Name: Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur einzelner Muskelfasern aus dem EDL-Muskel adulter Mäuse zur Untersuchung von Satellitenzell-Aktivierung und Differenzierung. Diese Methode bewahrt die physiologische Nische für Muskelstammzellforschung.

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Wir möchten Sarah Dick für die Bereitstellung von kritischen Lektüre und Kommentare. MAR hält den Canada Research Chair in Molecular Genetics und ist ein International Research Scholar des Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an MAR von den National Institutes of Health, der Howard Hughes Medical Institute, die kanadische Institutes of Health Research, die Muskeldystrophie Association und der Canada Research Chair Program unterstützt.

Alle Experimente wurden nach der University of Ottawa Vorschriften für tierische Pflege und Handhabung behandelt. Siehe Tabelle 1 für einen Überblick über das Protokoll. Ein. Vor dem Starten der Isolation <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: 0,2% Collagenase Typ I in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, hohe Glukose, L-Glutamin mit 110 mg / ml Natriumpyruvat). EDL für zwei Muskeln vorzubereiten 2 ml 0,2% Collagenease in DMEM. Die Lösung wird durch einen 0,22 um-Filter. 10 min vor der Isolierung, vorwärmen auf 37 ° C im Wasserbad. Zusätzliche Aliquote unverdünnten Collagenase kann bei -20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Anmerkung: Mit DMEM mit Natriumpyruvat in allen der Prozedur. Fasern nicht in Natriumpyruvat-freiem Medium überleben. <ul><li> Waschen Medien (verwenden, um alle Wäschen durchführen). DMEM ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin. Anschließend wird durch 00,22 um-Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Myofiber Kulturmedien. Supplement DMEM mit 20% FBS, 1% Hühnerembryo-Extrakt und 1% Penicillin / Streptomycin. Filtern durch 0,22 um-Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Matrigel beschichteten Schalen. Um Kultur Fasern für längere Zeit, empfehlen wir die Verwendung Matrigel als Beschichtung Substrat. Um Matrigel beschichteten Gerichte zubereiten, tauen ein Aliquot Matrigel bei 4 ° C über Nacht. Am Tag nach verdünnen Matrigel 1:10 in DMEM. Halten Matrigel bei 4 ° C zu allen Zeiten und vermeiden abrupte Temperaturänderungen da dies mikroskopischen Kristallen innerhalb der Matrigel-Lösung, was zu einer ungleichmäßigen Beschichtung zu schaffen. Ort Gerichten auf Eis überzogen werden. Coat Gerichte mit gerade genug Volumen, um die Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie es für 1 min sitzen. Vollständig zu entfernen die übrig gebliebenen Matrigel. Lassen Sie Speisen trocken bei 37 ° C für mindestens 3 Stunden vor dem Gebrauch oder über Nacht. </li></ul> Hinweis: Aliquots der verdünnten Matrigel kann mehrfach für die Beschichtung Zweck wieder verwendet, wenn bei 4 &amp; de gespeichertg; C. </li><li> Schließlich sollten Sie das Mikroskop Station und Sezieren Werkzeuge mit 70% Ethanol reinigen. </li><li> Für zwei EDL Isolationen (eine Maus) vorzubereiten fünf Kunststoff-Petrischalen (60 * 15mm) wie folgt: <ul><li> Vier Gerichte für die Isolierung (1 für Muskel-Dissoziation, 3 für serielle Wäschen). Alle Gerichte müssen mit Pferdeserum (HS) beschichtet werden, um Muskelfasern von der Befestigung auf Kunststoff zu vermeiden. Zu beschichten, Pipette 3 ml Pferdeserum in jede Schale, wirbeln um eine gleichmäßige Beschichtung zu ermöglichen, entfernen Sie das Pferdeserum und lassen die Schale trocken für mindestens 30 min. 4 ml DMEM zu jedem Gericht. Halten Schalen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator vor dem Gebrauch. </li></ul> Hinweis: Pferdeserum kann mehrfach wiederverwendet werden, wenn steril gehalten. Alternativ kann eine Lösung von 10% HS in DMEM zu beschichten Speisen verwendet werden. Verwenden HS beschichtete Platten während des gesamten Protokolls und bei der Kultivierung Muskelfasern auf schwimmenden Bedingungen. <ul><li> Ein Gericht wird zu Kultur Muskelfasern nach der Isolierung verwendet werden. Alternative Teller Größen oder Formate können für die endgültige Kultur der Muskelfasern abhängig Downstream-Anwendungen verwendet werden. Allerdings wissen wir nicht vorschlagen, Teller Größen größer als 60 * 15mm. Muskelfasern können in Suspension nicht länger als 96 Stunden aufbewahrt werden, bevor hyper Kontraktion auftritt. Für mehr Kultur Zeiten, empfehlen wir die Verwendung Matrigel beschichteten Schalen oder Platten. </li></ul></li><li> Für eine Faser Trennung (2 EDL), bereiten zwei sterile Pasteur Pipetten: eine große Bohrung Pipette für Muskel-Handling und eine kleine Bohrung Pipette für myofiber Manipulation. Verwenden Sie ein Diamant-Stift, um jede Glaspipette auf die gewünschte Länge und Wärme polieren Pipette Kanten zu glätten geschnitten. Durch die Verwendung der Flamme, Kurve die Spitze des kleinen Bohrung Pipette. Dies wird dazu beitragen die Handhabung einzelner Fasern. Flamme zu