Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, mithilfe einer einfachen fraktionierten Methyl-tert-butyläther-Extraktion alle wichtigen molekularen Komponenten – einschließlich polarer und halbpolaren Metaboliten, Lipide und Proteine – aus einer einzigen Probe zu gewinnen und zu analysieren. Im Allgemeinen fällt es Wissenschaftlern schwer, mehrere Verbindungsklassen aus einer einzigen Probe zu analysieren. Mit der hier vorgestellten MTBE-Extraktion können Sie mehrere Verbindungsklassen wie Lipide, Metaboliten und Proteine aus einer einzigen Probe extrahieren und analysieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie alle molekularen Verbindungsklassen robust aus einer geringen Menge einer Einzelprobe extrahieren kann. Diese Methode hilft, grundlegende Fragen der Systembiologie zu beantworten, da sie die experimentelle Grundlage für die Multiomik-Analyse liefert und Fraktionen bereitstellt, die für Analysen mittels Proteomik, Lipidomik und Metabolomik verwendet werden können. Das folgende Protokoll wird anhand von Blattgewebe von Arabidopsis demonstriert.

Arabidopsis sind kleine blühende Pflanzen der Familie Brassicaceae und verwandt mit Kohl. Kühlen Sie die Probengefäßhalter des Gewebehomogenisators vor, indem Sie sie mindestens 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff abkühlen. Entnehmen Sie die Proben dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie in die Probengefäßhalter.

Entfernen Sie dann die Probengefäßhalter aus flüssigem Stickstoff. Stellen Sie die Probengefäßhalter schnell in den Gewebemühle und stellen Sie die Mühle so ein, dass das biologische Material zu einem feinen und homogenen Pulver zermahlen wird. Verwenden Sie für Blätter 20 Hertz für eine Minute.

Die Homogenisierungszeit und -geschwindigkeit können je nach Gewebeart variiert werden. Stellen Sie sicher, dass Sie so lange homogenisieren, bis die Probe ein sehr feines Pulver ergibt. Die Probe sollte während des gesamten Homogenisierungsprozesses gefroren gehalten werden.

Homogenisieren Sie die Proben und nehmen Sie die biologischen Proben anschließend aus den Probenträgern heraus. Falls sie nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bis zur weiteren Aufarbeitung bei minus 80 Grad Celsius ein. Beschriften Sie vier zweimilliliter-Rundboden-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen mit der jeweiligen Probennummer.

Kühlen Sie die Röhrchen und einige Spatel vor, indem Sie sie in flüssigen Stickstoff eintauchen. Sobald die Röhrchen und Spatel gekühlt sind, stellen Sie eines der Röhrchen auf eine Analysenwaage und geben Sie mit einem Spatel 25 Milligramm Gewebepulver in das Mikrozentrifugenröhrchen ab. Notieren Sie das genaue Gewicht für jede Probe und stellen Sie die aliquotierten Proben anschließend sofort in flüssigen Stickstoff.

Führen Sie diesen Schritt schnell durch, um ein Auftauen des Pflanzenmaterials zu vermeiden. Lagern Sie die portionierten Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis die weitere Extraktion erfolgt. Kühlen Sie zur Vorbereitung der Extraktion das Methyl-tert-butylether- oder MTBE-Methanol-Extraktionsgemisch, das wie im beigefügten Dokument beschrieben hergestellt wurde, in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius vor.

Nehmen Sie die portionierten Proben heraus und geben Sie ein Milliliter der vorab gekühlten Extraktionsmischung in jedes Probenröhrchen. Führen Sie diesen Schritt schnell durch. MTBE weist eine geringe Viskosität auf und kann aus der Pipettenspitze tropfen.

Mischen Sie jede Probe sofort auf einem Vortex-Mischer, bis das Gewebe in der Extraktionsmischung gut homogenisiert ist. Stellen Sie die Röhrchen im Rack auf dem Laborpult ab, bis alle Proben extrahiert wurden. Dieser Schritt ist entscheidend.

Hier präzipitieren wir Proteine und inaktivieren ihre enzymatischen Aktivitäten. Inkubieren Sie alle Proben 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotationswellen-Schüttler bei 100 U/min. Anschließend werden die Proben 15 Minuten in einem eiskalten Beschallungsbad sonifiziert.

Als Nächstes zur Fraktionierung durch Phasentrennung 650 Mikroliter einer Drei-zu-eins-Lösung aus Wasser und Methanol zu jedem Probenröhrchen hinzufügen. Anschließend eine Minute lang durch Vortexen mischen. Die Proben bei vier Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von 20.000 × g fünf Minuten lang zentrifugieren.

Nach diesem Schritt die Röhrchen vorsichtig behandeln, um eine Vermischung der beiden Flüssigphasen zu vermeiden, und darauf achten, dass der ausgefallene Pellet nicht gestört wird. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich zwei zulässige Flüssigphasen mit einem festen Pellet am Boden des Röhrchens. Die unpolarere obere Phase enthält Lipide.

Die untere wässrige Phase enthält polare und halbpolare Metaboliten. Der Pellet enthält Proteine, Stärke und die Zellwand. Überführen Sie 500 Mikroliter des Lösungsmittels aus der oberen, lipidenhaltigen Phase in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Danach vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipette die verbleibende Lipidphase entfernen und entsorgen. Anschließend 400 Mikroliter des Lösungsmittels aus der unteren Phase in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Ein weiteres Aliquot von 200 Mikrolitern in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen, um weitere Analysen durchzuführen, beispielsweise eine gaschromatographische Metabolitanalyse.

