Name: Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die Zweiphotonen-Mikroskopie zur quantitativen Analyse von Tumorinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung und Bewertung anti-invasiver Verbindungen.

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Unterstützt durch ein Teilprojekt des NIH P20 RR16440 und eine Brücke Zuschuss von der West Virginia University Office of Research und Graduate Education auf S. Weed. Technische Unterstützung von L. Lopez-Skinner in den frühen Phasen der Projektentwicklung wird dankbar anerkannt. Die Autoren sind auch dankbar für technische Hilfe und OSC19 Zellen von J. Myers und M. Younes (Department of Head and Neck Surgery, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner und K. Secrest (West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank) für die histologische Verarbeitung und Verfahren, R. Wysolmerski (West Virginia University, Department für Neurobiologie und Anatomie) für die LifeAct-mCherry konstruieren und J. Bär (University of North Carolina) für die pLL7.0 lentiviralen Vektor. Die Nutzung der West Virginia University Microscopy Imaging Facility (unterstützt durch NIH P20 RR16440 und Mary Babb Randolph Cancer Center) und seine nicht-lineare optische Mikroskopie-Labor (NLOM, unterstützt durch eine Zusammenarbeit zwischen der West Virginia University Center for Neuroscience und der West Virginia University Department of Physics / West Virginia Nanoscience Initiative) ist ebenfalls herzlich gedankt. Die NLOM wird zum Teil durch NIH P30 RR031155 dem Center for Neuroscience unterstützt.

1. Zell-Linien, Vector Bau und Lentivirale Produktion <ol><li> Menschlicher Kopf und Hals Tumorzellinien (OSC19 oder UMSCC1) wurden in komplettem Medium, bestehend aus DMEM (CellGro cat # 50-003-PB) ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum FBS (Hyclone cat # SH30070.03), 1% Penicillin / Streptomycin (CellGro cat # 30-002-CI) und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (CellGro cat # 25-025-CI). </li><li> Zur Übertragung der LifeAct-mCherry kodierende Sequenz in den pLL7.0 lentiviralen Vektors wurde das Sbf1 Erkennungsstelle in der übergeordneten mCherry cDNA durch die Einführung von drei stille Mutationen in der Erkennungssequenz mit Mutagenese (Stratagene cat # 200518-5) verändert. Die daraus resultierenden veränderten LifeAct-mCherry Sequenz wurde anschließend PCR mit flankierenden EcoR1/Sbf1 Seiten verstärkt und subkloniert in pLL7.0 die pLL7.0-LifeAct-mCherry Konstrukt zu erzeugen. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct-mCherry Virus Produktion <ol><li> Viral Produktion wurde nach dem Lentivirale Expression Systeme manuelle (System Bioscience Version 2-051018) durchgeführt. </li><li> Die Verpackungs-Zelllinie 293T/17 Zellen (ATCC cat # CRL-11268) wurde auf 40% Konfluenz in der gleichen komplette Medien für HNSCC Linien verwendet gewachsen. </li><li> Die Zellen wurden mit dem pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 und pVSV-G-Vektoren in einem Verhältnis transfizierten 03.02.01, jeweils unter Verwendung CalPhos (Clontech cat # 631312). </li><li> Nach 24 Stunden war die erste Medien aus der Transfektion mit frischem Medium ersetzt. </li><li> Medien wurde dann gesammelt und alle 12 Stunden erneuert für 72 Stunden und bei 4 ° C. </li></ol> 3. Produktion von Kopf-Hals-Zelllinie mit stabilen LifeAct-mCherry Expression <ol><li> Die gesammelten Medien wurden bei 2000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C abzentrifugiert </li><li> Ein ml geklärt Medien mit Virus wurde direkt an OSC19 oder UMSCC1 Zellen für 12 Stunden