sterilisieren. Coat jede Pipette mit HS vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. Muscle Dissection und Verdauung <ol><li> Für den Zweck dieser Experimente, 8 Wochen alt SV129, Pax7 Creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) und Myf5-Cre; Rosa26YFP verwendet wurden. </li><li> Sprühen Hinterbeine mit 70% Ethanol. Merken das Tier (face up) auf einer Trägerplatte, um ein besseres Verständnis der Hintergliedmaße während des Verfahrens haben. </li><li> Mit Hilfe der Schere, durch die gesamte Länge des Gliedes schneiden und legen das darunterliegende Muskel. Entfernen Sie die Haut sowie keine Haare oder Fell (Abbildung 1A). </li><li> Mit einer feinen Schere, durch die dünne Faszie geschnitten, ohne die darunter liegenden Muskeln. Optisch zu lokalisieren die EDL. Die EDL ist im vorderen Fach des Hinterbein knapp unterhalb des Tibialis Anterior (TA) Muskel gefunden. </li><li> Mit Hilfe von zwei Zangen, setzen die distalen Sehnen. </li><li> Schneiden Sie den distalen Sehnen (sowohl der TA und EDL) mit scharfen Cohann-Vannas Frühjahr Schere. </li><li> Mit Hilfe einer Zange halten sowohl TA und EDL Muskeln durch ihre Sehnen und zart ziehen Sie die Muskeln um bis zum proximalen Ende. An diesem Punkt sollten Sie in der Lage sein, klar zu sehenDie EDL Muskel knapp unterhalb der TA Muskel. Jetzt trennen die EDL aus der TA Muskel durch Ziehen an den beiden Sehnen in entgegengesetzte Richtungen (Abbildung 1B). Vermeiden Sie Dehnen der EDL Muskel während Sie diesen Vorgang ausführen, da dies die Muskelfasern beschädigt wird. </li><li> Setzen Sie die EDL Sehne. Zur besseren Visualisierung der proximalen Sehne kann es an dieser Stelle helfen, die TA Muskel zu entfernen. Es kann auch helfen abzuschneiden einige das Bindegewebe um das Knie (Abbildung 1C). </li><li> Schneiden Sie die proximale Sehne und entfernen Sie vorsichtig die EDL (1D). </li><li> Durch Halten des Muskels durch ihre Sehnen, dann in 2 ml des zuvor hergestellten Kollagenaselösung. Bei 37 ° C im Wasserbad. Hinweis: Isolierung für erfolgreiche Faser, ist es wichtig, die EDL aus Sehne-Sehne so isolieren, daß die myofiber Integrität aufrechterhalten wird. Schritte können von 2,3 bis 2,9 unter einem Präpariermikroskop durchgeführt werden. Alternativ kann die Verwendung eines magndern, indem Glas kann auch dazu beitragen, eine bessere Sicht auf die Muskeln. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 2,3 bis 2,9, die zweite EDL zu isolieren. Übertragen Sie die zweite EDL in das gleiche Rohr. Um ungleichmäßige Verdauung zu vermeiden, sollte die Isolierung des zweiten EDL nicht mehr als 5 min nach dem ersten auszufüllen. Hinweis 1: Inkubationszeit muss möglicherweise angepasst je nach Kollagenase-Aktivität werden. Längere oder kürzere Inkubationszeit ist möglicherweise erforderlich, je nach Größe, Alter und / oder Muskel-Zustand (zB fibrotische Muskeln brauchen mehr Verdauung Zeit). Hinweis 2: Wenn die Prüfung Satelliten-Zellen Verhalten unter quiescence Bedingungen Agitation während Muskel Aufschlusszeit aktivieren können Satelliten-Zellen 10. </li><li> Während der Verdauung Zeit, regelmäßig zu überprüfen, den Muskel über-Verdauung zu vermeiden. Stoppen Sie die Verdauung, wenn die Muskeln zu lockern beginnen und Muskelfasern sind sichtbar. Zur Verdauung zu stoppen, transferieren es vorsichtig in beide Muskeln eine vorgewärmte Petrischale mit 4 ml DMEM (dissociatiauf Teller). Nutzen Sie den großen Bohrung Pipette, um diesen Vorgang durchzuführen. Hinweis: Vermeiden Sie Muskeln overdigestion da dies unweigerlich in der Isolation hyper vertraglich Muskelfasern. </li></ol> 3. Einzel Myofiber Dissoziation und Kultur <ol><li> Um Muskelfasern freizugeben, verwenden Sie die große Bohrung Glaspipette, um den Muskel mit warmem Medium spülen, bis Fasern natürlich beginnen freigegeben wird. Nicht verreiben den Muskel, da dies zwangsläufig schädlich Fasern führen. Führen Sie diese und die folgenden Schritte unter einem Binokular. </li><li> Weiter Loslassen Muskelfasern, bis die gewünschte Zahl erreicht ist. Wenn der Teller bei Raumtemperatur für mehr als 10 min erforderlich erlauben eine 5 min (minimale) Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 wieder äquilibrieren das Medium. Anmerkung: Wenn Füllgut bis Temperaturen unter physiologischen (37 ° C) über einen längeren Zeitraum Muskelfasern wird sterben. </li><li> Mit der geringen Größe Bohrung Pipette transfer leben einzelnen Muskelfasern zu einer neuen vorgewärmte Schüssel (erste von drei aufeinanderfolgenden Waschungen). Fassen myofiber individuell statt der Übertragung Großteil der Muskelfasern auf einmal. Falls erforderlich, Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 bis 15 min erneut äquilibrieren das Medium. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3,3 für 2 weitere Male oder bis alle tot Muskelfasern und Schmutz entfernt werden. Wir empfehlen mindestens drei aufeinanderfolgenden Waschungen für eine ordnungsgemäße Reinigung. Hinweis: dead Muskelfasern erscheint so kurz und hyper Vertrag unter dem Mikroskop Licht. </li><li> Inkubieren einzelnen Muskelfasern bei 37 ° C, 5% CO 2 in der letzten Waschung Näpfe (DMEM nur) für mindestens eine Stunde vor dem Umschalten in Kulturmedium. Dies ermöglicht Muskelfasern um die in vitro-Bedingungen in Abwesenheit von Serum einzustellen. Wir fanden, dass die sofortige Kultur der Muskelfasern im Serum Vollmedium erhöht Faser Schrumpfung. </li><li> Nach einer Stunde, übertragen Muskelfasern zu einer neuen vorgewärmten Teller oder in den entsprechenden Kultur-Formatin Abhängigkeit von der stromabwärts Anwendung. Kultur Fasern in hoher Serum-Medium zu ermöglichen Satelliten-Zell-Aktivierung. Alternativ können unterschiedliche Konzentrationen von Serum oder Hühnerembryo-Extrakt eingesetzt werden. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li></ol> 4. Downstream-Anwendungen <ol><li> Immunfärbung. Live Muskelfasern festlegbar und zu jedem Zeitpunkt angefärbt werden während der Isolierung. Immunfluoreszenz kann sowohl schwimmend und Substrat-attached Muskelfasern durchgeführt werden. Wenn Flecken floating Muskelfasern, verwenden Sie eine kleine Bohrung Glaspipette um Muskelfasern von einer Lösung auf ein anderes übertragen. Alternativ ist es möglich, in der gleichen Muskelfasern gut halten im ganzen Verfahrens und Hinzufügen / Entfernen von Lösungen unter Verwendung einer Glaspipette. Vermeiden Standard Aspiration da dies die Entfernung der Muskelfasern sowie führt. Kurz gesagt, vollständig zu entfernen Kulturmedium; fix Muskelfasern in vorgewärmten 4% Paraformaldehyd (PFA) für 5 min. Weitgehend in PBS mehrmals waschen. Incubate Muskelfasern in 1% Glycin in PBS oder andere Standard-Abschrecken Lösungen zur Minimierung PFA Hintergrundfärbung. Falls erforderlich, permeabilisieren Muskelfasern mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 min durch einen 5 min Waschschritt in PBS. Inkubieren Fasern in Blockierungslösung (10% Pferdeserum, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) für 1 h bei Raumtemperatur oder vorzugsweise über Nacht bei 4 ° C. Alternative Blockierungslösungen können verwendet werden, abhängig von der Antikörper von Interesse. Waschen einmal in PBS für 5 min. Inkubieren mit dem entsprechenden primären Antikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° verdünnt C. Waschen Fasern 3 mal in 5 min pro Waschgang in PBS, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Inkubieren mit dem entsprechenden sekundären Antikörper für 45 min bis 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie 3 mal in 5 min pro Waschgang in PBS. Gegenfärbung Kerne mit 1 mg / ml DAPI. Wenn Anfärben schwimmenden Fasern, jede Faser übertragen auf einen Glasobjektträger für Mikroskopie. Entfernen Sie überschüssiges PBS oder Medium. Bewerben Montage medium und fügen Sie dann das Deckglas. Fahren Sie mit Muskelfasern unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Siehe Abbildung 4 für repräsentative Immunfluoreszenz auf EDL Muskelfasern. Alternative Färbeverfahren Verwendung stärkerer Fixiermitteln in Verma, M. et al. 11 und Wosniak, AC et al. 12 beschrieben. </li><li> Oligonukleotid oder Plasmid transienter Transfektion. Live Muskelfasern mit Plasmid-oder siRNA für spezifische Gen / s von Interesse transfiziert werden. Bei der Verwendung von siRNA, ist doppelt Transfektion für eine effiziente Gen-Knockdown empfohlen. Wir empfehlen die Durchführung der ersten Transfektion nach 8 Stunden aus der Isolation. Sechs Stunden nach der Transfektion mit frischem Medium ersetzt. Für siRNA-Transfektion, schlagen wir ausgehend unter Verwendung einer Endkonzentration von 50 nM. Genexpression knockdown kann durch RNA-Extraktion oder vorzugsweise durch Immunfärbung analysiert werden. </li><li> Virusinfektion. Infektion von lebenden Muskelfasern ist möglich, obwohl die Inzidenz der ZelleTod ist höher als mit Oligo Transfektion und die Effizienz der Infektion kann variabel in Abhängigkeit von Muskelerkrankungen und Alter aufweisen. Zum Beispiel sind intakt erwachsenen Muskel Muskelfasern insbesondere nicht in Reaktion auf virale Infektion durch die Anwesenheit von die Basalmembran von dem gezeigt wurde, um eine Schutzbarriere gegen Infektion Host 13, 14 vorzusehen. Lentivirale Vektoren werden über retrovirale Vektoren bevorzugt, weil sie Ruhestrom (nicht mitotischen Zellen) infizieren können. Bei viralen Infektionen, ist es ratsam, Kultur Fasern auf einer Matrigel beschichteten Teller oder Platte und lass Muskelfasern Medienberichten Bedingungen für die ersten 24 Stunden einzustellen. </li><li> Live-Imaging. Leben Bildgebung von Muskelfasern ist besonders zeitaufwendig und erfordert ein Mikroskop mit einem 37 ° C, 5% CO 2-Kammer ausgestattet. Es ist sinnvoll, bei der Beurteilung des Verhaltens der einzelnen Satelliten-Zellen. Arbeit mit dieser Technik wurde für die Entdeckung der Satelliten-Zell-Heterogenität instrumentalen und ihre beha studierenVior auf Fasern (15 und 16). </li></ol>

