Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP) von Kieselalgen zu isolieren und integrieren sie in Liposomen mit natürlichen Lipid Kompositionen Erregung Energieübertragung auf Ionen-Zusammensetzung Änderungen zu studieren.

Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen in der Photosyntheseforschung zu verstehen, wie z.B. das Verblassen der eingefangenen Lichtenergie und Lichtsammelkomplexe, ihre Kinetik und die Effizienz des Transfers. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Liposomen ein Membrankompartiment bieten, das dem nativen Zustand einer Thylakoidmembran ähnelt, was Untersuchungen von Ionen- und pH-Änderungen während der Photosynthese ermöglicht. Zu Beginn des Protokolls zentrifugieren Sie zuvor vorbereitete C.meneghiniana-Zellen bei 4.300 G in einem vorgekühlten Rotor bei vier Grad Celsius mit 500-Milliliter-Zentrifugenfläschchen für 15 Minuten.

Resuspendieren Sie den Homogenisierungspuffer der Zellpellets durch Schütteln und Pipettieren. Übertragen Sie die Suspension in ein einzelnes geeignetes Kunststoffröhrchen und begrenzen Sie das Endvolumen auf 12 Milliliter. Anschließend kühlen Sie die Kugelmühle und die Ausrüstung etwa 60 Minuten lang vor.

Füllen Sie das 50-Milliliter-Becherglas zu 75 % mit einer Glasperlenmischung und fügen Sie die Zellsuspension hinzu. Mit einem Spatel oder Glasstab umrühren und bei Bedarf HB hinzufügen. Verwenden Sie für den Zellaufschluss sieben mal 45 Sekunden lange Impulse bei voller Geschwindigkeit, mit 30 Sekunden Abkühlung zwischen jedem Impuls.

Filtern Sie die zerbrochenen Zellen über einen Glasfiltertrichter und waschen Sie sie, indem Sie das HB über die Glasperlen gießen, bis sie klar erscheinen. Anschließend wird die Waschfraktion mit dem Filtrat gepoolt und das Endvolumen unter 150 Millilitern gehalten. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 140-fachem G mit drei 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen, um die Zelltrümmer zu pelletieren.

Den Überstand vorsichtig in 20-Milliliter-Polycarbonat-Ultrazentrifugationsfläschchen umfüllen und das Pellet entsorgen. Füllen Sie die Fläschchen mit HB. Gleichen Sie das Gewicht aus. Zentrifugieren Sie in einem geeigneten Rotor eine Stunde lang bei 300.000 G und vier Grad Celsius, um die Thylakoidmembranen zu pelletieren.

Resuspendieren Sie das Membranpellet mit so wenig Waschpuffer wie möglich mit einem kleinen Malerpinsel. Füllen Sie die Polycarbonat-Ultrazentrifugationsfläschchen mit Waschpuffer. Gleichen Sie ihr Gewicht aus.

Zentrifugieren Sie sie 20 Minuten lang bei 200.000 Mal G und vier Grad Celsius. Suspendieren Sie die gewaschenen Membranen mit dem Malpinsel. Bündeln Sie alle Thylakoide in einem 15-Milliliter-Probenfläschchen.

Füllen Sie die Ultrazentrifugationsröhrchen mit Saccharosegradientenlösung bis zum Rand für ein Volumen von einem Milliliter. Frieren Sie die Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius ein, bis sie vollständig gefroren sind. Lassen Sie die Röhrchen dann bei vier Grad Celsius auftauen.

Als nächstes werden die Proben verwendet, die 125 Mikrogramm Chlorophyll entsprechen, und mit Puffer B1 auf ein Volumen von 0,9 Millilitern eingestellt. Zur Solubilisierung wird N.Dodecyl Beta D Maltopyranosid bis zu einer Endkonzentration von 20 Millimolar zugegeben. Drehen Sie das Rohr dreimal um.

Legen Sie es 20 Minuten lang unter leichtem Schütteln auf Eis, um Schaumbildung zu vermeiden. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 12.000 G in einer vorgekühlten Tischzentrifuge bei vier Grad Celsius. Laden Sie den Überstand auf den Gradienten und laden Sie nicht mehr als 125 Mikrogramm Gesamtchlorophyll pro Gradient, wenn 17-Milliliter-Fläschchen verwendet werden.

Zentrifugieren Sie 22 Stunden lang bei 100.000 Mal G und vier Grad Celsius. Die gewünschten braunen FCP-Fraktionen werden mit einer Spritze aus dem Gradienten gewonnen. Schätzen Sie das Volumen.

Entfernen Sie dann ein Aliquot von fünf Mikrolitern und verdünnen Sie es mit 995 Mikrolitern B1A. Messen Sie dann das Volumen der zurückgewonnenen Probe mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Waschen Sie die FCP-Komplexe, indem Sie das doppelte zurückgewonnene Volumen mit B1-Puffer hinzufügen, der frei von Reinigungsmitteln ist.

Konzentrieren Sie die Proben in einem Membrankonzentrator mit einem Cutoff von 30 Kilodalton bei 1.000 mal G und vier Grad Celsius auf eine Extinktion bei 672 Nanometern von mindestens 20. Pipettieren Sie die Flüssigkeiten in ein zwei Milliliter Reaktionsröhrchen und verdampfen Sie das Chloroform mit einem sanften Stickstoffstrom und verteilen Sie die Lipide über die gesamte Fläche des Röhrchenbodens. Lassen Sie den Stickstoff fließen, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist.