aufgenommen. Die Zellen wurden dann gewaschen, und um einen zusätzlichen ml Virus wurde für weitere 12 Stunden aufgenommen. </li><li> Die Zellen wurden mit Medium mit 200mg/ml Puromycin für zwei Wochen nach resistenten Kolonien wählen behandelt. </li><li> Surviving Klone wurden visuell auf LifeAct-mCherry Ausdruck durch Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Individuelle positive Kolonien wurden typsinized mit sterilen 3mm Klonen Discs (Fisher cat # 0790710A). </li><li> Positive Zellen wurden in Medium mit 200mg/ml Puromycin bis zurück oder gefroren verwendet für orthotoper Injektion erhalten. </li></ol> 4. Orthotopen Tumor Xenograft Formation <ol><li> Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll (09-0821) von der West Virginia University Animal Care und Verwenden Ausschusses zugelassen wurden. </li><li> LifeAct-mCherry exprimierenden Tumorzellen wurden trypsiniert, zentrifugiert und 2,5 x 10 4 Zellen wurden in 50 ul komplette Medien resuspendiert. </li><li> Tumorzellen wurden in einem ml Spritze an einem 27 ½-Gauge-Nadel geladen. </li><li> Weibliche athymischen Fox1 nu / nu Mäusen Alter von 8 Wochen (Harlan Laboratories) wurden betäubt mit einer Kombination von 80mg/kg Ketamin und Xylazin 10mg/kg. Narkotisierten Mäusen wurden zwischen 37-40 ° C auf einem Heizkissen aufrechterhalten. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette wurde die Spitze der Zunge sanft gegriffen und vorsichtig aus der Mundhöhle gezogen. </li><li> Die Zellen wurden langsam in eine Seite jeder Zunge injiziert, um eine bauchige Masse in die Zunge Zentrum zu schaffen, die Vermeidung der lingualen Arterien. </li><li> Die Mäuse wurden mit 2.1mg/kg Yohimbin injiziert und kehrte in die Heizkissen, wo sie für 2-3 Stunden, während aus der Narkose überwacht wurden. </li><li> Einmal wiederbelebt wurden die Mäuse in sterile Käfige mit einem weichen Teig transgenen Ernährung (BioServe cat # S3472) platziert. </li><li> Die Mäuse wurden gewogen alle 2-3 Tage und optisch für die Tumor-Entstehung überwacht. </li></ol> 5. Vorbereitung der Maus Tongues für Ex-vivo Imaging <ol><li> Mäuse beherbergen Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten (in der Regel 2-4 Wochen nach der Injektion) wurden von Kohlendioxid Einatmen eingeschläfert. </li><li> Tongues extrahiert wurden, gespült mit 1X PBS und an einer Seite eines konventionellen Paraffin Gewebe eingebettet Kassette (StatLab Cat # H104,) mit Monofilament Nähfaden aus einer lokalen Hobby-Shop und eine Größe 8 Nähnadel. </li><li> Sobald die Zungen immobilisiert wurden, wurde die gesamte Kassette Montage in einem 30 mm Gewebe-Kulturschale platziert und eingebettet in 1X PBS. </li><li> Verarbeitete Zungen wurden sofort für zwei-Photonen-Anregung Mikroskopie. </li></ol> 6. Imaging of Tongue Tumoren mit Zwei-Photonen-Mikroskopie <ol><li> Tongue Kassetten wurden in einer 60mm Schale mit 1X PBS in einer speziell entworfenen Halterung auf einem ausfahrbaren Ausleger (Chamber Shuttle, Siskiyou Instrumente) unter dem Ziel einer aufrechten Mikroskop (; Sutter Instruments Moveable Microscope (MOM)) positioniert gesichert getaucht. </li><li> Ein 40X/0.8NA Wasser getaucht Objektiv wurde direkt auf oder über sichtbar tum gelegtoder Läsionen. Saphir-Laser (Mira, Coherent) Intensität bei 60 mW und Input Wellenlänge von 755 nm auf die mCherry Signal zu optimieren: Tongues wurden durch Zwei-Photonen-Mikroskopie mit dem Ti abgebildet. </li><li> Serielle 1mm Laser-Scanning-Bilder wurden bei 1 um inkrementelle Tiefen über insgesamt Gewebe Tiefe zwischen 15 und 100 um (je nach Tumor-Volumen) gesammelt. Die Bilder