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<li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates%3A+a+mechanism+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li>
</ol>

Keine konkurrierenden Interessen.

Die Isolierung und Kultivierung von einzelnen Muskelfasern aus intakten Muskeln eine ausgezeichnete in vitro-Modell, um den Prozess der Muskelregeneration studieren. Ein einzigartiges Merkmal dieses Systems ist die Erhaltung der Satelliten-Zellen in ihrer physiologischen Umgebung unterhalb der Basallamina. Vor allem aber können die Technik verwendet, um Muskeln Stammzellverhaltens sowohl Ruhe und aktivierten Zustände zu untersuchen. In den vergangenen 20 Jahren hat sich die myofiber Kultursystem aussagekräftige Einblicke in die Biologie des Satelliten-Zell-Population, die mit Bezug auf die beiden inneren und äußeren Determinanten. Durch Kultivierung einzelnen Muskelfasern, hat Satelliten-Zell-Heterogenität in Bezug auf myofiber, Muskel-Typ oder regenerative Potenzial wurde 15 gerichtet. Aufwändige Untersuchungen mit Live-Bildgebung von einzelnen kultivierten Fasern für die Einholung von Informationen über Satellit Zellmigration Muster 16 erlaubt. Der Erwerb von quantitativen Daten ist einelso möglich. Obwohl zeitaufwendig, bietet es wichtige Informationen über die Verteilung und das Auftreten von bestimmten Ereignissen (Stammzellen asymmetrische Teilung, Vermehrung und Differenzierung Verhältnis, etc.). Zusammen mit den zuvor beschriebenen Anwendungen ist Protein oder RNA-Extraktion aus Einzelfasern auch möglich, obwohl Isolierung reiner Population von Zellen durch FACS Satelliten oder andere Mittel eine bessere Plattform zu Protein oder Genexpression Veränderungen auf molekularer Ebene zu untersuchen vorsehen. In unserer Erfahrung ist der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Faser Trennung der &quot;Sehne Sehne&quot; Isolation (Schritte von 2,5 bis 2,9 im Protokoll Text). Dies gewährleistet, dass nach Muskel Verdauung, Fasern aus der EDL mit minimalen oder keinen Schaden wodurch ihre Leistung in folgenden Schritten freigegeben.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagent / Material </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Bereiten Sie frisches alle Zeiten für optimale Ergebnisse. Weitere Aliquots unverwässert Kollagenase können bei -20 ° C gelagert werden </td></tr><tr><td> DMEM high glucose + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Zugabe von Pen / Strep ist notwendig, um Luftverunreinigungen zu minimieren </td></tr><tr><td> Gekennzeichnet Fetal Bovine Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Horse Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Huhn Embryo Extract </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Vermeiden Gefrier-/Tauzyklen. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Shop Aliquots bei -20 ° C. Vermeiden Gefrier-/Tauzyklen. Bewahren verdünnten Aliquots bei 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Frühling Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Thin Irisschere-10.5cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Irispinzette Curved </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamant Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm Petrischale </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 um Filter </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Eine zusätzliche Lichtquelle erforderlich sein, um eine bessere Fokussierung Sicht haben werden </td></tr></tbody></table>

isolation und kultur der einzelnen muskelfasern und ihre satelliten aus adulten skelettmuskel

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle Regeneration im adulten wird von ansässigen Stammzellen genannt Satelliten-Zellen durchgeführt. Satelliten-Zellen zeichnen sich durch ihre Position zwischen der Basallamina und der Sarkolemm jedes myofiber definiert. Aktuelle Kenntnisse über ihr Verhalten in hohem Maße von der Nutzung der einheitlichen myofiber Trennung Protokoll. Im Jahr 1985 beschrieben Bischoff ein Protokoll, um einzelne lebende Fasern vom Flexor digitorum brevis (FDB) von erwachsenen Ratten mit dem Ziel, ein in vitro-System, in dem die physikalische Verbindung zwischen dem myofiber und dessen Stammzellen 1 erhalten bleibt erstellen isolieren. In 1995, die Bischoff Protokoll, so dass Muskelfasern werden einzeln aufgenommen und separat nach Kollagenaseverdau anstatt von Schwerkraftsedimentation 2, 3 getrennt gehandhabt Rosenblattmodified. Das Rosenblatt oder Bischoff-Protokoll ist seitdem auf verschiedene Muskeln, des Alters oder Bedingungen 3-6 angepasst. Die einzigen myofiber Trennung Technik ist ein unverzichtbaresTool aufgrund seiner einzigartigen Vorteile. Zuerst wird in dem einzigen myofiber Protokoll sind Satellitenzellen unterhalb der Basalmembran beibehalten. Dies ist ein einzigartiges Merkmal des Protokolls als andere Techniken wie Fluorescence Activated Cell Sorting chemische und mechanische Gewebedissoziation 7 erfordern. Obwohl die myofiber Kultur kann nicht für in vivo Studien zu ersetzen, bietet es eine hervorragende Plattform, um relevante biologische Eigenschaften von Muskel-Stammzellen befassen. Einzel Muskelfasern kann in Standard Plattierungsbedingungen oder schwimmende Bedingungen kultiviert werden. Satelliten-Zellen auf schwimmenden Muskelfasern sind kaum ein anderer Einfluss als die myofiber Umgebung ausgesetzt. Substrat Steifigkeit und Überzüge erwiesen sich Satelliten Zellen die Fähigkeit zur Muskeln 8, 9 regenerieren so zu beeinflussen, in der Lage zu jeder dieser Faktoren steuern unabhängig ermöglicht Diskriminierung zwischen nischenartigen abhängige und unabhängige Reaktionen. Verschiedene Konzentrationen von Serum habenAuch wurde gezeigt, dass eine Wirkung auf den Übergang von der Aktivierung quiescence haben. Um die Ruhe Zustand des zugehörigen Satelliten-Zellen zu erhalten, sollten Fasern in niedrigen Serum-Medium 1-3 gehalten werden. Dies ist besonders nützlich, wenn das Studium Gene in der Ruhephase involviert Zustand. Im Serum Vollmedium, Satelliten-Zellen schnell zu aktivieren, vermehren, zu migrieren und zu differenzieren, so imitiert die in vivo regenerativen Prozess 1-3. Das System kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Assays, wie die Prüfung chemischer Inhibitoren durchzuführen; ektopische Expression von Genen, die durch Viren Lieferung; Oligonukleotid basierte Gen-Knock-Down-oder Live-Bildgebung. Dieses Video Artikel beschreibt das Protokoll derzeit in unserem Labor verwendet, um einzelne Muskelfasern vom extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von erwachsenen Mäusen (6-8 Wochen alt) zu isolieren.

