Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Mausmodell für Mundkrebs zu erstellen, das die Visualisierung und Quantifizierung der Tumorinvasion in der Zunge ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst orale Plattenepithelkarzinomzellen für die Zwei-Photonen-Bildgebung durch lentivirale Infektion des Lebens Act M Kirsche und stabile klonale Selektion erzeugt werden. Als nächstes werden orthotope Xenotransplantattumoren in Nacktmäusen durch Injektion von mit Leben Act M markierten Zellen in die Zungen von anästhesierten Mäusen erzeugt.

Anschließend werden tumorhaltige Zungen mit Hilfe von zwei Photonenmikroskopien abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine quantifizierte lokale orale Tumorinvasion innerhalb des Zungenmuskels durch Zwei-Photonen-Bildgebung von frischem Zungengewebe und anschließende computergestützte dreidimensionale Rekonstruktion von Primärtumoren und regional befallenen Zellgruppen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie oder der biolumineszierenden Bildgebung besteht darin, dass die Invasion von Tumorzellen quantitativ in drei Dimensionen gemessen werden kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die therapeutische Intervention bei Mundkrebs, da sie ein Modellsystem für die Analyse von Proteinen bietet, die an der Tumorinvasion beteiligt sind, sowie für die Bewertung präklinischer Wirkstoffe auf anti-invasive therapeutische Strategien. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Injektion der Tumorzellen in die Zunge und die Vorbereitung der Zunge für die Zwei-Photomikroskopie technisch anspruchsvoll ist und Geschicklichkeit und Übung erfordert. Die Visualisierung dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Tumorinjektion in zwei Photonenschritten schwer zu erlernen ist und spezielle Fähigkeiten erfordert, um mit der Kultur zu beginnen.

Humane Kopf- und Halstumorzelllinien in Vollmedium, bestehend aus DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren. Um die LIFE Act M-Kirschbeschichtungssequenz in die PLL 7.0 lentivirale Vektorstelle zu übertragen, ist zunächst eine gerichtete Mutagenese erforderlich, um drei stille Mutationen in die SBF einzuführen, eine Erkennungsstelle in der Eltern-mCherry CD NA. Als nächstes wird die Modified Life Act mCherry-Sequenz mit flankierendem ECO R an einer SBF-Stelle amplifiziert und in die PLL 7.0 sub clentiert. Zur Erzeugung eines PLL 7.0 LIFE Act M Kirschkonstrukts nach einer lentiviralen Expressionssystemkultur wird die Verpackungszelllinie 2 9 3 T 17 bis 40% Konfluenz in vollständigem Medium verwendet.

Transfizieren Sie die Zellen mit Hilfe von Cal Foss mit den Vektoren PLL 7.0 LIFE Act Mcherry, PS, PACS, zwei und P-V-S-V-G in einem Verhältnis von drei bis zwei zu eins. Ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden durch ein frisches, vollständiges Medium, sammeln und füllen Sie das Medium 72 Stunden lang alle 12 Stunden auf und lagern Sie das gesammelte Medium bei vier Grad Celsius, um Kopf- und Halszelllinien mit stabiler Lebensdauer Act M Kirschexpression zu produzieren. Schleudern Sie das gesammelte Medium 10 Minuten lang bei 2000 U/min bei vier Grad Celsius, geben Sie einen Milliliter des geklärten Mediums, das das Virus enthält, für 12 Stunden in die OSC 19- oder US CCC one-Zellen.

Spülen Sie die Zellen und fügen Sie dann für einen weiteren Zeitraum von 12 Stunden einen weiteren Milliliter Virus hinzu. Kultivieren Sie die Zellen zwei Wochen lang in einem Medium, das 200 Milligramm pro Milliliter reines Mycin enthält. Um resistente Kolonien auszuwählen, überlebende Kolonien lebenslang visuell zu screenen. Akt m Kirschexpression durch Fluoreszenzmikroskopie Trypsin Augen, einzelne positive Kolonien mit sterilen drei Millimeter Klonierungsscheiben.

