Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Das Ziel dieses Videos ist es, eine Methode zu beschreiben, die den Durchsatz erhöht, während Aufwand und Genauigkeit für die Extraktion von Lipiden aus Zellmembranen von Mikroorganismen zur Charakterisierung sowohl der Gesamtlipide als auch der relativen Häufigkeit von Indikatorlipiden zur Bestimmung der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur im Boden und für Studien mit vielen Proben im Gleichgewicht gehalten werden. In der Feldarbeit sollten Sie die Heterogenität des Bodens berücksichtigen und Bodenproben so sammeln, dass sie Ihren Untersuchungsort repräsentativ abbilden. Um die mikrobielle Gemeinschaft zum Zeitpunkt der Probenahme zu erhalten, sollten die Proben aus dem Feld auf Eis transportiert werden.

Im Labor angekommen, entfernen Sie Wurzeln und Steine und zerkleinern Sie Klumpen durch grobes Sieben. Dies dient ebenfalls der Homogenisierung Ihrer Probe. Bereiten Sie die Gefriertrocknung vor, indem Sie Teilproben in geeignete Behälter geben, und gefriertrocknen Sie so schnell wie möglich.

Nachdem die Böden gefriertrocknet wurden, lagern Sie sie in einem verschlossenen Behälter mit Trockenmittel, bis die Extraktion erfolgt. Es ist am besten, gefriertrocknete Böden bei 80 Grad C zu lagern. Als Vorbereitung für die Extraktion entnehmen Sie die gefriertrockneten Böden der Lagerung und mahlen sie. Methoden zum Mahlen umfassen Kugelmühle, Kugelzähler oder Mörser und Pistill.

Nach dem Mahlen des Bodens homogenisieren Sie Ihre Bodenproben erneut gründlich und lagern Sie im Gefrierschrank. Alle Laborgeräte müssen peinlich sauber sein. Rückstände von Reinigungsmitteln, Fett oder Schmutz können die Ergebnisse beeinflussen, da sie als Peak im endgültigen GC-Chromatogramm erscheinen können.

Die Extraktionen werden in 30-Milliliter-Teflon-Zentrifugenröhrchen durchgeführt, die mit Lösungsmittel gespült werden müssen. Geben Sie zwei bis drei Milliliter Hexan in die Röhrchen und wirbeln Sie sie einige Sekunden lang im Vortex. Gießen Sie das Hexan in ein anderes Röhrchen ab und wirbeln Sie es erneut im Vortex.

Zwei bis drei Milliliter Hexan können verwendet werden, um sechs Reagenzgläser nacheinander auszuwaschen. Lagern Sie die mit Hexan gespülten Reagenzgläser verkehrt herum im Abzug und entsorgen Sie das verbrauchte Hexan in einem geeigneten Abfallbehälter. Glasgeräte können unmittelbar vor der Verwendung geglüht oder mit Lösungsmittel gespült werden.

Das Glühen gewährleistet die Reinheit des Glasgeräts durch Oxidation von Rückständen bei hoher Temperatur. Wickeln Sie das Glasgerät in zwei bis drei Schichten Aluminiumfolie ein und stellen Sie es in den Muffelofen. Stellen Sie den Ofen auf 450 Grad C ein und lassen Sie das Gerät nach Erreichen der Solltemperatur mindestens 4 1/2 Stunden lang glühen.

Mindestens eine Stunde zum Abkühlen einplanen, bevor die Probe aus dem Ofen entnommen wird. Hexan-gespülte Teflonröhrchen beschriften und wiegen. Bodenprobe in die Teflonzentrifugenröhrchen geben und erneut wiegen, um die Bodenmasse zu bestimmen.

Stellen Sie pro Charge immer mindestens zwei Blindproben her und fügen Sie eine Kontrollstandardprobe hinzu, vorzugsweise einen Boden, der zuvor bereits extrahiert wurde, falls Sie überprüfen möchten, ob die Extraktion korrekt funktioniert hat. Lipidextraktionen. Bereiten Sie drei erneut aufzupipettierende Mengen zu je fünf bis 10 Milliliter Phosphatpuffer, Chloroform und Methanol vor.

