التصوير داخل الظهارة من الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة في الميورين الأمعاء الدقيقة

يمكن أن يوفر المجهر داخل الرحم من الغشاء المخاطي المعوي الصغير نظرة ثاقبة على الديناميكيات الزمانية الزاجية للتفاعلات الخلوية داخل الظهارة بين أنواع الخلايا المناعية المختلفة ، أو بين هاتين المقصورتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالحصول على صور عالية السرعة وعالية الدقة داخل الغشاء المخاطي المعوي في الوقت الحقيقي. يمكن أن يوفر التصوير الحي للأمعاء نظرة إضافية على التفاعلات الخلوية ، أو إشارات الخلايا المشاركة في مناعة الغشاء المخاطي أو البيولوجيا الظهارية أو بيولوجيا السرطان.

هذا هو أسلوب التحدي الذي يتطلب ممارسة تقنية جراحية، فضلا عن الصبر وتحديد المواقع الأمثل من الماوس للحصول على صورة. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع في فأر معدل وراثيا تخدير، معربا عن بروتين فلوري أخضر معزز، أو EGFP، غاما دلتا T-خلية مستقبلات، واستخدام حقنة درنة لحقن ببطء 200 ميكرولترات من الحل صبغ Hoechst 33342 صبغ أعدت حديثا في الجيوب الأنفية الرجعية الوريدية. بعد دقيقة أو دقيقتين من الحقن، ضعي مرهم على عيني الحيوان لمنعهما من الجفاف.

ثم، جعل شق عمودي 2CM من خلال الجلد والصوانيب، على طول خط الوسط من أسفل البطن واستخدام ملقط الزاوية لسحب بعناية caecum من تجويف البريتوني. تحديد منطقة 2-3CM من الأمعاء الدقيقة التي تحتوي على الحد الأدنى من محتويات البراز، مع الحرص على عدم تمزيق الأوعية الدموية mesenteric، والعودة بعناية caecum والأمعاء الدقيقة المتبقية إلى تجويف البريتوني، وترك الجزء من الفائدة خارجي. وضع اثنين من أزواج من ملقط على جانبي mesentery تسينتري تسينتري التسطير بين الأوعية الدموية، فرك بلطف نصائح من ملقط معا لخلق ثقب في الغشاء.

باستخدام ملقط الزاوية وإبرة مقوسة المنحنية التي تعلق على خياطة 5CM ، اختراق جانب واحد من الصفاق من خلال ثقب في الغشاء ، وأعلى من خلال الجانب الآخر من بطانة الصفاق ، ووضع خياطة واحدة في الجزء العلوي ، وآخر بالقرب من الجزء السفلي من الشق لإغلاق الشق ، مع الحفاظ على حلقة من الأمعاء externalized. لزيادة احتمال النجاح، لا تربط أو تمزق أي أوعية دموية أثناء وضع خياطة البطن والحد من أي معالجة دخيلة من الأمعاء. ثم أغلق الجلد أسفل حلقة الأمعاء بنفس الطريقة ، ووضع خياطة واحدة في منتصف الشق بين الغرز السابقة في الصفاق التسطير.

باستخدام كهربائي، وجعل خط من ثقب على طول الحدود الأثناءenteric وتطبيق على الفور بضع قطرات من الماء على سطح الأمعاء لمنع تلف الأنسجة الناجم عن الحرارة إضافية. لطخة مع كيموبي لإزالة المياه المتبقية. استخدام مقص فانا لقطع ما يقرب من 1.5CM شق أفقي على حافة قاصي من النسيج الكي، على طول الخط الكي، نحو نهاية قريبة من الجزء الخارجي الأنسجة.

عندما يتعرض سطح المخاطية، وتغطي البطن مع كيمويب رطب للحفاظ على الأنسجة رطبة. للتصوير المجهري للقرص الغزل، نقل الماوس إلى المجهر في وعاء مغطى. إطلاق برنامج التصوير وإمالة رأس المجهر مرة أخرى، وإضافة 150 ميكرولترات من 1 صبغة برغوث ميكرومولار اليكسا فلور وهانك حل ملحي مؤقت على الجزء السفلي من الغطاء الزجاجي.

