den Röhrchen nach dem Schütteln 10 Minuten ruhen, damit sich die Phasen trennen können.

Die organische Phase, die nun die oberste Schicht bildet, wird mit einer Weidepipette in ein kurzes Glasröhrchen überführt. Es ist am besten, den größten Teil der Flüssigkeit zurückzugewinnen. Sehr kleine Mengen der wässrigen Phase beeinträchtigen die Extraktion nicht.

Wiederholen Sie die Extraktion aus der wässrigen Phase, indem Sie Reagenz 3 hinzufügen, schütteln, die Phasen trennen lassen und die obere Phase übertragen. Je nach Zustand der unteren Phase können Sie dies noch einmal für insgesamt drei Transfers wiederholen. Geben Sie 3 Milliliter des Basiswaschmittels, Reagenz 4, eine verdünnte Lösung von Natriumhydroxid, zu den Extrakten in den kurzen Röhrchen.

Verschließen Sie die Reagenzgläser fest und wirbeln Sie sie 20 bis 30 Sekunden lang vor und zentrifugieren Sie sie dann drei Minuten lang bei 2.000 U/min. Nach der Zentrifugation wird mit einer sauberen Weidepipette die obere organische Phase abgesaugt und in ein braunes Vier-Milliliter-Fläschchen überführt. Seien Sie sehr vorsichtig, dass Sie nichts von der wässrigen Phase aspirieren.

Der nächste Schritt besteht darin, das Lösungsmittel in einer Vakuumverdampfungsapparatur bis zur Trockenheit zu verdampfen. Tag vier, Vorbereitung der Extrakte für die GC-Analyse. Geben Sie mit der Pipette 100 Mikroliter Reagenz 3 in jedes der 4-Milliliter-Fläschchen, die die getrocknete Phase enthalten.

Wirbeln Sie die Probe vor und lassen Sie sie dann 10 Minuten stehen. Übertragen Sie die suspendierten FAMEs mit der zweiten Pipetnette vorsichtig in eine GC-Durchstechflasche. Geben Sie ein weiteres Aliquot des Lösungsmittels in das Vier-Milliliter-Fläschchen und wirbeln Sie es kurz ein.

Rollen Sie das Fläschchen, um sicherzustellen, dass die verbleibenden FAMEs an den Wänden des Fläschchens aufgelöst werden. Übertragen Sie das Lösungsmittel erneut mit der zweiten Pipette in die Durchstechflasche GC. Schließen Sie den Transfer ab, indem Sie ein drittes Aliquot Lösungsmittel in die Durchstechflasche geben, vortexen und in die GC-Durchstechflasche übertragen.

Verschließen Sie das GC-Fläschchen und bewahren Sie es im Gefrierschrank auf. Bewahren Sie versiegelte GC-Fläschchen vor der Analyse im Gefrierschrank auf. GC-Analyse.

Um dieses System verwenden zu können, muss die Analyse mit einer bestimmten GC-Spalte durchgeführt werden. Der Gaschromatograph ist mit einem geteilten, spaltlosen Einlass ausgestattet, der mit einer vier Millimeter Innendurchmesser Glaseinlaufwanne mit einem deaktivierten Glaswollestopfen ausgestattet ist. Der Einlass ist auf 250 Grad C eingestellt und wird im Konstantdruckmodus betrieben.

Das Trägergas ist Wasserstoff. Stickstoff und Luft werden als Stützgase für den Detektor benötigt. Zum Einsatz kommt eine Agilent Ultra 2 Säule.

Die Säule ist 25 Meter lang, hat einen Innendurchmesser von 2 Millimetern und eine Dicke von 33 Mikrometern stationärer Phasenschicht. Die stationäre Phase in dieser Säule besteht aus 5 % Phenyl und 95 % Methylpolysiloxan, die auch als Säule vom Typ DB-5 bezeichnet wird. Um die Lipidextrakte zu analysieren, wird ein Aliquot von zwei Mikrolitern in einem Split-Verhältnis von 100:1 injiziert, wobei die Ofentemperatur bei 170 Grad C.Post Injektion liegt, der Ofen ist so programmiert, dass er bei fünf Grad pro Minute auf 300 Grad C ansteigt und dann 12 Minuten lang hält.