Bewahren Sie positive Zellen in einem Medium auf, das 200 Milligramm pro Milliliter reines Mycin enthält, bis sie zurückgefroren oder für die orthotope Injektion verwendet werden, um ein orthotopes Tumor-Xenotransplantat Trypsin Life Act. M Kirsche exprimierende Tumorzellen zu erhalten, zentrifugieren dann die Kultur und resuspendieren etwa 2,5 mal 10 zu den vierten Zellen in 50 Mikrolitern vollständigem Medium. Laden Sie die Tumorzellen in eine Ein-Milliliter-Spritze, die an einer 27-Gauge-Half-Inch-Nadel befestigt ist.

Als nächstes betäuben Sie, acht Wochen altes weibliches athymischen Fuchs. Eine Nacktmaus mit einer Kombination aus 80 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 10 Milligramm pro Kilogramm Xylazin. Sobald sich das Tier nicht mehr bewegt, tragen Sie Augenschmiersalbe auf und überprüfen Sie die Reaktionsfähigkeit, indem Sie einen Fingernagel in das Fußpolster drücken.

Halten Sie die Mäuse auf einem Heizkissen zwischen 37 und 40 Grad Celsius. Fassen Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig die Zungenspitze und ziehen Sie sie aus der Mundhöhle. Injizieren Sie die Zellen langsam in eine Seite jeder Zunge, um eine knollige Masse in der Zungenmitte zu erzeugen.

Injizieren Sie den Mäusen 2,1 Milligramm pro Kilogramm Yohi Wesen und geben Sie sie wieder auf das Heizkissen, um sie während der Genesung von der Narkose zu überwachen. Setzen Sie Mäuse in sterile Käfige, die ein weiches transgenes Teigfutter enthalten. Wiegen Sie die Mäuse alle zwei bis drei Tage und überwachen Sie sie visuell auf das Auftreten von Tumoren.

Um Mauszungen für die ex vivo-Bildgebung vorzubereiten, euthanasieren Sie Mäuse, die Tumore zu verschiedenen Zeitpunkten beherbergen. Mit Kohlendioxid-Inhalation die Zungen extrahieren und mit einem XPBS spülen. Dann mit monofilem Nähgarn aus einem örtlichen Hobbygeschäft und einer Nähnadel der Größe acht.

Befestigen Sie die Zunge an einer Seite einer herkömmlichen Einbettkassette für Paraffingewebe. Sobald die Zunge immobilisiert ist, tauchen Sie die gesamte Kassettenbaugruppe in ein XPBS. Bearbeiten Sie die Zungen sofort mit der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Zungen mit der Zwei-Photonen-Mikroskopie abzubilden.

Tauchen Sie die Zungenkassetten in eine 60-Millimeter-Schüssel, in der sich ein XPBS befindet. Befestigen Sie die Schale in einer speziell angefertigten Halterung an einem einziehbaren Auslegerarm, der unter dem Objektiv des Zwei-Photonen-Mikroskops positioniert ist. Platzieren Sie eine Wassertauchobjektivlinse mit einer numerischen Apertur von 40 x 0,8 direkt auf oder über einer sichtbaren Tumorläsion.

Abbildung der Zunge durch Zwei-Photonen-Mikroskopie mit dem Titan-Saphir-Laser mit einer Intensität von 60 Milliwatt und einer Eingangswellenlänge von 755 Nanometern. Um das M-Kirschsignal zu optimieren, erfassen Sie serielle Ein-Mikrometer-Laserscanning-Bilder in inkrementellen Tiefen von einem Mikrometer über eine Gesamtgewebetiefe zwischen 15 und 100 Mikrometern. Mit dieser Konfiguration können Tumore bis zu einer Gewebetiefe von einem Millimeter analysiert werden.

Verwenden Sie Bild scannen, um Bilder aufzunehmen. Das Scan-Bild erzeugt eine zweikanalige Ausgabe von Raster-Scan-Mustern zur Steuerung von XY-Galvan-Metric-Scan-Spiegeln und erfasst gleichzeitig einen Signaleingang von maximal vier Kanälen gleichzeitig von Photomultiplier-Röhren über eine Datenerfassungsplatine. Das Scan-Bild sammelt Z-Stapel-Bilder, indem es die Z-Achse des Objektivs steuert, und sammelt Zeitrafferbilder in einem Einzel- oder zyklischen Modus.