Chloroform ist eine sehr dichte Flüssigkeit mit geringer Oberflächenspannung. Achten Sie darauf, dass die abgegebene Menge genau und konsistent ist. Halten Sie die Flasche mindestens zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt.

Fügen Sie im Abzug die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge dem Boden in dem Teflonrohr hinzu: Phosphatpuffer, Chloroform und Methanol. Dies ist die erste physikalische Extraktion von Lipiden aus Ihrem Probenmaterial. Die Rezepturen für die Reagenzlösungen sind im schriftlichen Protokoll enthalten.

Die Anteile der Lösungsmittel und die Reihenfolge ihrer Zugabe sind wichtig für eine ordnungsgemäße Trennung der organischen und wässrigen Phasen. Geben Sie dem Boden nach der Zugabe des Puffers Zeit zum Durchfeuchten, bevor Chloroform zugegeben wird. Falls zweckmäßig, können die Extraktionsmittel kombiniert und bei der zweiten sowie allen weiteren Extraktionen als eine einzige Portion zugegeben werden.

Schließen Sie die Teflonröhrchen fest und schützen Sie sie vor Licht. Stellen Sie sie horizontal auf den Schüttler und stellen Sie sicher, dass sie gut befestigt sind. Schütteln Sie sie bei hoher Geschwindigkeit eine Stunde lang.

Während die Röhrchen geschüttelt werden, bereiten Sie für jede Probe zwei lange Glasröhrchen wie folgt vor. Beschriften Sie das Röhrchen, geben Sie das gleiche Volumen Chloroform hinzu, das dem Boden zugesetzt wurde, sowie ein gleiches Volumen Phosphatpuffer. Nach dem Entfernen der Teflonröhrchen aus dem Schüttler zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten bei 2.500 U/min bei 25 Grad C.

Danach im abgedunkelten Abzug den Überstand aus dem Teflonrohr in eines der langen Röhrchen dekantieren. Die Phasentrennung sollte im Glasröhrchen sichtbar sein. Die untere Phase enthält das organische Lösungsmittel, hauptsächlich Chloroform, sowie die Lipide.

Diese Extraktion wird wiederholt. Gießen Sie das Überstand in das zuvor vorbereitete zweite Reagenzglas. Nun haben Sie die Lipide physisch zweimal aus dem Boden extrahiert.

Für die meisten Böden ist dies ausreichend. Verschließen Sie alle langen Reagenzgläser sicher mit Teflon-beschichteten Kappen und invertieren Sie sie 10-mal, um zu mischen. Trennen Sie die Phasen durch Schwerkraft über Nacht.

Lassen Sie die Proben über Nacht ungestört stehen, um die vollständige Trennung der beiden Phasen abzuschließen. Bewahren Sie die Proben dazu bei Raumtemperatur in einem dunklen Schrank oder mit Aluminiumfolie abgedeckt auf. Es ist in Ordnung, wenn sich die Extrakte über das Wochenende trennen.

Tag zwei, Isolierung von Lipiden. Am zweiten Tag wird die wässrige Phase abgesaugt und die Lipide durch Entfernen des Lösungsmittels in einem Vakuumverdampfungssystem angereichert. Die Proben können alternativ getrocknet werden, indem sie in ein Wasser- oder Sandbad gestellt und einem sanften Strom von Stickstoff ausgesetzt werden.

Die Flüssigkeit in den Röhrchen sollte nun gut getrennt und weitgehend klar sein. Falls dies nicht der Fall ist oder die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten besonders dick ist, sollte die Trennung noch einen weiteren Tag andauern. Richten Sie einen Vakuumabsauger in der Abzugshaube ein.

Dies ist ein Seitenarmkolben, der über einen Tygon-Schlauch mit Blattstruktur und eine Pasteur-Pipette an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist. Bei laufender Pumpe die wässrige Phase mithilfe der Pipette in den Kolben abziehen. Die obere Schicht und die Grenzfläche absaugen.