wurden aufgenommen mit scanimage, ein Open-Source-Programm auf der MATLAB-Plattform, die durch die Karel Svoboda Labor (Janelia Farms, HHMI) entwickelt wurde. Scanimage erzeugt eine Zwei-Kanal-Ausgabe von Raster-Scan-Muster auf die x / y galvanometrische Scanspiegel Kontrolle und zur gleichen Zeit erfasst maximal Vier-Kanal-Eingang gleichzeitig von Photomultipliern (PMT) durch eine Messkarte (PCI-6610S , National Instruments). Die PMT-Signale werden durch rauscharme Vorverstärker aktuellen (SR570, Stanford Research System) vor dem Einspeisen in die NI-DAQ-Karte für die Anzeige auf dem Bildschirm verstärkt. Scanimage sammelt z-Stapel-Bildern durch die Steuerung der z-Achse des Objektivs und sammelt Zeitraffer-Bilder in einem Einzel-oder Cycle-Modus. Die Bilder wurden in einer einzigen TIFF-Datei mit 16-Bit-Farbtiefe gespeichert. </li></ol> 7. Bildanalyse mit Amira Software <ol><li> Amira Bildgebung für die Tumor-Quantifizierung: In Aimra Software, öffnen Sie das TIFF-Datei mit dem Satz von Z-Stapel-Bildern. </li><li> Markieren Sie den Dateinamen ein, wählen und anwenden Voltex Funktion, um eine dreidimensionale Darstellung zu erzeugen. Ein großer Primärtumor Bild mit mehreren kleineren, distanzierte invasive Gruppen (IG) kollektiv befallenen Zellen ist in der Regel deutlich im gerenderten Bild (siehe Abbildung 6A). </li><li> Zur Auswahl der primären Tumormasse, wählen Sie "Open Data", dann "Labeling", dann "Label Field". </li><li> Thresholding der Primärtumor-select all z-Stapel-Bildern und blättern Sie durch die Bilder in der z-Ebene zur Förderung der Integration nur die primären Tumormasse in drei Dimensionen zu gewährleisten. Dies ist normalerweise der größte großes Bild in das Feld und erscheint oft segmentiert wie das abgebildete durch die z-Ebene durchlaufen wird. </li><li> Verwenden Sie den Zauberstab / Schwellenwert-Funktion, um die Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren und zu beseitigen es aus dem Bild ohne Verwerfen eines der Tumor-Signal. Markieren Sie die "Inside File"-Label und klicken Sie auf die Schaltfläche ⊕. Wählen Sie das "Alle Slices" das Kontrollkästchen. Dies erzeugt einen farbigen Rahmen um den Schwellenwert Primärtumor Bereich in jeder z-Stack zu erhöhen. </li><li> Zur Auswahl IGS, wählen Sie die Funktion "Neu". Wählen Sie einen einzelnen IG und sicherzustellen, dass es nicht mit dem primären Tumor durch Scrollen durch die z-Ebene verbunden. </li><li> Wählen Sie "Alle Slices" und klicken Sie auf die Schaltfläche ⊕. Benennen Sie die Datei (ex: IG 1) </li><li> Wiederholen Sie den Schwellenwert Verfahren in 7,4 und die Hervorhebung Schritt in 7,5 für die ermittelten IG. Wählen Sie eine Übersicht farblich als die Farbe verwendet, um den primären Tumor zu bezeichnen. </li><li> Bei Bedarf wiederholen, für jede weitere IG gesamten Bild-, Scan durch die z-Ebene, um sicherzustellen, dass alle IG bezeichnet werden. Mit verschiedenen Farben für jede identifizierte IG Hilfsmittel in Zukunft Identifikation auf das Bild. </li><li> Sobald der primäre Tumor und alle IG ausgewählt sind, wählen Sie "Segmentation" aus dem Pulldown-Menü, und wählen Sie dann "Material Statistics". Dies bietet die Volumen-Messung sowie die X-, Y-und X Tumor Kern-Koordinaten für den Primärtumor, um Entfernungen von IG von der zentralen Tumor Punkt zu berechnen. </li><li> Mit den Bänden berechnet die Entfernung für jede IG aus dem zentralen Kern des Primärtumors. Wählen Sie "Segmentation", dann "Material Statistics". Dieser Schritt berechnet alle Messungen in Pixel. Convert Pixel Mikrometer auf die Kalibrierung des Mikroskop-Objektivs und alle