Speichern Sie die Bilder in einer einzigen TIF-Datei mit 16 Bit Tiefe. Mit der Amira-Software können Sie Tumorbildstapel in ein einzelnes dreidimensionales Bild rendern, indem Sie die TIF-Datei öffnen, die den Satz von Zs-Stapelbildern enthält. Verwenden Sie die TEX-Funktion, um ein dreidimensionales Rendering zu erzeugen.

Ein großes Primärtumorbild mit mehreren kleineren dissoziierten invasiven Gruppen oder Igs wird wahrscheinlich auf dem gerenderten Bild vorhanden sein. Um das Tumorvolumen zu messen, definieren Sie den Schwellenwert für die Primärtumorfläche und jede Schicht des Bildstapels, um die Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren und zu eliminieren. Wiederholen Sie das Schwellenwertverfahren für jede invasive Gruppe.

Sobald der Primärtumor und alle igs ausgewählt sind, bestimmen Sie die Volumenmessung sowie die X-, Y- und Z-Tumor-OID-Koordinaten für den Primärtumor. Um die Abstände der igs vom zentralen Tumorpunkt zu berechnen, berechnen Sie den tumorinvasiven Index oder ti unter Verwendung des ti gleich N NT mal VT mal dt. Dabei ist NT gleich der Gesamtzahl der igs im Bild, VT gleich dem Gesamtvolumen aller igs und DT gleich der Gesamtstrecke, die alle invasiven Gruppen vom Zentrum des Primärtumors zurückgelegt haben.

Dreidimensionale Renderings mit größeren topografischen Details können erstellt werden, indem die originalen 16-Bit-Monochrom-Spitzendateien in Nikon NIS-Elemente innerhalb der Software importiert werden. Erstellen Sie eine ND-Datei aus einem Image-Stack. Kalibrieren Sie dann das Dokument manuell, um die Pixelgröße für Renderings mit höherer Qualität anzugeben.

Fügen Sie zusätzliche Segmente in der Z-Ebene hinzu. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Rohdaten, die von einem Zwei-Photonen-Bild-NIS-Element oder einem Spiegel erfasst wurden. Mit Hilfe von Software können die Rohdaten von Zungentumoren rekonstruiert werden, was in dieser Abbildung dargestellt ist.

Dieses Panel zeigt ein Beispiel für das dreidimensionale Rendering mit der TEX-Funktion in der Amira-Software. Hier ist ein Beispiel für die Schwellenwertbestimmung eines einzelnen Zwei-Photonen-Schnitts aus dem Bildstapel, um invasive Gruppen aus dem Primärtumor sowie dem Primärtumorzentrum oder -oid zu identifizieren. Nachdem jeder Schwellenwertabschnitt analysiert wurde, quantifiziert Amira das Volumen und die Entfernung, die jede invasive Gruppe vom Centro zurückgelegt hat.

Diese Daten können grafisch dargestellt und verwendet werden, um den numerischen Wert für das gesamte Ausmaß der Tumorzellinvasion zu erhalten. Zu der hier gezeigten primären Stelle sind repräsentative Bilder von Tumoren, wie sie durch konventionelle pathologische immunhistochemische Markierung visualisiert werden, verglichen mit einem dreidimensionalen Bild eines ähnlichen Tumors unter Verwendung des beschriebenen Protokolls. Einmal vom Punkt der Zungenextraktion bis zum endgültigen 3D-Rendering gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie während des Versuchs dieses Verfahrens richtig durchgeführt wird. Achten Sie darauf, dass Sie die Zunge nicht mit der Nadel durchstechen, wodurch Tumorzellen verloren gehen und die Tumorentnahme behindert wird. Es können therapeutische Verbindungen oder Zellen mit manipulierten Proteinspiegeln getestet werden, um ihre Wirksamkeit bei der Invasion von Mundkrebs zu bestimmen.

Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit injizierten Mäusen bei der Arbeit mit menschlichen Tumorzellen, die mit Lentiviren modifiziert wurden, gefährliche Vorsichtsmaßnahmen wie eine geeignete PSA und die Arbeit in einer BSL-zertifizierten Laminar-Flow-Haube mit zwei Zertifizierungen getroffen werden sollten.