Hier beschreiben wir die Isolierung einzelner Muskelfasern aus dem EDL Muskel erwachsenen Mäusen. Erfolgreiche Muskelfasern ergeben von mehreren Faktoren ab, wie z. B. Kollagenase Aktivität oder Muskelerkrankungen oder Alter abhängen. Am wichtigsten ist, zeigt die Isolierung der Muskel aus Sehne-Sehne führt zu langen, intakten Muskelfasern von EDL Muskel. Abbildung 1 eine schrittweise graphische Darstellung der &quot;Sehne-Sehne&quot; Isolation. Sobald der Muskel vollständig verdaut ist, werden Muskelfasern durch leichten Druck auf den Muskel freigesetzt. 2A zeigt ein repräsentatives Bild eines myofiber Isolationsexperiment nach der ersten Wäsche. Zu diesem Zeitpunkt die Kultur ein Gemisch aus Bündeln von einzelnen Muskelfasern, die so lang und glänzend erscheinen röhrenförmigen Strukturen enthält, kontrahiert hyper Muskelfasern, die dunkel und kurze und Fremdkörper aus der Verdauung sind. Am Ende von mindestens drei aufeinanderfolgenden Wäschen sollte nur einzelne Muskelfasern in der Live-di bleibensh für Kultur oder nachgeschaltete Analyse (Abbildung 2B). 2C zeigt eine lange, live Faser zu einer hyper vertraglich Faser (C &#39;) verglichen. Zum Zeitpunkt der Trennung, erscheinen Satellitenzellen als winzige Erhebungen auf der Oberfläche myofiber (Abbildung 3A). Wenn im Serum reichen Medium gehalten, aktivieren Satelliten-Zellen vermehren sich, wandern und schließlich in Myotuben (B) zu verschmelzen. Nach 15 Tagen in Kultur exprimieren alle Myotuben die Myf5 Reporter YFP (C) darauf hindeutet, dass die Regeneration der Muskulatur in der Erwachsenen durch Zellen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt während ihrer Entwicklung die myogene bestimmender Faktor Myf5 geäußert hatte ausgeführt wird. Alle Satelliten-Zellen exprimieren den paired box Transkriptionsfaktor Pax7 17. Der Reporter Mauslinie Pax7Cre-TdTomato können verwendet werden, um Satelliten-Zellen über die Expression des TdTomato Fluoreszenzsignal (Figuren 3D und E) zu verfolgen. Abbildung 4 zeigt eine repräsentative immunofluorescence der doppelten Pax7 + / MyoD Satelliten-Zellen. Klassisch Doppelzimmer Pax7 + / MyoD + Satelliten-Zellen sind proliferative engagierte Muskeln Vorfahren, die entweder komplett die Differenzierung Programm nach unten regulieren Pax7 unter Beibehaltung MyoD Ausdruck oder Rückkehr zur Ruhe, indem sich die Regulierung MyoD und Aufrechterhaltung Pax7 Ausdruck 18 werden berücksichtigt <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. EDL Muskel isoliert von der Maus Hinterlauf. A. Hinterlauf eines 8 Wochen alten adulten Maus. Pfeile zeigt das distale (Knie) Sehnen und das proximale (Fuß) Sehne. B. Anatomische Position des Tibialis Anterior (TA) Muskel und dem M. extensor digitorum longus (EDL) Muskel. C. Durch das Halten der EDL durch die proximale Sehne, wird der Muskel in Richtung Knie gezogen, um die distale Sehne freizulegen. D. Der distale Sehnegeschnitten und die EDL freigesetzt wird. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einem einzigen myofiber Trennung Experiment. A. Hellfeld Bild von einem myofiber Trennung Experiment am ersten Waschschritt. Rote Pfeil zeigt Live-Muskelfasern, zeigt weißen Pfeil hyper kontrahierten Muskelfasern und gelbe Pfeil zeigt Zellen, myofiber oder ECM Schutt. B. Nach aufeinanderfolgenden Waschungen in DMEM, bleiben nur Live-Muskelfasern. C und C &#39;. Bild stellt eine lange intakten lebenden myofiber (C) und eine kurze hyper kontrahiert myofiber (C &#39;). Bar 10 um. Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit AxioCam HR ausgestattet genommen. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Figur<html> e 3. Repräsentative Ergebnisse aus einem einzigen myofiber Kultur Experiment. A. Hellfeld-Bild eines einzelnen, Live myofiber mit seinem zugehörigen Satellitenzelle (Pfeil) direkt nach der Isolierung (Zeit 0). B. Einzel Muskelfasern wurden auf Matrigel ausplattiert und im Serum Vollmedium für 15 Tage. Weißer Pfeil zeigt differenziert Myotuben zu einzelnen Zellen (gelber Pfeil) C verglichen. Einzel Muskelfasern aus einer Myf5Cre; RosaYFP Maus wurden wie in B kultiviert. Der Pfeil zeigt Myf5 abgeleiteten Myotuben. D und E. Einzel Muskelfasern vom Pax7Cre; TdTomato wurden isoliert und direkt nach behoben. Die Pfeile zeigen Pax7 positive Ruhestrom Satelliten Zelle (E, rot). Zellkerne wurden mit DAPI (D) gegengefärbt. Bar: 50 um. Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit AxioCam HR ausgestattet genommen. Wegen &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Beispiel für Immunfluoreszenzfärbung von Satelliten-Zellen auf Muskelfasern. Einzelzimmer Muskelfasern wurden isoliert und kultiviert für 72 Stunden in schwimmenden Bedingungen. Satellite Zellen Muskelfasern wurden für die Satelliten-Zell-spezifischer Marker Pax7 (B, rot) und des myogenen regulatorischen Faktor MyoD (C, grün) gefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI (A) gegengefärbt. Bars: 50 um. Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit AxioCam HR ausgestattet genommen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Muscle Dissection (5 min jeder Muskel) </td><td><ul><li> Sehne Sehne Trennung </li><li> Scharfe Werkzeuge </li><li> Minimal Muskelschäden </li></ul></td></tr><tr><td> Muscle Verdauung (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturempfindlich </li><li> Vermeiden overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Trennung </td><td><ul><li> Vermeiden Manipulation von Fasern </li><li> Beseitigen Sie Schmutz mit mehreren Wäschen </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Kultur (bis zu 3-4 Wochen) </td><td><ul><li> Format: beliebig </li><li> Beschichtung: Pferdeserum, Matrigel </li><li> Medium: basale oder hohe Serum </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Übersicht der myofiber Trennung Protokoll. Myofiber Trennung Protokoll besteht aus 4 großen Schritten. Für jede Stufe werden die ungefähre Zeit und große kritische Punkte diskutiert. Für detaillierte Diskussion der einzelnen Schritte, um das Protokoll Text beziehen.