Dies erfolgt etwa zwei Drittel des Weges nach unten. Führen Sie dies an zwei bis drei Sätzen Glasröhrchen durch. Die obere Schicht kann einige Bodenpartikel enthalten.

Entfernen Sie diese, falls möglich. Kombinieren Sie das Extrakt aus dem zweiten und/oder dritten Satz von Röhrchen mit dem der ersten beiden, indem Sie es vorsichtig dekanteren. Achten Sie darauf, feste Bestandteile beim Gießen auszuschließen, und spülen Sie die Röhrchenwände durch Drehen nach.

Verwenden Sie für jede Probe eine saubere Pipette und wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Proben. Sobald die Chloroform-Extrakte vereinigt wurden und einige Minuten lang gestanden haben, überprüfen Sie die Oberfläche der Flüssigkeit. Häufig bildet sich eine dünne Schicht aus restlichem Wasser.

Falls vorhanden, vor dem Fortfahren abpipettieren. Restwasser könnte Doppelbindungen der Fettsäuren angreifen, aber eine sehr geringe Menge sollte gemeinsam mit den Lösungsmitteln verdampfen, während die Proben getrocknet werden. Trocknen Sie alle Proben mithilfe der Vakuumverdampfungsapparatur ein.

Schließen Sie die Röhrchen fest und lagern Sie sie bei -80 °C. Tag drei, Verseifung und Methylierung. Schalten Sie zunächst die Wasserbäder ein. Überprüfen Sie den Wasserstand und stellen Sie Bad eins auf 95 °C und Bad zwei auf 80 °C ein. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette ein Milliliter des Verseifungsreagens, Reagenz 1, zu den getrockneten Lipiden hinzu.

Dicht verschließen, kurz verwirbeln und in ein Gestell stellen. Sobald dieser Schritt abgeschlossen ist, das Röhrchen-Gestell in das Wasserbad bei 95 °C geben und fünf Minuten warten. Das Röhrchen-Gestell aus dem Bad nehmen und die Röhrchen auf Undichtigkeiten überprüfen.

Dies wird durch aufsteigende Blasen in der Röhre wie ein Schaum angezeigt. Ziehen Sie die Verschlüsse der undichten Röhren erneut fest oder ersetzen Sie sie. Fahren Sie fort, die Röhren weitere 10 Minuten im Wasserbad zu erhitzen.

Senken Sie die Temperatur des Wasserbades auf 80 Grad C und setzen Sie die Inkubation weitere 15 Minuten fort. Entfernen Sie die Röhrchen und kühlen Sie sie, indem Sie das Gestell in eine Schale mit Leitungswasser stellen. Verwenden Sie kein Eiswasser.

Nachdem die Proben abgekühlt sind, geben Sie zwei Milliliter des Methylierungsreagenz, Reagenz 2, zu jeder Probe hinzu. Verschließen Sie die Proben erneut fest und wirbeln Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang. Es können körnige Salze als Niederschlag in der Lösung sichtbar werden, was gelegentlich aufgrund von überschüssigen Reagenzien auftritt.

Stellen Sie das Rack in das Wasserbad bei 80 Grad C und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Nehmen Sie das Rack mit den Röhrchen aus dem Wasserbad und stellen Sie es zur Abkühlung in eine Schale mit Leitungswasser. Schütteln Sie das Rack, um den Abkühlvorgang zu beschleunigen.

Unter Verwendung einer Mehrfachpipette je 1,25 Milliliter Hexan und Methyl-tert-butylether, Reagenz 3, zu jedem Röhrchen geben, um die Phase zu extrahieren. Die Verschlüsse fest verschließen und die Röhrchen 10 Minuten lang auf einen Schüttler stellen. Nach dem Schütteln den Röhrchenständer 10 Minuten lang ruhen lassen, damit sich die Phasen trennen können.

Überführen Sie die organische Phase, die nun die obere Schicht bildet, mit einer Pasteurpipette in ein kurzes Glasröhrchen. Es ist am besten, den größten Teil der Flüssigkeit zurückzugewinnen. Sehr geringe Mengen der wässrigen Phase beeinträchtigen die Extraktion nicht.

