Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne lebende Fasern und die damit verbundenen Stammzellen aus dem EDL-Muskel erwachsener Mäuse zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das EDL mit einem Sehnen-zu-Sehnen-Präparierverfahren herauspräpariert wird, bei dem die Fasern nicht beschädigt werden. Als nächstes wird eine Muskelverdauung durchgeführt, um die Fasern zu entflechten und gleichzeitig die Myofaser-Stammzellassoziation zu erhalten, was ein einzigartiger Schritt in diesem Protokoll ist.

Im letzten Schritt werden einzelne Myofasern schonend voneinander getrennt, während Ablagerungen oder hyperkontraktive Fasern durch aufeinanderfolgende Wäschen entfernt werden. Letztendlich können Myofasern, die durch diese Technik isoliert werden, entweder in einem halb ruhenden Zustand mit minimalen Aktivierungsreizen gehalten oder in einem Medium mit hohem Serumgehalt kultiviert werden, um die Aktivierung und Differenzierung von Satellitenzellen zu untersuchen. In den letzten Jahren hat sich die Verwendung von kultivierten Moorfasern als sehr leistungsfähiger Ansatz erwiesen, um die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von Satellitenzellen in einer relevanten physiologischen Nische zu untersuchen.

Dieser Ansatz hat es uns ermöglicht, große Fortschritte beim Verständnis der Funktion dieser Zellen auf molekularer und zellulärer Ebene zu erzielen. Bereiten Sie für jede Maus, von der EDL isoliert wird, fünf 60-Millimeter-Petrischalen aus Kunststoff mit einer Schicht Pferdeserumpipette vor, vier Millimeter Pferdeserum auf eine Schale und schwenken Sie sie, um eine gleichmäßige Beschichtung zu erzielen. Entfernen Sie dann das Pferdeserum, saugen Sie das übrig gebliebene Serum ab und lassen Sie das Gericht mindestens 30 Minuten trocknen.

Nach einer halben Stunde vier Milliliter Spülmittel auf vier Teller geben. Beschriften Sie das Geschirr wie folgt: Muskel nach dem Verdau, waschen Sie eins, waschen Sie zwei und waschen Sie drei. Geben Sie vier Milliliter Fasernährmedium in die verbleibende Faserkulturschale.

Bewahren Sie das Geschirr vor dem Gebrauch bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator auf. Bereiten Sie anschließend für die Isolierung einer Faser zwei sterile Pipetten unter einem Mikroskop vor. Stelle eine Pipette mit großem Durchmesser her, indem du eine Pipette mit kleinem Bohrloch mit einem Diamantstift so schneidest, dass die Öffnung groß genug ist, damit der gesamte Muskel durchgespült werden kann.

Die zweite Pipette ist eine Pipette mit kleinem Durchgang für die MyFi-Manipulation. Flammen Sie nun die Pipetten, um die Kanten zu glätten und zur Sterilisation mit Hilfe der Flammenkurve, der Spitze der Pipette mit kleinem Durchgang. Dies wird bei der Handhabung einzelner Fasern während der Isolierung helfen.

Bestreichen Sie dann beide Pipetten mit Pferdeserum. Achten Sie abschließend darauf, die Mikroskopstation und die Präparierwerkzeuge mit 70 % Ethanol zu reinigen. Für diese Demonstration wurden acht Wochen alte transgene SV 1 29 Mäuse verwendet.

Wurden eingeschläfert. Besprühen Sie die Hinterbeine mit 70%igem Ethanol. Stecke das Tier dann mit der Vorderseite nach oben an ein Stützbrett.

Dies wird benötigt, um die Hintergliedmaßen besser greifen zu können. Schneiden Sie dann die gesamte Länge der Extremität durch und legen Sie den darunter liegenden Muskel frei. Entfernen Sie die Haut sowie alle Haare oder das Fell.

Schneiden Sie mit einer feinen Schere durch die dünne Faszie, die den Muskel umgibt, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen. Legen Sie sowohl die distalen TA- als auch die EDL-Sehnen mit scharfem Cohan Vana frei. Federschere.

Schneiden Sie sowohl EDL- als auch TA-distale Sehnen. Halten Sie dann mit Hilfe einer Pinzette sowohl die TA- als auch die EDL-Muskeln an ihren Sehnen fest und ziehen Sie die Muskeln vorsichtig zum proximalen Ende hinauf. Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie in der Lage sein, den EDL-Muskel direkt unter dem TA-Muskel deutlich zu sehen.

Trennen Sie nun den EDL vom TA-Muskel, indem Sie die beiden Sehnen in entgegengesetzte Richtungen ziehen. Vermeiden Sie es, den EDL-Muskel während dieser Operation zu dehnen. Da dies die Myofasern schädigt.

Legen Sie die EDL-Sehne frei. An dieser Stelle kann es hilfreich sein, den TA-Muskel zu entfernen, um die proximale Sehne besser sichtbar zu machen. Es kann auch helfen, einen Teil des Bindegewebes um das Knie herum abzuschneiden.

Sobald die Sehne deutlich sichtbar ist, verwenden Sie eine scharfe cohan Venus Spring Schere, um den EDL-Muskel zu befreien. Wenn der Eingriff korrekt durchgeführt wurde und EDL in der Lage sein sollte, seine längliche Form beizubehalten, sobald es aus der Extremität entfernt wurde und den EDL-Muskel durch seine Sehnen hält, übertragen Sie es in eine vorwarme zwei Milliliter Kollagenaselösung und inkubieren Sie es in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Vorgang, um das zweite EDL zu isolieren und es in dasselbe Röhrchen mit Kollagenase zu übertragen, um eine ungleichmäßige Verdauung zu erzielen.