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der Goldstandard<em&gt; In vitro</em&gt; System, um den Übergang von Satellitenzellen über quiescence, Aktivierung und Differenzierung zu studieren. Wichtig ist, bewahrt die einzelnen myofiber Kultursystem die myofiber / Stammzell-Vereinigung, die ein wesentlicher Bestandteil des Muskels Stammzellnische ist.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne lebende Fasern und die damit verbundenen Stammzellen aus dem EDL-Muskel erwachsener Mäuse zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das EDL mit einem Sehnen-zu-Sehnen-Präparierverfahren herauspräpariert wird, bei dem die Fasern nicht beschädigt werden. Als nächstes wird eine Muskelverdauung durchgeführt, um die Fasern zu entflechten und gleichzeitig die Myofaser-Stammzellassoziation zu erhalten, was ein einzigartiger Schritt in diesem Protokoll ist.Im letzten Schritt werden einzelne Myofasern schonend voneinander getrennt, während Ablagerungen oder hyperkontraktive Fasern durch aufeinanderfolgende Wäschen entfernt werden. Letztendlich können Myofasern, die durch diese Technik isoliert werden, entweder in einem halb ruhenden Zustand mit minimalen Aktivierungsreizen gehalten oder in einem Medium mit hohem Serumgehalt kultiviert werden, um die Aktivierung und Differenzierung von Satellitenzellen zu untersuchen. In den letzten Jahren hat sich die Verwendung von kultivierten Moorfasern als sehr leistungsfähiger Ansatz erwiesen, um die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von Satellitenzellen in einer relevanten physiologischen Nische zu untersuchen.Dieser Ansatz hat es uns ermöglicht, große Fortschritte beim Verständnis der Funktion dieser Zellen auf molekularer und zellulärer Ebene zu erzielen. Bereiten Sie für jede Maus, von der EDL isoliert wird, fünf 60-Millimeter-Petrischalen aus Kunststoff mit einer Schicht Pferdeserumpipette vor, vier Millimeter Pferdeserum auf eine Schale und schwenken Sie sie, um eine gleichmäßige Beschichtung zu erzielen. Entfernen Sie dann das Pferdeserum, saugen Sie das übrig gebliebene Serum ab und lassen Sie das Gericht mindestens 30 Minuten trocknen.Nach einer halben Stunde vier Milliliter Spülmittel auf vier Teller geben. Beschriften Sie das Geschirr wie folgt: Muskel nach dem Verdau, waschen Sie eins, waschen Sie zwei und waschen Sie drei. Geben Sie vier Milliliter Fasernährmedium in die verbleibende Faserkulturschale.Bewahren Sie das Geschirr vor dem Gebrauch bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator auf. Bereiten Sie anschließend für die Isolierung einer Faser zwei sterile Pipetten unter einem Mikroskop vor. Stelle eine Pipette mit großem Durchmesser her, indem du eine Pipette mit kleinem Bohrloch mit einem Diamantstift so schneidest, dass die Öffnung groß genug ist, damit der gesamte Muskel durchgespült werden kann.Die zweite Pipette ist eine Pipette mit kleinem Durchgang für die MyFi-Manipulation. Flammen Sie nun die Pipetten, um die Kanten zu glätten und zur Sterilisation mit Hilfe der Flammenkurve, der Spitze der Pipette mit kleinem Durchgang. Dies wird bei der Handhabung einzelner Fasern während der Isolierung helfen.Bestreichen Sie dann beide Pipetten mit Pferdeserum. Achten Sie abschließend darauf, die Mikroskopstation und die Präparierwerkzeuge mit 70 % Ethanol zu reinigen. Für diese Demonstration wurden acht Wochen alte transgene SV 1 29 Mäuse verwendet.Wurden eingeschläfert. Besprühen Sie die Hinterbeine mit 70%igem Ethanol. Stecke das Tier dann mit der Vorderseite nach oben an ein Stützbrett.Dies wird benötigt, um die Hintergliedmaßen besser greifen zu können. Schneiden Sie dann die gesamte Länge der Extremität durch und legen Sie den darunter liegenden Muskel frei. Entfernen Sie die Haut sowie alle Haare oder das Fell.Schneiden Sie mit einer feinen Schere durch die dünne Faszie, die den Muskel umgibt, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen. Legen Sie sowohl die distalen TA- als auch die EDL-Sehnen mit scharfem Cohan Vana frei. Federschere.Schneiden Sie sowohl EDL- als auch TA-distale Sehnen. Halten Sie dann mit Hilfe einer Pinzette sowohl die TA- als auch die EDL-Muskeln an ihren Sehnen fest und ziehen Sie die Muskeln vorsichtig zum proximalen Ende hinauf. Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie in der Lage sein, den EDL-Muskel direkt unter dem TA-Muskel deutlich zu sehen.Trennen Sie nun den EDL vom TA-Muskel, indem Sie die beiden Sehnen in entgegengesetzte Richtungen ziehen. Vermeiden Sie es, den EDL-Muskel während dieser Operation zu dehnen. Da dies die Myofasern schädigt.Legen Sie die EDL-Sehne frei. An dieser Stelle kann es hilfreich sein, den TA-Muskel zu entfernen, um die proximale Sehne besser sichtbar zu machen. Es kann auch helfen, einen Teil des Bindegewebes um das Knie herum abzuschneiden.Sobald die Sehne deutlich sichtbar ist, verwenden Sie eine scharfe cohan Venus Spring Schere, um den EDL-Muskel zu befreien. Wenn der Eingriff korrekt durchgeführt wurde und EDL in der Lage sein sollte, seine längliche Form beizubehalten, sobald es aus der Extremität entfernt wurde und den EDL-Muskel durch seine Sehnen hält, übertragen Sie es in eine vorwarme zwei Milliliter Kollagenaselösung und inkubieren Sie es in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Vorgang, um das zweite EDL zu isolieren und es in dasselbe Röhrchen mit Kollagenase zu übertragen, um eine ungleichmäßige Verdauung zu erzielen.Die Isolierung der zweiten EDL sollte innerhalb von fünf Minuten nach der Isolierung abgeschlossen sein. Die erste EDL-Inkubationszeit muss möglicherweise je nach kollagener Aktivität, Muskelgröße, Tieralter oder Muskelzustand angepasst werden. Zum Beispiel kann Muskel mit viel fibrotischem Gewebe eine längere Inkubationszeit benötigen.Beachten Sie auch, dass sich gezeigt hat, dass Unruhe während dieser Zeit die S-Zellen aktiviert. Während der Verdauungszeit überprüfen Sie regelmäßig den Muskel, um eine Überverdauung zu vermeiden. Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Muskeln zu lockern beginnen und die Myofasern sichtbar werden. Übertragen Sie beide Muskeln mit der Pipette mit großem Durchgang vorsichtig in eine vorgewärmte Petrischale.Bei vier Millilitern Waschmittel muss eine Überverdauung vermieden werden, da dies zu einer übermäßigen Kontraktion der Myofasern führt. Um die Myofasern freizusetzen, verwenden Sie die Pipette des Großglases, um den Muskel mit warmem Medium zu spülen, bis die Fasern auf natürliche Weise freigesetzt werden. Tritrieren Sie den Muskel nicht, da dies unweigerlich zu einer Schädigung der Fasern führt.Setzen Sie die Myofasern weiter frei, bis die gewünschte Anzahl erreicht ist. Lassen Sie das Gericht nicht länger als 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Stellen Sie es für fünf Minuten in den Inkubator, um es wieder ins Gleichgewicht zu bringen, bevor Sie weiter mit ihm arbeiten.Die Kultur enthält derzeit eine Mischung aus lebenden einzelnen Myofasern, bei denen es sich um lange und glänzende röhrenförmige Strukturen handelt, hyperkontrahierten Fasern, die dunkel und kurz sind, und Trümmern. Übertragen Sie nun mit der Pipette mit kleiner Bohrung lebende einzelne Myop-Fasern in eine neue, vorentwurmte Schale. Behandeln Sie jede Myop-Faser einzeln.Anstatt den Großteil der Myofasern auf einmal zu übertragen, stellen Sie die Schale bei Bedarf für 10 bis 15 Minuten in einen Inkubator, um das Medium wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Übertragen Sie die einzelnen Myop-Fasern noch zweimal, um alle abgestorbenen Myofasern und Ablagerungen am Ende von mindestens drei aufeinanderfolgenden Wäschen zu entfernen. Nur einzelne lebende Myofasern sollten für die Kultur oder nachgelagerte Analyse in der Schale verbleiben.Lebende Fasern haben eine lange Morphologie. Im Gegenteil, hyperkontraktive Fasern sind kürzer und dicker. Inkubieren Sie nun die isolierten Myofasern mindestens eine Stunde lang in Waschmedien, bevor Sie auf Kulturmedium umsteigen.In einer neuen Vorwärmschale ermöglicht hohes Medium die Aktivierung von Satellitenzellen für lange Kulturen. Matrigel kann unabhängig vom gewählten Medium geeignet sein. Wechseln Sie es jeden zweiten Tag zum Zeitpunkt der Isolation.Die Satellitenzellen auf jedem MyFi erscheinen als winzige Ausstülpungen auf der Myofaseroberfläche, wenn sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden. Wenn die Myofasern über längere Zeiträume in serumreichem Medium gehalten werden, werden in der Kultur überwiegend vollständig differenzierte Myotuben beobachtet. Reportermausstämme wie die MIFF five Cree Rosa YFP-Linie sind optimale Werkzeuge, um den Prozess der Muskelregeneration zu untersuchen.Myo-Röhrchen, die aus einer Miff-Fünf-Cree-Rosa-YFP-Faserkultur gewonnen wurden, exprimierten den MIFF-Fünf-Reporter-YFP. Dies deutet darauf hin, dass die Muskelregeneration die Aktivierung von Miff five erfordert. Der PAX Seven Cree TD Tomatenmausstamm ist eine weitere Reporterlinie.Das TD-Tomatenfluoreszenzsignal wird nur von Satellitenzellen detektiert, während myON-Kerne deutlich negativ sind. Dies deutet darauf hin, dass der Transkriptionsfaktor PAX seven ausschließlich von Muskelstammzellen und nicht von ihren differenzierten Nachkommen exprimiert wird. Myofasern und die zugehörigen Satellitenzellen können für den Downstream fixiert werden.Immunfluoreszenz PAC sieben positive myo D positive Satellitenzellen gelten klassischerweise als proliferative engagierte Muskelvorläuferzellen. Sie werden entweder das Differenzierungsprogramm abschließen, indem sie PAC sieben herunterregulieren, während sie meine OD-Expression beibehalten, oder sie kehren zur Ruhe zurück, indem sie meine OD herunterregulieren und die PAC 7-Expression aufrechterhalten. Die Einzelfaserisolationstechnik hat die einzigartige Eigenschaft, dass die physiologische Myofaser-Satellitenzellassoziation erhalten bleibt.Der kritischste Schritt dieses Eingriffs ist die Dissektion des EDL-Muskels von Sehne zu Sehne. Minimale Fasermanipulation ermöglicht auch die Erhaltung der Faserintegrität und -lebensfähigkeit. Die erfolgreiche Isolierung einzelner Myop-Fasern hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der kollagenen Aktivität, dem Muskelzustand oder dem Alter.Am wichtigsten ist, dass die Isolierung des Muskels von Sehne zu Sehne die Aufrechterhaltung der Faserintegrität ermöglicht. Außerdem ermöglicht die minimale Fasermanipulation während des gesamten Verfahrens eine höhere Überlebensrate.