Entfernen und verwerfen Sie den Rest der wässrigen Phase, indem Sie das überschüssige Volumen abpipettieren. Waschen Sie dann das erhaltene Protein-Stärke-Zellwand-Pellet, indem Sie 500 Mikroliter Methanol hinzufügen und eine Minute lang vortexen. Zentrifugieren Sie die Proben bei einer Geschwindigkeit von 10.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Verdampfen Sie das Lösungsmittel aus den Lipidproben mithilfe eines Stickstoffstrom-Verdampfers, um oxidative Modifikationen der Lipide zu vermeiden. Die resultierenden getrockneten Proben sollten unverzüglich analysiert werden. Verdampfen Sie das Lösungsmittel aus den wässrigen Proben über Nacht in einem Vakuumkonzentrator ohne Beheizung.

Die getrockneten wässrigen Proben können vor der Analyse mehrere Wochen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Lösen Sie die getrockneten Lipidfraktionen in 400 Mikroliter einer Lösung aus sieben Teilen Acetonitril zu drei Teilen 2-Propanol wieder auf. Überführen Sie ausreichend Flüssigkeit in Glasvials und verschließen Sie diese fest.

Danach die Glasfläschchen in einen gekühlten Autosampler bei vier Grad Celsius geben. Je Probe zwei Mikroliter injizieren und die Lipide an einer umgekehrten Phase C8-Säule bei 60 Grad Celsius mittels eines UPLC-Systems mit einer Flussrate von 400 Mikrolitern pro Minute trennen. Für die chromatographische Trennung die in Tabelle 1 des begleitenden Dokuments beschriebenen mobilen Phasen verwenden.

Erwerben Sie die Massenspektren im positiven und negativen Ionisationsmodus unter Verwendung eines geeigneten MS-Instruments, das den Massenbereich zwischen 150 und 1500 Ladungs-zu-Masse-Verhältnis abdeckt. Resuspendieren Sie die polare Phase in 200 Mikrolitern einer Lösung aus UPLC-reinem Methanol und Wasser im Verhältnis eins zu eins. Überführen Sie ausreichend Flüssigkeit in Glasvials und verschließen Sie diese fest.

Danach die Glasfläschchen in einen gekühlten Autosampler bei vier Grad Celsius geben. Jeweils zwei Mikroliter jeder Probe injizieren und die Metaboliten auf einer RP C-18-Säule bei 40 Grad Celsius mittels eines UPLC-Systems mit einer Flussrate von 400 Mikrolitern pro Minute trennen. Zur chromatographischen Trennung die in Tabelle 2 des begleitenden Dokuments angegebenen mobilen Phasen und Parameter verwenden.

Massenspektren im Vollscan-Modus im positiven und negativen Ionisationsmodus mit einem geeigneten Massenspektrometer im Massenbereich von 50 bis 1500 Massen-zu-Ladungs-Verhältnis erfassen. Abschließend Proteinextraktion, Verdauung und Analyse wie in der beiliegenden Dokumentation beschrieben durchführen. 25 Milligramm Arabidopsis-Blattgewebe wurden geerntet, gemahlen und extrahiert, bevor sie drei analytischen UPLC-MS-Plattformen unterzogen wurden.

Die polaren und halbpolaren primären und sekundären Metaboliten wurden aus der polaren Phase mittels umkehrphasiger C-18-UPLC-MS analysiert. Basissignalkromatogramme von Lipiden, dargestellt im oberen Feld, und halbpolaren Metaboliten, dargestellt im unteren Feld, wurden im positiven Ionisationsmodus analysiert. Das Kreisdiagramm in der oberen rechten Ecke jedes Chromatogramms zeigt die Anzahl der identifizierten Lipide und Metaboliten, die verschiedenen chemischen Klassen zugeordnet wurden.

Zum Beispiel wurden 58 verschiedene Lipide der Gruppe der Triacylglyceride zugeordnet, im oberen Diagramm als TAG angegeben. Hydrophilere Metaboliten aus diesem Fraktion, wie Zucker und polare Aminosäuren, die eine schlechte Retention an umgekehrter Phase aufweisen, können mittels anderer analytischer Methoden analysiert werden, beispielsweise GC-MS oder hydrophile Interaktions-Flüssigkeitschromatographie. Die aus der Extraktion gewonnenen Proteine wurden in Lösung verdaut und mittels Shotgun-LC-MS analysiert.

Das in der oberen rechten Ecke dargestellte Kreisdiagramm zeigt die Anzahl der identifizierten Proteine an, die verschiedenen biologischen Prozessen zugeordnet wurden. Beispielsweise wurden 268 Proteine der Kategorie Lokalisation zugeordnet. Zusammenfassend können aus Proben wie der in diesem Beispiel verwendeten routinemäßig mehr als 200 Lipidarten, 50 annotierte halbpolare Metaboliten und mehrere tausend Proteine identifiziert werden.

Außerdem zeigte die Methode eine breite Anwendbarkeit mit verschiedenen Geweben, Organen und Zellkulturmaterial. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die wichtigsten Verbindungen aus einer einzelnen Probe extrahieren und analysieren kann. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Proben gefroren zu halten, das Material ordnungsgemäß zu mahlen und Lösungsmittel und Chemikalien in analytischer Reinheit zu verwenden.

Nach diesem Verfahren können alle analytischen Methoden angewendet werden, um die molekulare Zusammensetzung der extrahierten Proben zu bestimmen.