Zweidimensionale Visualisierung und Quantifizierung von labilen, anorganischen Pflanzennährstoffen und Verunreinigungen im Boden

Der Bio- und Chemiekreislauf von Elementen im Boden spielt eine entscheidende Rolle in Umweltsystemen. Mit diesem Protokoll kann die Verteilung der in der Anlage verfügbaren Elementfraktionen mit Hilfe der DGT-Massenspektrometrie in 2D abgebildet werden. Diese Methode ist einzigartig in ihrer Fähigkeit, Ultraspurenmengen mehrerer anorganischer gelöster Spezies an der Grenzfläche des gelösten Stoffes zu visualisieren und zu quantifizieren, was die räumliche Auflösung alternativer Methoden deutlich übertrifft.

Neben der Untersuchung von Arbeits- und Stoffflüssen in Böden und Sedimenten kann diese Methode auch angewendet werden, um zu untersuchen, wie Pflanzenwurzeln Nährstoffe und Schadstoffe aufnehmen. Für die Herstellung von DGT-Gel beschichten Sie zunächst eine dünne Schicht aus gemischter Anionen- und Kationenbindungsgelsuspension auf Polyurethanbasis auf eine Glasplatte und legen Sie die Platte in einen Ofen, um die Gelbildung durch Lösungsmittelverdampfung zu initiieren. Nach dreimaliger Wiederholung der Anwendung und Verdampfung hydratisieren Sie die resultierende dreifach beschichtete Glasplatte in einem Wasserbad, um ein 0,1 Millimeter dünnes, reißfestes, gemischtes Anionen- und Kationenbindegel zu erhalten.

Um das Rhizotron zusammenzubauen, befestigen Sie mit zwei Klemmen eine kleine Acrylklinge am unteren Ende des Rhizotronanstiegs, wobei der Druck der Klemmen auf den Rhizotronrahmen gerichtet ist, so dass sich die Platte nicht nach innen biegt. Kippen Sie das Rhizotron leicht in Richtung der kleinen Kunststoffplatte und füllen Sie das Rhizotron mit vorangefeuchteter Erde bis zu einer Höhe von etwa vier Zentimetern. Rühren Sie das Rhizotron leicht um, um den Boden gleichmäßig zu verteilen, und drücken Sie den Boden mit einem Verdichtungswerkzeug vorsichtig um einige Millimeter zusammen.

Wiederholen Sie das Befüllen und Komprimieren, bis das Rhizotron mit Erde gefüllt ist, wobei oben ein Abstand von drei Zentimetern bleibt. Befestigen Sie mit Klebeband vorsichtig ein 13 x 22 Zentimeter großes Stück PTFE-Folie Eck für Ecke am Rhizotronrahmen und üben Sie Spannung aus, um eine ebene Folienoberfläche zu gewährleisten. Wenn die PTFE-Folie flach und angrenzend an die Bodenoberfläche ist, befestigen Sie ein zweites Stück Folie am unteren Ende des Rhizotrons, wobei Sie das obere PTFE-Folienstück auf die gleiche Weise um einen Zentimeter überlappen.

Wenn das zweite Stück gesichert ist, bringen Sie eine Schutzfolie aus Kunststoff an. Platzieren Sie eine Frontplatte auf dem mit Erde gefüllten und mit Folie bedeckten Rhizotron und platzieren Sie eine Schiene um jede Seite des Rhizotrons. Ziehen Sie dann die Schrauben von Hand fest, um die Schienen in der Frontplatte am Rhizotron zu befestigen, wobei die Schrauben zur geschlossenen Seite des Rhizotrons hin positioniert sind.

Um die Erde zu bewässern, schieben Sie Pipettenspitzen in die Wasserlöcher und lassen Sie das Wasser durch die Schwerkraft in die Erde fließen. Um Pflanzen anzubauen, pflanzen Sie bis zu zwei Setzlinge in das Rhizotron und geben Sie fünf Milliliter Wasser direkt zu den Sämlingen, um ihr Wachstum zu unterstützen. Decken Sie die obere Öffnung des Rhizotrons in den ersten zwei Tagen nach der Pflanzung mit einer transparenten Feuchtigkeitsspeicherfolie ab und wickeln Sie das Rhizotron in Alufolie ein, um mikrophytisches Wachstum zu verhindern.