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Biologie

Dieses Video zeigt die Isolierung einzelner Myofasern aus entnommenem Maus-Musculus Extensor Digitorum Longus (EDL). Die isolierten Myofasern können kultiviert werden, um die Aktivität von Myofaser-assoziierten Muskelstammzellen zu untersuchen.

Myofaserisolierung: Eine Technik zur Gewinnung einzelner Myofasern aus entnommenen Mausmuskeln Extensor Digitorum longus (EDL)

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Satellitenzellen aus branchiomeric Kopf Muskeln über ein 9 Wochen alten Ratte. Die Muskeln aus unterschiedlichen Kiemenbögen. Anschließend werden die Satellitenzellen auf einem Spotlackierung von Millimetergröße, um ihre Differenzierung zu untersuchen kultiviert. Dieser Ansatz vermeidet die Expansion und Passagieren von Satellitenzellen.

Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste, reproduzierbare und einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung von Myoblasten Vorläuferzellen aus dem Skelettmuskel von Erwachsenen und alten Menschen. Die Muskeln hier sind Fuß- und Beinmuskeln. Dieser Ansatz ermöglicht die Isolierung einer angereicherten Population von primären Myoblasten für funktionelle Studien.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Die Skelettmuskulatur besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich residenter Stammzellen, von denen jede einen besonderen Beitrag zur Muskelhomöostase und -regeneration leistet. Hier werden die 2D-Kultur von Muskelstammzellen und die Muskelzellnische in einer ex vivo Umgebung beschrieben, die viele der physiologischen, in vivo und Umwelteigenschaften bewahrt.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakter einzelner Muskelfasern aus dem oxidativen Soleus und die Einrichtung hochgereinigter Myoblastkulturen, die aus diesen Fasern gewonnen wurden. Das optimierte Verfahren liefert zuverlässig etwa 300–500 intakte Myofasern pro Maus, was nachgelagerte molekulare und zelluläre Analysen ermöglicht.

Einzelfaser-Isolationstest zur Beurteilung des oxidativen Myofaserverhaltens

Lernen Sie die Isolierung und Kultur einzelner Muskelfasern aus dem EDL-Muskel adulter Mäuse zur Untersuchung von Satellitenzell-Aktivierung und Differenzierung. Diese Methode bewahrt die physiologische Nische für Muskelstammzellforschung.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

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