Solubilisieren Sie das Lipidgemisch in 29 Mikrolitern N Octyl beta d Glucopyranosid bei vier Grad Celsius für vier Stunden. Inkubieren Sie die Lipidmischung 10 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Dann inkubieren Sie das Lipidgemisch in einem Ultraschallbad bei 25 Grad Celsius dreimal für drei Minuten.

Legen Sie die Mischung zwischen jeder Beschallung 30 Sekunden lang auf Eis. Fügen Sie 221 Mikroliter Tricinpuffer und 250 Mikroliter Vierfach-Dialysepuffer hinzu. Verwenden Sie einen Extruder mit 0,1 Mikron Polycarbonat-Membranen, um einen definierten Liposomendurchmesser von 50-70 Nanometern zu erhalten.

Montieren Sie den Extruder mit der Membran und der Filterhalterung. Spülen und befeuchten Sie das Gerät, arbeiten Sie vorsichtig und langsam, um Luftblasen zu vermeiden, und ziehen Sie die Montage gründlich fest. Füllen Sie eine Spritze mit vierfachem Dialysepuffer und befeuchten Sie den Extruder vor, bis in der zweiten Spritze keine Blasen mehr zu sehen sind.

Tragen Sie die Lipidwaschmittelmizellen auf den Extruder auf und drücken Sie die Lösung von einer Spritze zur anderen hin und her. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, bis die Lösung homogen erscheint. Fahren Sie mit dem Einbau der FCP-Komplexe fort und fügen Sie FCP in Höhe von 20 Mikrogramm Chlorophyll a in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern B1A-Puffer zu 250 Mikrolitern der extrudierten Lipidmizellen plus 250 Mikroliter vierfacher DP hinzu. Inkubieren Sie die Proben in drei Intervallen für jeweils drei Minuten bei 25 Grad Celsius in einem Thermomischer bei 1.500-3.000 U/min, unterbrochen von einer 30-sekündigen Pause auf Eis.

Schneiden Sie den Deckel von vier 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen direkt unter der Oberseite ab, so dass ein Ring entsteht, der immer noch auf den Deckel passt. Bereiten Sie 1,5 x 1,5 Zentimeter große Stücke Dialysemembranen vor und waschen Sie sie in 20 Millilitern Einfalts-Dialysepuffer. Füllen Sie jeden Deckel mit 250 Mikrolitern der Probe.

Legen Sie die Membran vorsichtig auf den Deckel, so dass das Fach vollständig mit der Probe gefüllt ist und keine Luftblasen entstehen. Ziehen Sie den Reaktionsrohrring an der Baugruppe fest, sodass das Fach geschlossen ist. Dialysieren Sie die Proben in 50 Millilitern Einfach-Dialysepuffer über Nacht für 12-16 Stunden auf Eis auf einem Tumbling Shaker.

Ersetzen Sie den Puffer durch frischen Dialysepuffer und fügen Sie sieben Milligramm Adsorptionskügelchen hinzu, um die restlichen Reinigungsmittel mindestens sechs Stunden lang zu entfernen. Tauschen Sie den Dialysepuffer wieder aus und dialysieren Sie die Proben für weitere 12 Stunden. Gewinnen Sie die Liposomen, indem Sie die Dialysemembran mit einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze durchstechen und alle Liposomen aus dem Deckel des Reaktionsröhrchens aspirieren.

Zentrifugieren Sie die FCP-Liposomen in mindestens zwei Millilitern 1X Dialysepuffer für 1,5 Stunden bei 100.000 mal G und vier Grad Celsius. Gewinnen Sie die Liposomen zurück, indem Sie das Zentrifugenröhrchen in einem Winkel von 45 Grad drehen. Lassen Sie die Liposomen eine Minute lang nach unten wandern.

Gewinnen Sie die FCP-Liposomen in einem Endvolumen von 25-50 Mikrolitern zurück und vermeiden Sie eine Störung des Niederschlags. Unterschiede in den normierten Absorptionsspektren deuten auf einen Pigmentverlust hin, der im Spektralbereich zwischen 500 und 550 Nanometern auftritt, wo Carotinoide absorbiert werden. Ein Pigmentverlust ist akzeptabel, wenn die Komplexe noch funktionsfähig sind, was durch ähnliche Emissions- und Anregungsspektren angezeigt wird.

Die Chlorophyllfluoreszenzausbeute, die durch FCP in Liposomen entsteht, wird aufgrund der exzitonischen Wechselwirkung in FCP-Clustern reduziert. Der Einfluss eines Kaliumionengradienten auf die FCP-Fluoreszenzausbeute wurde in Gegenwart von Standardpuffer getestet, der bei Zugabe von Kaliumchlorid um 30 Prozent abnimmt. Der Kaliumgradient wurde durch Valinomycin freigesetzt, das die FCP-Fluoreszenz wieder auf das Ausgangsniveau zurückversetzt und die Hypothese bestätigt, dass FCP-Komplexe in vivo auf Kaliumionenkonzentrationsgradienten reagieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Tamrasol-Fluoreszenz, Pump-Probe und Einzelmolekülspektroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zur Lichtenergieübertragung zu untersuchen.