weiteren Anstieg der Vergrößerung (dh, Zoom-Funktionen) basieren. Für das Mikroskop und Einstellungen in diesen Experimenten verwendet wurde, wurde der 40X-Objektiv ohne Zoom verwendet, was eine Kalibrierung von 1 Pixel = 0,298 um. Importieren von Daten in eine Excel-Tabelle, welche Parameter gibt für den Primärtumor in drei Dimensionen (X1, Y1, Z1) und für jede IG (ex: X2, Y2, Z2 zum ersten IG). </li><li> Die befallenen Abstand in Mikrometer für jede IG von der Mitte des Primärtumors wird nach folgender Formel berechnet √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2). </li><li> Der Tumor invasive Index (T I) wird mit folgender Formel berechnet T I = N T x V x T D T, wobei T = N die Gesamtzahl der IGS in das Bild, V T = Gesamtvolumen aller IGS, D T = insgesamt zurückgelegte Strecke aller invasiven Gruppen aus der Mitte des Primärtumors. </li></ol> 8. Dreidimensionale Darstellungen mit Nikon NIS-Elements Software <ol><li> Dreidimensionale Darstellungen mit einer größeren topografischen Details können durch den Import der ursprünglichen 16-Bit-Monochrom-TIFF-Dateien des gesamten Tumors Bild in das Nikon NIS-Elements-Software erzeugt werdenPaket (Nikon, Melville, NY). Wählen Sie "Datei" und dann "ND", dann "Create ND Datei aus Datei Sequence". Wählen Sie das TIFF z-Serie Bildstapel und geben Sie den entsprechenden Schritt Größe. </li><li> Kalibrieren Sie den ND-Dokument in der xy-Ebene. Geben Sie die Größe eines Pixels mit einer manuellen Kalibrierung. </li><li> Wählen Sie den "Volume View". Verwenden Sie das "HQ"-Funktion, um zusätzliche Schnitte in der z-Ebene für eine höhere Qualität zu berechnen. In der "3D-Renderer-Einstellungen", verwenden Sie den "Advanced Renderer" mit einer Qualität von "Ultra High Details" und "Full Resolution". Wählen Sie "Alpha Blending" zu akzentuieren den Tumor Oberflächen. </li><li> Optimieren Sie die dreidimensionale Grafik für eine Präsentation. Zoom in auf den Tumor und die damit verbundenen IGS und Ernte nach Bedarf. Drehen Sie das Bild in der xyz Flugzeuge und stellen Sie die LUTs. </li><li> Nehmen Sie das Bild für die Präsentation. Wählen Sie "Bearbeiten-Ansicht erstellen Snapshot (8 bit RGB)". Benennen und speichern Sie Datei entsprechend. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Insgesamt schematische Darstellung, wichtige Schritte in orthotopen Zunge Tumor Produktions-und in situ Zwei-Photonen-Imaging. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Injektion von LifeAct-mCherry Ausdruck OSC19 Zellen in der Maus Zunge. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 resezierten Tumor-haltigen Maus Zunge für Zwei-Photonen-Imaging erstellt. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Orientierung eines Tumor-mit der Zunge in Position auf einer Zwei-Photonen-Mikroskopie bereit für die Bildgebung. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Representative Bildschirm aus scanimage demonstrieren Rohdaten Erwerb der anfänglichen Zwei-Photonen-Bild geschossen. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Bildanalyse und Quantifizierung der Tumorinvasion in einem orthotopen OSC19 Tumor. Vertreter Screenshot Bilder von Amira Voltex Rendering (A) und einem Schwellenwert z-Bereich (B) mit dem primären Primärtumor in lila, invasive Gruppe 1 (IG-1) in blau umrandete umrissen, IG-2 in rot und IG skizzierten -3 in grün als ein Beispiel für die Identifizierung Verfahren skizziert. Pfeilspitzen bezeichnen IGs in (A) und (B). C. Grundstücke des Volumens im Vergleich zu überfallen Abstand für acht einzelne IG verwendet, um die Tumorinvasion (TI) zu berechnen. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Repräsentative Bilder von Tumoren und drangen Tumor Gruppen aus diesem Protokoll im Vergleich mit Bildern aus einer konventionellen IHC-Ansatz. A. Paraffin Abschnitt einer ganzen Maus Zunge enthaltend ein UMSCC1 orthotopen Tumor. Immunhistochemische Färbung wurde durchgeführt unter Verwendung herkömmlicher Verfahren mit einem primären Antikörper gegen die HNSCC-spezifischen Zell-Marker EMMPRIN (Zymed; cat # 34-5600) bei 1:1000 Verdünnung und visualisiert mit Hilfe der OmniMap DAB anti-Rb-Nachweis-Kit (Ventana Kat. Nr. 760 -149), gefolgt von Eisenhämatoxylin Färbung. Bilder umfasst die gesamte Zunge Bereich wurden einzeln mit 4x Vergrößerung auf einem Olympus ZX70 Provis Mikroskop mit einem Optronics Microfire CCD-Kamera erfasst und rekonstruiert mit dem StereoINvestigator Imaging-Paket (MBF Bioscience). Der Tumor ist an der Zungenspitze evident. Eine vergrößerte Region zeigt der invasiven Front und individuelle Tumorzelle Gruppen (Pfeilspitzen) ist in (B). C. Nikon NIS-Elements-Rendering eines Vertreters OSC19 Tumor gezeigt. Verbesserte Kontur Detail und eine klare Darstellung der IGS (Pfeilspitzen) ist evident. Bars in allen Bildern = 100 um.

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</ol>

Orthotopen Mausmodell haben sich für das Studium viele Aspekte der Kopf-und Halstumoren 1,2 nützlich. Wir haben ein gut etabliertes System der orthotopen SCOT 3 mit Zwei-Photonen-Mikroskopie von mCherry-markierten Zellen als System bis in die frühen Ereignisse des Kopfes und Halses Tumorzellinvasion Studie zusammengefasst. In diesem Verfahren haben wir festgestellt, dass Zellen können von der Website des Tumorinjektion Leck, vor allem bei Mäusen sechs Wochen oder jünger aufgrund unzureichender Zunge Größe. Wir verwenden älteren Mäusen, um dieses Problem zu vermeiden. Je größer der Zunge Größe mit älteren Mäusen hilft auch bei der Vermeidung von Bruch einer Arteria lingualis und übermäßige Blutungen aus der Zunge. Tumor zu nehmen, wird entscheidend gestärkt, wenn die Zunge schwillt dramatisch an der Stelle der ersten Injektion. Diese Schwellung innerhalb von 1-2 Stunden, da die injizierte Flüssigkeit aufgesogen ist. Das Tumorwachstum scheint evident 1-2 Wochen nach der Injektion mit dem angegebenen injiziert Zellzahl wie eine kleine weiße Beule auf der Zungenoberfläche. Wir stellen ferner fest, dass bei der 40X-Objektiv in unserem hier vorgestellten Studien verwendet werden, können wir nicht unterscheiden, einzelne Tumorzellen aber IGs als invasive Zellhaufen, dass die typische Form der HNSCC Invasion rekapitulieren zu identifizieren. Bis heute hat dieses Modell wurde ausgiebig zum Testen der Rolle von spezifischen Molekülen sowie mehrere Anti-Tumor-Medikamente auf SCOT Wachstum einer Invasion, mit der Wirksamkeit von zervikalen Lymphknotenmetastasen überwacht mittels IHC-oder Biolumineszenz-Verfahren 4-7 gemessen werden. Tumoren in diesem System manifestieren in der Nähe der Zungenoberfläche (Abbildung 7) gebildet, so dass die Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie Bild gesamten Tumoren in situ als invasive mehrzelligen Cluster. Das Verfahren kann auch genutzt werden, um Tumorinvasion mit zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde bereits genutzt, um experimentelle Behandlungen für Kopf-und Hals-Krebs in orthotopen 8,9 und 8,10 Xenograft-Modellen zu studieren. Es gibt jedoch zwei wesentliche Unterschiede zwischen diesen Berichten und unser Protokoll. Erstens verwenden diese Studien extrazellulären Etiketten zum Ziel / identify Kopf und Hals Tumorzellen, möglicherweise begrenzen