Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mausmodell für Mundkrebs zu erstellen, das die Visualisierung und Quantifizierung der Tumorausbreitung in der Zunge ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst orale Plattenepithelkarzinomzellen für die Zweiphotonen-Bildgebung erzeugt werden, indem sie mittels Lentivirus mit Life Act mCherry infiziert und stabile, geklonte Zelllinien ausgewählt werden. Anschließend werden orthotopische Xenotransplantate bei Nacktmäusen erzeugt, indem Life-Act-mCherry-markierte Zellen in die Zunge anästhesierter Mäuse injiziert werden.

Anschließend werden Tumoren enthaltende Zungen mittels Zweiphotonen-Mikroskopie abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die quantifizierte lokale orale Tumorausbreitung innerhalb des Zungenmuskels durch die Zweiphotonen-Bildgebung von frischem Zungengewebe und anschließende computergestützte dreidimensionale Rekonstruktion der Primärtumoren sowie regional befallener Zellverbände zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie oder der biolumineszenten Bildgebung besteht darin, dass die Invasion tumoröser Zellen dreidimensional quantitativ gemessen werden kann.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu therapeutischen Eingriffen beim Mundhöhlenkrebs, da sie ein Modellsystem für die Analyse von Proteinen liefert, die an der Tumorausbreitung beteiligt sind, sowie für die Bewertung präklinischer Wirkstoffe hinsichtlich antiinvasiver Therapiestrategien. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da die Injektion der Tumorzellen in die Zunge und die Vorbereitung der Zunge für die Zweiphotonenmikroskopie technisch anspruchsvoll ist und Geschicklichkeit sowie Übung erfordert. Die Visualisierung dieser Methode ist entscheidend, da das Einbringen des Tumors in den Zweiphotonen-Schritten schwer zu erlernen ist und spezielle Fähigkeiten voraussetzt, um die Kultur zu beginnen.

Menschliche Kopf- und Hals-Tumorzelllinien in komplettem Medium, bestehend aus DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % nicht essentiellen Aminosäuren. Um die LIFE-Act-mCherry-Sequenz in den lentiviralen Vektor PLL 7.0 einzubringen, ist zunächst eine standortgerichtete Mutagenese erforderlich, um drei stille Mutationen in der SBF1-Erkennungsstelle der ursprünglichen mCherry-cDNA einzuführen. Anschließend die modifizierte LIFE-Act-mCherry-Sequenz mittels PCR mit flankierenden EcoR1- und SBF1-Stellen amplifizieren und in den PLL 7.0 subklonieren. Um einen PLL 7.0-LIFE-Act-mCherry-Konstrukt gemäß einem lentiviralen Expressionssystem zu erzeugen, die Verpackungszelllinie 293T17 auf 40 % Konfluenz in komplettem Medium kultivieren.

Transfizieren Sie die Zellen mit den Vektoren PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS zwei und P-V-S-V-G im Verhältnis drei zu zwei zu eins unter Verwendung von Cal Foss. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Medium durch frisches, komplettes Medium, sammeln und ergänzen Sie das Medium alle 12 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden und lagern Sie das gesammelte Medium bei vier Grad Celsius, um Kopf-Hals-Zelllinien mit stabiler LIFE Act M cherry-Expression zu erzeugen. Zentrifugieren Sie das gesammelte Medium 10 Minuten bei 2000 U/min und vier Grad Celsius, geben Sie ein Milliliter des geklärten Mediums, das das Virus enthält, zu den OSC 19- oder US CCC eins-Zellen hinzu und inkubieren Sie 12 Stunden lang.

Spülen Sie die Zellen und geben Sie anschließend ein zusätzliches Milliliter Virus für einen weiteren Zeitraum von 12 Stunden hinzu. Kultivieren Sie die Zellen zwei Wochen lang in Medium, das 200 Milligramm pro Milliliter Puromycin enthält, um resistente Kolonien auszuwählen. Überprüfen Sie visuell die überlebenden Kolonien auf Lebensfähigkeit. Analysieren Sie die mCherry-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie und lösen Sie einzelne positive Kolonien mit sterilen dreimillimetergroßen Klonierungsscheiben ab.