Stellen Sie dann das gepflanzte Rhizotron in einen Wachstumsraum, dessen Umgebungsbedingungen auf die spezifischen Pflanzenanforderungen abgestimmt sind, und neigen Sie das Rhizotron um 25 bis 35 Grad, um die Wurzelentwicklung entlang der Frontplatte durch Gravitropismus zu gewährleisten. Um das hergestellte DGT-Gel aufzutragen, schneiden Sie eine 10 Mikrometer dicke Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometern auf eine Breite und Länge von mindestens mehr als einem Zentimeter auf jeder Seite des Gels und platzieren Sie die Membran auf dem Gel. Tragen Sie Wasser auf, um Luftblasen vom Stapel zu entfernen, und befestigen Sie die Membran mit Vinyl-Isolierband an allen vier Kanten des Gels auf der Platte.

Nachdem Sie die Frontplatte und die Schutzfolien entfernt haben, richten Sie den Sucher einer digitalen Spiegelreflexkamera, die mit einem Makroobjektiv ausgestattet ist, auf die Mitte des interessierenden Bereichs im Gel aus und fügen Sie einen Maßstabsbalken in das Bild ein, um ein orthogonales Foto des interessierenden Bereichs aufzunehmen. Richten Sie dann eine Kante der mit dem Gelmembranstapel bestückten Platte an einer Kante des offenen Rhizotrons aus. Biegen Sie die Platte vorsichtig in Richtung Erde und befestigen Sie die Platte mit den Schienen und Schrauben am Rhizotron.

Übertragen Sie nach der Probenahme die Frontplatte vom Rhizotron mit der Seite des Gelmembranstapels nach oben in eine Laminar-Flow-Haube und entfernen Sie vorsichtig das Klebeband und die Polycarbonatmembran, die das Gel bedeckt. Tragen Sie Wasser auf, damit das Gel frei auf einem dünnen Wasserfilm auf der Platte mit der Bodenkontaktseite nach oben schwimmt, und übertragen Sie das Gel auf eine Polyethersulfonmembran mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern und Löschpapierträger. Nachdem Sie den Gelstapel mit Schutzfolie abgedeckt haben, legen Sie den Stapel in einen Vakuum-Geltrockner.

Wenn das Gel vollständig getrocknet ist, fixieren Sie das trockene Gel mit doppelseitigem Klebeband zusammen mit anderen Gelproben auf einer Glasplatte. Um eine Laserablation mit induktiv gekoppeltem Plasma-Massenspektrometrie-Zeilenscan-Analyse der trockenen DGT-Gele durchzuführen, fixieren Sie zunächst die Probenrohlinge und -standards auf dem Laserablations-Probentisch und verriegeln Sie den Lasertisch in der Ablationszelle des Laserablationssystems. Bewegen Sie in der Laserablationssoftware den interessierenden Bereich auf der Geloberfläche und ziehen Sie eine einzelne, etwa einen Milliliter lange Linie über die Oberfläche des Gelstandards.

Streichen Sie mit der rechten Maustaste auf die Linie im Fenster "Scanmuster", um zu überprüfen, ob die Parameter für die Laserablation festgelegt und übernommen wurden, und verwenden Sie das Werkzeug "Scans duplizieren", um diese Linie viermal mit einem Abstand zwischen den Linien zu duplizieren, der größer als der Spotdurchmesser ist. Nachdem Sie diese Linie für jeden Gelstandard-Kalibrierungsrohling und jeden Methodenrohling wiederholt haben, ziehen Sie eine einzelne Linie entlang der Oberkante des rechteckigen Bereichs der zu analysierenden Gelprobe und duplizieren Sie die Linie, um parallele Linien für den gesamten Probenbereich zu erstellen, wie gezeigt, unter Verwendung eines Zwischenlinienabstands von 300 bis 400 Mikrometern. Stellen Sie sicher, dass jeder Start- und Endpunkt jeder Linie richtig auf die Geloberfläche fokussiert ist, und klicken Sie auf Charge analysieren, um die Probensequenz auf dem Massenspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma zu starten.

Klicken Sie im Laserenergiefenster auf Emission, um den Laserkopf wieder aufzuladen. Klicken Sie auf Ausführen, um das Fenster zum Ausführen des Experiments zu öffnen und nur ausgewählte Muster auszuwählen. Stellen Sie die Auswaschverzögerung auf 20 bis 30 Sekunden ein.

Wählen Sie das Kontrollkästchen für aktivierte Laser während der Scans aus und stellen Sie die Aufwärmzeit des Lasers auf 10 Sekunden ein. Klicken Sie dann auf Ausführen und OK, um die Zeilenanalyse zu starten und die Rohsignalintensität in Zählungen pro Sekunde für jedes Isotop auf dem Massenspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma in Echtzeit zu überwachen. Jede Zeile sollte mit einem Gasrohling beginnen und enden.