Wiederholen Sie die Extraktion der wässrigen Phase, indem Sie Reagenz 3 hinzufügen, schütteln, die Phasen trennen lassen und die obere Phase abtrennen. Abhängig vom Zustand der unteren Phase können Sie diesen Schritt noch einmal wiederholen, insgesamt also dreimal. Geben Sie 3 Milliliter der Basenwäsche, Reagenz 4, das eine verdünnte Lösung von Natriumhydroxid ist, zu den Extrakten in den kurzen Röhrchen hinzu.

Schließen Sie die Reagenzgläser fest und wirbeln Sie sie 20 bis 30 Sekunden lang, anschließend zentrifugieren Sie sie drei Minuten bei 2.000 U/min. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie mit einer sauberen Pasteurpipette die obere organische Phase und überführen Sie in ein vier Milliliter fassendes braunes Gefäß. Achten Sie sorgfältig darauf, dass keine Bestandteile der wässrigen Phase mitaspiriert werden.

Der nächste Schritt besteht darin, das Lösungsmittel in einer Vakuumverdampfungsvorrichtung bis zur Trockne einzudampfen. Tag vier, Vorbereitung der Extrakte zur GC-Analyse. Geben Sie mit der Pipette 100 Mikroliter Reagenz 3 zu jedem der 4-Milliliter-Fläschchen, die die getrocknete Phase enthalten.

Versetzen Sie die Probe gründlich und lassen Sie sie anschließend 10 Minuten stehen. Überführen Sie mit dem zweiten Pipettiergerät vorsichtig die suspendierten FAMEs in ein GC-Gefäß. Geben Sie eine weitere Portion des Lösungsmittels zu dem Vier-Milliliter-Gefäß hinzu und versetzen Sie es kurz.

Rollen Sie das Vial, um sicherzustellen, dass die restlichen FAMEs an den Wänden des Vials gelöst werden. Übertragen Sie das Lösungsmittel mit dem zweiten Pipettiergerät erneut in das GC-Vial. Vervollständigen Sie die Übertragung, indem Sie eine dritte Aliquot-Lösungsmittelportion zum Vial hinzufügen, vortexen und anschließend in das GC-Vial überführen.

Schließen Sie das GC-Gefäß und lagern Sie es im Gefrierschrank. Lagern Sie verschlossene GC-Gefäße vor der Analyse im Gefrierschrank. GC-Analyse.

Um dieses System zu nutzen, muss die Analyse unter Verwendung einer spezifischen GC-Säule durchgeführt werden. Das Gaschromatographiegerät ist mit einem Split/Splitless-Injektor ausgestattet, der mit einem Glasinjektorliner mit vier Millimeter Innendurchmesser und einem deaktivierten Glaswollstopfen versehen ist. Der Injektor ist auf 250 Grad C eingestellt und arbeitet im konstanten Druckmodus.

Das Trägergas ist Wasserstoff. Für die Detektorgase werden Stickstoff und Luft benötigt. Es wird eine Agilent Ultra 2-Säule verwendet.

Die Säule ist 25 Meter lang, hat einen Innendurchmesser von 2 Millimeter und eine stationäre Phasenfilmdicke von 33 Mikrometer. Die stationäre Phase in dieser Säule besteht aus 5 % Phenyl, 95 % Methylpolysiloxan und ist auch als DB-5-Typ-Säule bekannt. Zur Analyse der Lipidextrakte wird ein zwei Mikroliter großer Aliquot mit einem Split-Verhältnis von 100:1 bei einer Ofentemperatur von 170 Grad C injiziert. Nach der Injektion wird der Ofen programmiert, die Temperatur um fünf Grad pro Minute bis auf 300 Grad C zu erhöhen und dann 12 Minuten lang beizubehalten.

Eine Reihe von Injektionen des MIDI-Standards wird durchgeführt, und die Ergebnisse werden verwendet, um gemäß den Anweisungen im MIDI-Handbuch Anpassungen vorzunehmen. Einmal auf diese Weise kalibriert, benötigt das System gelegentlich geringfügige Nachjustierungen, sollte aber im Allgemeinen mit diesen Parametern gute Ergebnisse liefern. Das MIDI-System erstellt für jede Probe einen Bericht, der eine Tabelle mit einer Zeile pro realisiertem Peak enthält.