Die positiven Zellen in Medium mit 200 Milligramm pro Milliliter Puromycin kultivieren, bis sie eingefroren werden oder für die orthotopische Injektion zur Erzeugung eines orthotopen Tumor-Xenotransplantats verwendet werden. Trypsin-Life Act M-cherry-exprimierende Tumorzellen anschließend zentrifugieren und etwa 2,5 × 10⁴ Zellen in 50 Mikroliter komplettem Medium resuspendieren. Die Tumorzellen in eine 1-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-½-Zoll-Nadel verbunden ist, aufziehen.

Betäuben Sie anschließend eine acht Wochen alte weibliche athymische Fox. One Nude-Maus mit einer Kombination aus 80 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 10 Milligramm pro Kilogramm Xylazin. Sobald sich das Tier nicht mehr bewegt, tragen Sie einen Augenschmiermittel-Öl auf und überprüfen die Reaktionsfähigkeit, indem Sie einen Fingernagel in die Fußsohle drücken.

Halten Sie die Mäuse auf einer Heizplatte zwischen 37 und 40 Grad Celsius. Greifen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig die Zungenspitze und ziehen Sie sie aus der Mundhöhle heraus. Injizieren Sie langsam die Zellen in eine Seite jeder Zunge, um eine knotige Masse in der Zungenmitte zu erzeugen.

Injizieren Sie die Mäuse mit 2,1 Milligramm pro Kilogramm Yohi being und kehren Sie sie auf die Heizplatte zurück, um sie während der Erholung von der Anästhesie zu überwachen. Stellen Sie die Mäuse in sterile Käfige, die eine weiche transgene Teigdiät enthalten. Wiegen Sie die Mäuse alle zwei bis drei Tage und überwachen Sie sie visuell auf Tumoreinsatz.

Um Mauszungen für die Bildgebung ex vivo vorzubereiten, euthanasieren Sie Mäuse mit Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten. Unter Verwendung von Kohlendioxid-Inhalation entnehmen Sie die Zungen und spülen sie mit einem XPBS ab. Verwenden Sie anschließend Monofile-Nähgarn aus einem örtlichen Bastelladen und eine Nähnadel der Größe acht.

Befestigen Sie die Zunge an einer Seite einer herkömmlichen Paraffin-Gewebekassette. Sobald die Zunge fixiert ist, tauchen Sie die gesamte Kassettenanordnung in ein XPBS. Verarbeiten Sie die Zungen unverzüglich mittels Zweiphotonen-Mikroskopie, um die Zungen mittels Zweiphotonen-Mikroskopie abzubilden.

Die Zungenkassetten in eine 60 mm-Dish mit einem XPBS tauchen. Die Dish in einer speziell angefertigten Halterung an einem versenkbaren Kragarm befestigen, der sich unterhalb des Objektivs des Zwei-Photonen-Mikroskops befindet. Ein 40x0,8-Objektiv mit Wasserimmersion direkt auf oder über eine sichtbare Tumorkrankheit platzieren.

Untersuchen Sie die Zunge mittels Zweiphotonen-Mikroskopie mit dem Titan-Saphir-Laser mit einer Intensität von 60 Milliwatt und einer Eingangswellenlänge von 755 Nanometern. Um das M-Cherry-Signal zu optimieren, sammeln Sie serielle eindimensionale Laser-Scanning-Bilder in jeweils ein Mikrometer inkrementellen Tiefen über eine gesamte Gewebetiefe zwischen 15 und 100 Mikrometern. Mit dieser Konfiguration können Tumore bis zu einer Gewebetiefe von einem Millimeter analysiert werden.

Verwenden Sie ScanImage, um Bilder aufzunehmen. ScanImage erzeugt eine zweikanalige Ausgabe von Raster-Scannmustern, um XY-Galvanospiegel zu steuern, und erfasst gleichzeitig maximal vier Kanäle an Signaleingängen von Photomultiplierröhren über eine Datenerfassungskarte. ScanImage sammelt Z-Stack-Bilder, indem es die Z-Achse des Objektivs steuert, und erfasst Zeitrafferbilder im Einzel- oder Zyklenmodus.