Die Isolierung der zweiten EDL sollte innerhalb von fünf Minuten nach der Isolierung abgeschlossen sein. Die erste EDL-Inkubationszeit muss möglicherweise je nach kollagener Aktivität, Muskelgröße, Tieralter oder Muskelzustand angepasst werden. Zum Beispiel kann Muskel mit viel fibrotischem Gewebe eine längere Inkubationszeit benötigen.

Beachten Sie auch, dass sich gezeigt hat, dass Unruhe während dieser Zeit die S-Zellen aktiviert. Während der Verdauungszeit überprüfen Sie regelmäßig den Muskel, um eine Überverdauung zu vermeiden. Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Muskeln zu lockern beginnen und die Myofasern sichtbar werden. Übertragen Sie beide Muskeln mit der Pipette mit großem Durchgang vorsichtig in eine vorgewärmte Petrischale.

Bei vier Millilitern Waschmittel muss eine Überverdauung vermieden werden, da dies zu einer übermäßigen Kontraktion der Myofasern führt. Um die Myofasern freizusetzen, verwenden Sie die Pipette des Großglases, um den Muskel mit warmem Medium zu spülen, bis die Fasern auf natürliche Weise freigesetzt werden. Tritrieren Sie den Muskel nicht, da dies unweigerlich zu einer Schädigung der Fasern führt.

Setzen Sie die Myofasern weiter frei, bis die gewünschte Anzahl erreicht ist. Lassen Sie das Gericht nicht länger als 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Stellen Sie es für fünf Minuten in den Inkubator, um es wieder ins Gleichgewicht zu bringen, bevor Sie weiter mit ihm arbeiten.

Die Kultur enthält derzeit eine Mischung aus lebenden einzelnen Myofasern, bei denen es sich um lange und glänzende röhrenförmige Strukturen handelt, hyperkontrahierten Fasern, die dunkel und kurz sind, und Trümmern. Übertragen Sie nun mit der Pipette mit kleiner Bohrung lebende einzelne Myop-Fasern in eine neue, vorentwurmte Schale. Behandeln Sie jede Myop-Faser einzeln.

Anstatt den Großteil der Myofasern auf einmal zu übertragen, stellen Sie die Schale bei Bedarf für 10 bis 15 Minuten in einen Inkubator, um das Medium wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Übertragen Sie die einzelnen Myop-Fasern noch zweimal, um alle abgestorbenen Myofasern und Ablagerungen am Ende von mindestens drei aufeinanderfolgenden Wäschen zu entfernen. Nur einzelne lebende Myofasern sollten für die Kultur oder nachgelagerte Analyse in der Schale verbleiben.

Lebende Fasern haben eine lange Morphologie. Im Gegenteil, hyperkontraktive Fasern sind kürzer und dicker. Inkubieren Sie nun die isolierten Myofasern mindestens eine Stunde lang in Waschmedien, bevor Sie auf Kulturmedium umsteigen.

In einer neuen Vorwärmschale ermöglicht hohes Medium die Aktivierung von Satellitenzellen für lange Kulturen. Matrigel kann unabhängig vom gewählten Medium geeignet sein. Wechseln Sie es jeden zweiten Tag zum Zeitpunkt der Isolation.

Die Satellitenzellen auf jedem MyFi erscheinen als winzige Ausstülpungen auf der Myofaseroberfläche, wenn sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden. Wenn die Myofasern über längere Zeiträume in serumreichem Medium gehalten werden, werden in der Kultur überwiegend vollständig differenzierte Myotuben beobachtet. Reportermausstämme wie die MIFF five Cree Rosa YFP-Linie sind optimale Werkzeuge, um den Prozess der Muskelregeneration zu untersuchen.

Myo-Röhrchen, die aus einer Miff-Fünf-Cree-Rosa-YFP-Faserkultur gewonnen wurden, exprimierten den MIFF-Fünf-Reporter-YFP. Dies deutet darauf hin, dass die Muskelregeneration die Aktivierung von Miff five erfordert. Der PAX Seven Cree TD Tomatenmausstamm ist eine weitere Reporterlinie.

Das TD-Tomatenfluoreszenzsignal wird nur von Satellitenzellen detektiert, während myON-Kerne deutlich negativ sind. Dies deutet darauf hin, dass der Transkriptionsfaktor PAX seven ausschließlich von Muskelstammzellen und nicht von ihren differenzierten Nachkommen exprimiert wird. Myofasern und die zugehörigen Satellitenzellen können für den Downstream fixiert werden.

Immunfluoreszenz PAC sieben positive myo D positive Satellitenzellen gelten klassischerweise als proliferative engagierte Muskelvorläuferzellen. Sie werden entweder das Differenzierungsprogramm abschließen, indem sie PAC sieben herunterregulieren, während sie meine OD-Expression beibehalten, oder sie kehren zur Ruhe zurück, indem sie meine OD herunterregulieren und die PAC 7-Expression aufrechterhalten. Die Einzelfaserisolationstechnik hat die einzigartige Eigenschaft, dass die physiologische Myofaser-Satellitenzellassoziation erhalten bleibt.

Der kritischste Schritt dieses Eingriffs ist die Dissektion des EDL-Muskels von Sehne zu Sehne. Minimale Fasermanipulation ermöglicht auch die Erhaltung der Faserintegrität und -lebensfähigkeit. Die erfolgreiche Isolierung einzelner Myop-Fasern hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der kollagenen Aktivität, dem Muskelzustand oder dem Alter.

Am wichtigsten ist, dass die Isolierung des Muskels von Sehne zu Sehne die Aufrechterhaltung der Faserintegrität ermöglicht. Außerdem ermöglicht die minimale Fasermanipulation während des gesamten Verfahrens eine höhere Überlebensrate.