Importieren Sie nach der Analyse die Rohdatendatei für jede ablierte Zeile in eine Tabelle. Die Rohdatentabelle zeigt die Massenspektrometrie-Messwerte des induktiv gekoppelten Plasmas für jedes Isotop in Zählungen pro Sekunde und die entsprechenden Zeitpunkte in Sekunden. Listen Sie alle Zeilen nebeneinander in verschiedenen Spalten auf.

Berechnen Sie einen durchschnittlichen Gasblindwert für jedes Isotop aus allen Gasblindwerten, die vor den Linienablationen aufgezeichnet wurden, und subtrahieren Sie den durchschnittlichen Gasblindwert von den entsprechenden Rohintensitäten für jedes Isotop, um das Hintergrundsignal zu korrigieren. Um die interne Normalisierung anzuwenden, dividieren Sie die gasblindkorrigierte Signalintensität jedes Isotops durch die gasblindkorrekturierte Signalintensität des internen Standardkohlenstoffs 13 für jeden Datenpunkt, um Schwankungen in der Menge des abgetragenen Materials und der instrumentellen Drift zu korrigieren. Schneiden Sie die Daten vor dem Anfang und nach dem Ende jeder ablierten Zeile ab, um das Hintergrundsignal der Gasleere zu entfernen, und transponieren Sie die Datentabelle, um eine Rastermatrix zu erhalten, in der jede Zeile einer ablierten Zeile und jede Spalte einem normierten Isotopenintensitätswert entspricht.

Wenden Sie dann die aus der Analyse der Gelstandards erhaltene Kalibrierfunktion an und speichern Sie die kalibrierte Datenmatrix als Textdatei. Um ein Bild zu erzeugen, importieren Sie die kalibrierte Probendatenmatrix als Textbild in die Bildanalysesoftware und wenden Sie den Korrekturfaktor für das Seitenverhältnis und eine Nachschlagetabelle an, um die chemischen Gradienten im gelösten Bild zu visualisieren. Passen Sie die Farbbalance des Bildes an, um die unteren und oberen Grenzen des Anzeigebereichs zu steuern, fügen Sie eine Kalibrierungsleiste hinzu und speichern Sie das gelöste Bild als TIF-Datei.

Verwenden Sie den Befehl "In System kopieren", um das Volumenbild zu kopieren und in eine Desktop-Publishing-Software einzufügen. Skalieren Sie dann den Abgleich, richten Sie es aus und komponieren Sie das Vollbild mit einem Foto des interessierenden Bereichs und der anderen gelösten Bilder. Der Abgleich der Bilder der gelösten Stoffe mit einem fotografischen Bild der interessierenden Region zeigt, dass die 2D-Feststoffflussverteilung verschiedener Elemente im Submillimeterbereich je nach Bodenstruktur und Wurzelmorphologie sehr variabel ist.

In dieser Analyse einer jungen Buchweizenwurzel, die in karbonatfreiem Boden angebaut und mit Ammoniumnitrat gedüngt wurde, zeigte die Verteilung gelöster Stoffe im Submillimeterbereich Zonen mit verminderten Aluminium-, Phosphor- und Eisenflüssen neben älteren Wurzelabschnitten aufgrund der Wurzelaufnahme und stark erhöhte Magnesium-, Aluminium-, Phosphor-, Mangan- und Eisenflüsse an der Wurzelspitze aufgrund lokaler Nährstoffmobilisierungsprozesse. In dieser Analyse kann ein deutlicher Abbau von Zink, Cadmium und Blei an der unmittelbaren Wurzelposition beobachtet werden, was zeigt, dass die Wurzeln der metalltoleranten Weidenart Salix smithiana als lokalisierte Senke für labile Spurenmetalle in kontaminierten Böden wirken. In dieser Analyse wurde die Verteilung von labilen Spurenmetallen entlang der Wurzeln von Salix smithiana mit der Verteilung des pH-Werts unter Verwendung eines kombinierten einschichtigen planaren Optode-DGT-Kationenbindungsgels kolokalisiert.

Diese Methodenkombination zeigte, dass erhöhte Flüsse gelöster Stoffe von Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer und Blei mit einer pH-Absenkung um etwa eine Einheit verbunden waren, was auf eine pH-induzierte Metallsolubilisierung hindeutet. Es ist wichtig, einen engen und stabilen Kontakt zwischen dem DGT-Werkzeug und der festen Oberfläche zu gewährleisten, um analytische Artefakte zu vermeiden. Wiederholen Sie im Zweifelsfall das Auftragen des Gels.

Diese Methode kann mit anderen diffusionsbasierten bildgebenden Verfahren kombiniert werden, wie z. B. planaren Optoden, um gleichzeitig eine Reihe von Parametern zu bewerten, die an der Aufnahme von Pflanzenelementen beteiligt sind.