Speichern Sie die Bilder in einer einzelnen TIF-Datei mit 16-Bit-Tiefe. Rendern Sie mit der Amira-Software Tumor-Bildstapel in ein einzelnes dreidimensionales Bild, indem Sie die TIF-Datei öffnen, die den Satz der Z-Stapel-Bilder enthält. Verwenden Sie die TEX-Funktion, um eine dreidimensionale Darstellung zu erzeugen.

Im gerenderten Bild ist wahrscheinlich ein großes primäres Tumorbild mit mehreren kleineren, dissoziierten invasiven Gruppen oder IGS zu sehen. Um das Tumorvolumen zu messen, definieren Sie die Schwelle für den Bereich des primären Tumors und korrigieren Sie jede Schicht des Bildstapels, um die Hintergrundfluoreszenz zu eliminieren. Wiederholen Sie den Schwellenwertprozess für jede invasive Gruppe.

Wenn der Primärtumor und alle Igs ausgewählt wurden, bestimmen Sie die Volumenmessung sowie die X-, Y- und Z-Tumor-OID-Koordinaten für den Primärtumor. Um die Abstände der Igs vom zentralen Tumorpunkt zu berechnen, ermitteln Sie den tumorinvasiven Index oder TI mithilfe der Formel TI = N NT × VT × dt. Dabei entspricht NT der Gesamtanzahl der Igs im Bild, VT dem Gesamtvolumen aller Igs und DT der Gesamtstrecke, die alle invasiven Gruppen vom Zentrum des Primärtumors aus zurückgelegt haben.

Dreidimensionale Darstellungen mit höherer topographischer Auflösung können erstellt werden, indem die ursprünglichen 16-Bit-Graustufen-Spitzen-Dateien in die Software Nikon NIS-Elements importiert werden. Erstellen Sie eine ND-Datei aus einem Bildstapel. Kalibrieren Sie das Dokument anschließend manuell, um die Pixelgröße für qualitativ hochwertigere Darstellungen festzulegen.

Fügen Sie zusätzliche Schnitte in der Z-Ebene hinzu. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Rohdaten, die mittels einer Zwei-Photonen-Bildaufnahme mit NIS-Elementen oder einem Spiegel gewonnen wurden. Mit Hilfe einer Software können die Rohdaten von Zungentumoren rekonstruiert werden, wie in dieser Abbildung dargestellt.

Dieses Panel zeigt ein Beispiel der dreidimensionalen Darstellung mithilfe der TEX-Funktion in der Amira-Software. Hier sehen Sie ein Beispiel für die Schwellenwertanalyse einer einzelnen Zwei-Photonen-Schicht aus dem Bildstapel, um invasive Gruppen des primären Tumors sowie das Zentrum des primären Tumors oder Oids zu identifizieren. Nachdem jede Schicht mit Schwellenwertanalyse ausgewertet wurde, quantifiziert Amira das Volumen und die von jeder invasiven Gruppe zurückgelegte Distanz vom Centro.

Diese Daten können grafisch dargestellt und genutzt werden, um den numerischen Wert für das Ausmaß der Tumorzellinvasion zu ermitteln. A, das dem primären Ort zuzuschreiben ist, zeigt repräsentative Bilder von Tumoren, wie sie mittels konventioneller immunhistochemischer Färbung in der Pathologie visualisiert wurden, verglichen mit einem dreidimensionalen Bild eines ähnlichen Tumors unter Verwendung des beschriebenen Protokolls. Sobald die Methode vom Zeitpunkt der Zungenentnahme bis zur endgültigen 3D-Darstellung beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Zunge nicht mit der Nadel zu durchstechen, wodurch Tumorzellen verlorengehen und die Tumoransiedlung behindert werden könnte. Im Anschluss an dieses Verfahren können Tests mit therapeutischen Substanzen oder Zellen mit modulierten Proteinspiegeln durchgeführt werden, um deren Wirksamkeit bezüglich der oralen Krebsinvasion zu bestimmen.

Bei Arbeiten in einem In-vivo-Setting ist nicht zu vergessen, dass der Umgang mit humanen Tumorzellen, die mit Lentivirus modifiziert wurden, gefährlich ist; daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter PSA und die Arbeit in einem BSL-2-zertifizierten laminaren Flusswerk getroffen werden, wenn mit injizierten Mäusen gearbeitet wird.