Analyse der Satellitenzellfunktion während der Skelettmuskelregeneration durch Kardiotoxinverletzung und Injektion von selbstliefernder siRNA In Vivo

Diese Technik ermöglicht die Kombination der intramuskulären Injektion des Schlangengiftkardiotoxins, der intramuskulären Injektion von selbstliefernder siRNA, wodurch die Analyse der Regeneration des Skelettmuskels ermöglicht wird. Die Anwendung von selbstliefernder siRNA ist eine elegante Möglichkeit, den funktionellen Verlust einzelner Gene während der Muskelregeneration zu untersuchen und so transgene Tiere zu vermeiden. Nach der Bestätigung einer fehlenden Reaktion auf Zehenkneifen, rasieren Sie den Injektionsbereich des Schädelunterschenkels vom Knie bis zur Pfote und entfernen Sie lose Haare.

Legen Sie die Maus in den Supine-Zustand auf einem Mithängepad, das mit einem sterilen chirurgischen Tuch bedeckt ist, und verwenden Sie 70% Ethanol, um den Injektionsbereich des Schädelunterschenkels zu desinfizieren. Als nächstes laden Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Spur-Nadel, mit 50 Mikroliter von 20 mikromolarem Kardiotoxin ausgestattet und durchbohren Die Haut vollständig in den Muskel, nur distal bis zum Knie. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, injizieren Sie das Kardiotoxin über eine 10-bis 20-Sekunden-Verabreichungszeit entlang der gesamten Länge des Muskels, während Sie die Nadel hin und her bewegen, um eine gleichmäßige Verteilung des Kardiotoxins zu ermöglichen, wodurch der gesamte tibialis vordere Muskel verletzt wird.

Dann kehren Sie die Maus zu ihrem Käfig auf einem Heizpad mit Überwachung bis zur vollen Rekumbency. Drei Tage nach der Operation, desinfizieren Sie den Injektionsbereich, wie gerade gezeigt. Injizieren Sie bis zu 50 Mikroliter siRNA, die gegen das Zielgen von Interesse gerichtet sind, in den tibialis vorderen Muskel der anästhesierten Maus, wie gerade gezeigt.

Dann kehren Sie die Maus in ihren Käfig zurück, mit Überwachung bis zur vollen Reemumbency. Bevor Sie das verletzte Muskelgewebe sammeln, wickeln Sie Folie um einen Bleistift und versiegeln Sie den Bleistift mit Klebeband, so dass der Boden der Form eine gleichmäßige, geschlossene Oberfläche bietet. Wenn die Form fertig ist, desinfizieren Sie das ganze Tier mit 70% Ethanol, und verwenden Sie eine extra scharfe Schere, um die Haut am Knöchel zu entfernen.

Vor der Ernte des Muskels, verwenden Sie feine Zange, um die geschlossene Zange durch die Faszie neben dem Tibiaknochen am Knöchel des verletzten Beins zu kneifen, und bewegen Sie die Zange in Richtung des Knies, um die Faszien zu reißen, die tibialis vorderen Muskel auszusetzen. Um den tibialis vorderen Muskel zu isolieren, die distale Sehne freizulegen und die Sehne mit feiner Zange zu greifen. Verwenden Sie eine Federschere, um die Sehne zu schneiden, und greifen Sie den Muskel an der Sehne, um den Muskel in Richtung Knie zu ziehen.

Um die Analyse des Mittelbauchbereichs zu ermöglichen, verwenden Sie eine gerade Schere, um den tibialis vorderen Muskel im Mittleren Bauchbereich in zwei Hälften gleicher Größe zu schneiden, und füllen Sie die Bleistiftform auf halbem Weg mit Gefrierlösung. Legen Sie die beiden Hälften des tibialis vorderen Muskels in aufrechter Position in die gefrierende Form ein, wobei der Mittelbauchbereich auf den Boden der Form gerichtet ist. Verwenden Sie Zangen, um die Gefrierform auf halbem Weg in flüssigen Stickstoff zu übertragen.

Wenn das Gefriermedium von transparent zu weiß wechselt und fest wird, die Gefrierform in einen 80 Grad Celsius Gefrierschrank oder in Trockeneis für die zukünftige Verarbeitung übertragen. Bei den Kontrollmuskeln bleibt die Architektur des Gewebes intakt, wie die Lokalisierung der Kerne in der Peripherie der Myofiber und die fehlende Akkumulation mononukleierter Zellen im interstitiellen Raum beobachten. Sieben Tage nach der Kardiotoxin-vermittelten Verletzung bilden sich neue Myofiber, die durch zentral gelegene Kerne und eine Ansammlung mononukleierter Zellen, die hauptsächlich aus Satellitenzellen, aber auch nichtmyogenen Zellen wie Immunzellen bestehen, gekennzeichnet sind.

Unter Ruhebedingungen befinden sich Satellitenzellen, wie sie durch Pax7-Färbung in Rot gekennzeichnet sind, unter der Basallamina, die hier grün dargestellt ist. Drei Tage nach der Verletzung nimmt die Anzahl der Satellitenzellen zu, und die Satellitenzellen befinden sich nicht mehr unter der Basallamina. Am 10. Tag nach der Verletzung ist die Zahl der Satelliten noch erhöht.

Um den Regenerationsprozess weiter zu analysieren, können neu gebildete Myofiber mit Antikörpern gegen Entwicklungsmyosin gefärbt werden. Zwei Tage nach der Injektion mit siRNA können Satellitenzellen auf das Vorhandensein der fluoreszierend bezeichneten siRNA analysiert werden. In diesem repräsentativen Experiment waren etwa 75% der Satellitenzellen im regenerierenden Muskel positiv für die fluoreszierend markierte siRNA.

Darüber hinaus waren etwa 74 % aller regenerierenden Myofiber auch positiv für die fluoreszierend markierte siRNA, was darauf hindeutet, dass entweder 74% der regenerierenden Myofiber die siRNA aufgriffen, dass siRNA-positive Satellitenzellen zu neuen Myofiberverschmolzen verschmolzen waren oder dass eine Fusion mit bereits existierenden regenerierenden Myofiberen stattgefunden hatte. Der wichtigste Schritt ist eine vollständige Verletzung des tibialis vorderen Muskels zu erreichen. Neben der histologischen Analyse können Parameter wie die erzeugte Kraft aufgezeichnet werden, um die Regeneration des Skelettmuskels funktional zu analysieren.