ضع الماوس بحيث يتصل السطح المخاطي المفتوح مباشرةً بزل الأغطية. ضع الفأرة والطبق على مسرح التصوير في حاضنة مُدفأة مسبقًا. تعيين كثافة الإثارة و وقت التعرض لكل ليزر إلى ما لا يزيد عن 10-15 مللي و 120-150 ميلي ثانية، على التوالي، وضبط متوسط الإطار إلى 2.

قم بتشغيل وظيفة Gain لمضاعفة الإلكترون لتقليل الضوضاء في الخلفية وحدد معايرة الهدف 63X لضمان قياس صحيح لحجم البيكسل. باستخدام الليزر 405 نانومتر والهدف الهواء 20X، تصور يدويا النوى لتحديد موقع حقل من الزغب التي تفتقر إلى حركة ملحوظة أو الانجراف، وتجنب مناطق الحركة artifactual بسبب التنفس، وال peristalsis أو ضربات القلب. باستخدام المسح الضوئي X-Y، تسجيل تنسيق X-Y من مجال الاهتمام والتحول إلى الغمر الجلسرين 63X الهدف.

الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر لمدة تصل إلى 1 دقيقة للتأكد من أن الزغب في الحقل المحدد مستقرة، في حين ضبط التركيز للعثور على الطائرة متعامد فقط تحت طرف villus. ثم الحصول على z-مكدسات، بدءا من أسفل ظهارة طرف villus، حوالي 15-20 ميكرومتر وصولا الى villus حتى يكون من الصعب حل نوى، وذلك باستخدام 1.5 ميكرومتر الخطوات. 3-5 دقائق بعد بدء عملية الاستحواذ، تأكيد استقرار الصورة و حركة الخلية داخل الدلتا غاما- دلتا، ومواصلة الحصول على الصور لمدة 30-60 دقيقة لكل حقل من الزغب.

تظهر الخلايا الليمفاوية داخل الرحم جاما دلتا سلوك مراقبة ديناميكية، حيث تقوم بدوريات في الظهارة عن طريق الهجرة على طول غشاء الطابق السفلي وإلى الفضاء الجانبي بين الخلايا في حالة الدراسة. في هذه الصور التمثيلية، تشير المسارات الملونة إلى مسارات الهجرة لللمفوضيات اللمفية داخل الرحم في جاما دلتا على مدى 30 دقيقة. على الرغم من أن وتيرة الخلايا الليمفاوية داخل الناحية اللمفية في الفضاء الجانبي بين الخلايا قد زادت في الفئران تعامل مع المضادة مستقبلات 2 المضادة المضادة، أكثر من 30٪ من هذه الخلايا الليمفاوية غاما دلتا Intraepitpithelial أظهرت سلوك تسكع.

وقد تأكد هذا النمط الظاهري المتماد من خلال انخفاض كبير في كل من السرعة اللحظية ونسبة الحبس لللمفيات داخل الرحم في دلتا غاما، بعد الحصار بين المستقبلات الداخليين-2، نسبة إلى الضوابط. وعلاوة على ذلك، كان الخلايا الليمفاوية الخمول غاما دلتا داخل أدنى فترات أطول يسكن، وكانت أكثر تواترا المترجمة داخل الفضاء بين الخلايا الجانبي، مقارنة مع الخلايا الليمفاوية Intraepithelial جاما-دلتا. قد يكون من الصعب تحديد حقول الزغب التي تفتقر إلى الحركة المفرطة بسبب ال peristalsis.

قد يساعد تغيير موضع الماوس في تحديد موقع حقل أكثر استقرارًا. قد يساعد المزيد من التحليل لبيانات تتبع الخلايا في تحديد سلوك الحركة المحددة، أو توفير مقاييس إضافية لقياس التفاعلات الخلوية. أصبح التصوير البيني وتحليل حركية IEL-1 قراءة قياسية لوظيفة IEL، مما يوفر نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم الإشارات المناعية الفطرية وظيفة Gamma-delta IEL.