Es wird eine Reihe von Injektionen des MIDI-Standards vorgenommen und die Ergebnisse werden verwendet, um Anpassungen gemäß den Anweisungen im MIDI-Handbuch vorzunehmen. Nach dieser Kalibrierung kann es vorkommen, dass das System gelegentlich kleinere Anpassungen benötigt, aber in der Regel mit diesen Parametern gute Ergebnisse erzielen sollte. Das MIDI-System erstellt für jedes Sample einen Bericht, der eine Tabelle mit einer Zeile pro realisiertem Peak enthält.

Die Software meldet die Peak-Retentionszeit, die Peak-Fläche, die Peak-Identifizierung zusammen mit der ECL oder der geschätzten Kettenlänge, einem Parameter, der zur Peak-Identifizierung verwendet wird, und einem Antwortfaktor, einem Parameter, der zur Normalisierung von Variationen und der Detektorreaktion in Bezug auf die Retentionszeit verwendet wird. Die ECL drückt aus, wo in einer Reihe von geradkettigen FAMEs jeder unbekannte FAME eluiert. Wenn also beispielsweise die Retentionszeit eines Unbekannten auf halbem Weg zwischen denen einer 12- und 13-Kohlenstoff-Kette liegt, wird die ECL als 12,5-Kohlenstoff-Kette angegeben.

Die Software vergleicht die ECL jedes Peaks mit denen der FAMEs in einer Datenbank und weist dem Unbekannten bei Übereinstimmungen den entsprechenden Namen zu. In Fällen, in denen zwei FAMEs in der Datenbank ECLs aufweisen, die sehr nahe beieinander liegen, meldet die Software beide Namen, wobei der nächstgelegene zuerst aufgeführt wird. Die Datentabellen aus den Berichten können in einer Tabelle oder Datenbank zusammengefasst werden.

Nach Anpassung an den Ansprechfaktor können die Peakbereiche dann mit der Peakfläche eines externen oder internen Standards verglichen werden, um eine Konzentration des Extrakts zu erhalten. Durch Division durch die Masse des entnommenen Bodens können die Daten als Masse von FAME pro Gramm Boden oder, auch unter Verwendung des Molekulargewichts jedes FAME, als Nanomol pro Gramm Boden ausgedrückt werden. Biomarker-FAMEs können dann summiert werden, um die Biomasse von mikrobiellen Gilden zu erhalten, und diese Gilden können weiter analysiert werden.

Hier sehen wir zum Beispiel ungedüngte Prärien mit mehr FAME-Biomasse als gedüngte Prärien. Beide haben mehr Biomasse als die nahe gelegenen Maisfelder. Außerdem sind FAMEs mit bestimmten funktionellen Gruppen wie Pilzen oder Bakterien assoziiert.

Diese Assoziationen sind ökosystemspezifisch, daher ist es wichtig, sie nicht zu verallgemeinern. Diese Art der Analyse zeigt, ob bestimmte Gruppen in bestimmten Umgebungen häufiger vorkommen. Hier sind Pilze in der ungedüngten Prärie häufiger als im Maisfeld.

weitere Möglichkeit, die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft insgesamt zu betrachten, besteht darin, die relative Häufigkeit aller FAMEs auf einmal mit Hilfe von Ordinationsmethoden wie der nichtmetrischen multidimensionalen Skalierung (NMDS) oder der Hauptkomponentenanalyse (PCA) zu betrachten. Bei einer Ordination werden mikrobielle Gemeinschaften, die ähnlicher sind, näher beieinander liegen. Aus unseren Beispieldaten geht also hervor, dass Mais und unbefruchtete Prärie sehr weit voneinander entfernt sind, während einige befruchtete Prärieproben mikrobielle Gemeinschaften aufweisen, die denen von Mais ähneln, und andere der ungedüngten Prärie ähneln.

Mikrobielle Gemeinschaften sind oft sehr variabel, selbst innerhalb einer Umgebung, so dass sie sich nicht immer sauber trennen lassen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis für den Prozess haben, mit dem Lipid-Biomarker aus den Zellmembranen von Mikroorganismen aus dem Boden extrahiert werden. Die Extraktion von Phospholipid-Fettsäuren ist eine effektive, schnelle und kostengünstige Methode zur Bewertung von mikrobiellen Gilden und der gesamten mikrobiellen Biomasse durch die Identifizierung einzigartiger mikrobieller Biomarker.