Die Software gibt die Peak-Retentionszeit, die Peakfläche, die Peak-Identifizierung sowie die ECL (geschätzte Kettenlänge) oder die geschätzte Kettenlänge, einen Parameter zur Peak-Identifizierung, und einen Antwortfaktor, einen Parameter zur Normierung von Variationen und Detektorantwort in Bezug auf die Retentionszeit, aus. Die ECL drückt aus, an welcher Stelle innerhalb einer Reihe von geradkettigen FAMEs jeder unbekannte FAME eluiert wird. Wenn beispielsweise die Retentionszeit eines unbekannten Peaks genau zwischen denen eines 12- und eines 13-Kohlenstoff-Ketten-FAMEs liegt, wird die ECL als 12,5-Kohlenstoffkette angegeben.

Die Software vergleicht das ECL jedes Peaks mit den ECLs von FAMEs in einer Datenbank und weist dem unbekannten Stoff den entsprechenden Namen zu, wenn Übereinstimmungen vorliegen. In Fällen, in denen zwei FAMEs in der Datenbank sehr ähnliche ECLs aufweisen, gibt die Software beide Namen aus, wobei zuerst der engste Treffer genannt wird. Die Datentabellen aus den Berichten können in eine Tabellenkalkulation oder Datenbank zusammengeführt werden.

Nach der Korrektur um den Antwortfaktor können die Peakflächen mit der Peakfläche eines externen oder internen Standards verglichen werden, um die Konzentration des Extrakts zu ermitteln. Durch Division durch die Masse des extrahierten Bodens können die Daten als Masse an FAME pro Gramm Boden ausgedrückt werden oder, unter zusätzlicher Verwendung der molaren Masse jedes FAME, als Nanomol pro Gramm Boden. Die biomarkerhaltigen FAMEs können anschließend summiert werden, um die Biomasse mikrobieller Gruppen zu ermitteln, und diese Gruppen können weitergehend analysiert werden.

Beispielsweise sehen wir hier unbehandelte Prärien mit höherer FAME-Biomasse als gedüngte Prärien. Beide weisen mehr Biomasse auf als nahegelegene Maisfelder. Außerdem sind FAMEs bestimmten funktionellen Gruppen wie Pilzen oder Bakterien zugeordnet.

Diese Assoziationen sind ökosystemspezifisch, daher ist es wichtig, sie nicht zu verallgemeinern. Diese Art der Analyse zeigt, ob bestimmte Gruppen in bestimmten Umgebungen häufiger vorkommen. Hier sind Pilze in der unbehandelten Prärie häufiger vertreten als auf dem Maisfeld.

Und schließlich lässt sich die Gesamtzusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft auch dadurch betrachten, dass man die relative Häufigkeit aller FAMEs gleichzeitig mithilfe von Ordinationsverfahren wie der nichtmetrischen mehrdimensionalen Skalierung (NMDS) oder der Hauptkomponentenanalyse (PCA) vergleicht. In einer solchen Ordination liegen mikrobielle Gemeinschaften, die einander ähnlicher sind, näher beieinander. So liegen in unseren Beispieldaten Mais und ungedüngte Prärie sehr weit auseinander, während einige Proben der gedüngten Prärie mikrobielle Gemeinschaften aufweisen, die entweder denen von Mais ähneln oder denen der ungedüngten Prärie.

Mikrobielle Gemeinschaften sind oft selbst innerhalb einer Umgebung stark variabel, sodass sie nicht immer sauber voneinander getrennt werden können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis für den Prozess haben, durch den Lipid-Biomarker aus den Zellmembranen von Mikroorganismen aus Boden extrahiert werden. Die Extraktion von Phospholipid-Fettsäuren ist eine effektive, schnelle und kostengünstige Methode, um mikrobielle Gruppierungen und die gesamte mikrobielle Biomasse durch die Identifizierung einzigartiger mikrobieller Biomarker zu bewerten.