Erkennung nur auf Tumorzellen mit reichlich Zugang zu den Umlauf. Zweitens Invasion von Tumorzellen in der Nähe der primären Standort, die wahrscheinlich rekapituliert frühen metastatischen Aktivität nicht als eine experimentelle Parameter beurteilt. Unser Protokoll bietet die Möglichkeit, direkt zu quantifizieren Tumorzellinvasion zu irgendeinem Zeitpunkt während der Tumorprogression in Maus Zungen. Während die hier beschriebene Methode beschreibt das Verfahren, mit seziert Zungen sind wir derzeit in den Prozess der Anpassung dieser Methode an image Tumorinvasion in lebenden Mäusen für den Einsatz in Kombination mit Biolumineszenz gleichzeitig überwachen frühen Invasion lokalen Lymphknotenbefall und Fernmetastasen in der dasselbe Tier. Änderungen des Protokolls für in-vivo-Bildgebung erfordern eine angemessene Bühne für die Positionierung der Gestaltung und Pflege von Mäusen während der Bildgebung, sowie ein praktisches System, um richtig zu bewässern die Mundhöhle von narkotisierten Mäusen während der bildgebenden Verfahren. Einmal optimiert, so werden diese Anpassungen bieten die Möglichkeit, die Rolle des potenziellen Pro-invasive Moleküle und die Prüfung anti-invasive Verbindungen auf lokaler Invasion und Fernmetastasen Beteiligung an Tieren über einen längeren Zeitraum zu untersuchen.

multi-photonen-imaging der tumorzellinvasion in einem orthotopen mausmodell des oralen plattenepithelkarzinoms

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regionale Invasion von Kopf-Hals-Krebs ist es, metastasiertem Risiko verbunden und stellt eine schwierige Herausforderung in der Gestaltung und Umsetzung Patienten-Management-Strategien. Orthotopen Mausmodell von Mundkrebs wurden entwickelt, um die Untersuchung der Faktoren, die Erleichterung der Auswirkungen Invasion und dienen als Modellsystem für die Beurteilung Anti-Tumor-Therapeutika. In diesen Systemen wurde die Visualisierung von disseminierten Tumorzellen im Mundraum Gewebe in der Regel entweder durch konventionelle Histologie oder mit in vivo Biolumineszenz Methoden durchgeführt worden. Ein Hauptnachteil dieser Techniken ist die inhärente Unfähigkeit, genau zu visualisieren und zu quantifizieren frühen Tumorzellinvasion aus dem primären Standort in drei Dimensionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das ein etabliertes Modell für Plattenepithelkarzinom der Zunge (SCOT) mit Zwei-Photonen-Imaging zu Multi-Vektor-Visualisierung von mehrsprachigen Tumorausbreitung ermöglichen verbindet. Die OSC-19 Kopf-Hals-Tumor-Zelllinie wurde stabil entwickelt, um die F-Aktin-bindende Peptid LifeAct fusioniert mit dem mCherry fluoreszierende Protein (LifeAct-mCherry) auszudrücken. Fox1 nu / nu-Mäuse mit diesen Zellen injiziert zuverlässig Tumoren bilden, dass die Zunge sichtbar gemacht werden durch ex-vivo Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglichen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung orthotopen der Tumormasse und lokal eindringenden Zellen in ausgeschnittenen Zungen ohne Unterbrechung der regionalen Tumor-Mikroumgebung. Darüber hinaus ermöglicht dieses System für die Quantifizierung von Tumorzellinvasion durch Berechnung Entfernungen, die Zellen bewegen sich vom Primärtumor Ort eingedrungen. Insgesamt ist dieses Verfahren bietet eine erweiterte Modellsystem zur Analyse der Faktoren, die zu SCOT Invasion und therapeutische Behandlungen zugeschnitten auf lokaler Invasion und fernen Metastasierung zu verhindern beitragen. Auch diese Methode hat das Potenzial, um letztendlich mit anderen bildgebenden Verfahren in einem In-vivo-Einstellung kombiniert werden.

Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Die lokoregionäre Invasion von Kopf-Hals-Tumoren ist mit einem Metastasierungsrisiko verbunden und stellt eine schwierige Herausforderung bei der Planung und Umsetzung von Patienten...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mausmodell für Mundkrebs zu erstellen, das die Visualisierung und Quantifizierung der Tumorausbreitung in der Zunge ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst orale Plattenepithelkarzinomzellen für die Zweiphotonen-Bildgebung erzeugt werden, indem sie mittels Lentivirus mit Life Act mCherry infiziert und stabile, geklonte Zelllinien ausgewählt werden. Anschließend werden orthotopische Xenotransplantate bei Nacktmäusen erzeugt, indem Life-Act-mCherry-markierte Zellen in die Zunge anästhesierter Mäuse injiziert werden.Anschließend werden Tumoren enthaltende Zungen mittels Zweiphotonen-Mikroskopie abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die quantifizierte lokale orale Tumorausbreitung innerhalb des Zungenmuskels durch die Zweiphotonen-Bildgebung von frischem Zungengewebe und anschließende computergestützte dreidimensionale Rekonstruktion der Primärtumoren sowie regional befallener Zellverbände zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie oder der biolumineszenten Bildgebung besteht darin, dass die Invasion tumoröser Zellen dreidimensional quantitativ gemessen werden kann.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu therapeutischen Eingriffen beim Mundhöhlenkrebs, da sie ein Modellsystem für die Analyse von Proteinen liefert, die an der Tumorausbreitung beteiligt sind, sowie für die Bewertung präklinischer Wirkstoffe hinsichtlich antiinvasiver Therapiestrategien. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da die Injektion der Tumorzellen in die Zunge und die Vorbereitung der Zunge für die Zweiphotonenmikroskopie technisch anspruchsvoll ist und Geschicklichkeit sowie Übung erfordert. Die Visualisierung dieser Methode ist entscheidend, da das Einbringen des Tumors in den Zweiphotonen-Schritten schwer zu erlernen ist und spezielle Fähigkeiten voraussetzt, um die Kultur zu beginnen.Menschliche Kopf- und Hals-Tumorzelllinien in komplettem Medium, bestehend aus DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % nicht essentiellen Aminosäuren. Um die LIFE-Act-mCherry-Sequenz in den lentiviralen Vektor PLL 7.0 einzubringen, ist zunächst eine standortgerichtete Mutagenese erforderlich, um drei stille Mutationen in der SBF1-Erkennungsstelle der ursprünglichen mCherry-cDNA einzuführen. Anschließend die modifizierte LIFE-Act-mCherry-Sequenz mittels PCR mit flankierenden EcoR1- und SBF1-Stellen amplifizieren und in den PLL 7.0 subklonieren. Um einen PLL 7.0-LIFE-Act-mCherry-Konstrukt gemäß einem lentiviralen Expressionssystem zu erzeugen, die Verpackungszelllinie 293T17 auf 40 % Konfluenz in komplettem Medium kultivieren.Transfizieren Sie die Zellen mit den Vektoren PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS zwei und P-V-S-V-G im Verhältnis drei zu zwei zu eins unter Verwendung von Cal Foss. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Medium durch frisches, komplettes Medium, sammeln und ergänzen Sie das Medium alle 12 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden und lagern Sie das gesammelte Medium bei vier Grad Celsius, um Kopf-Hals-Zelllinien mit stabiler LIFE Act M cherry-Expression zu erzeugen. Zentrifugieren Sie das gesammelte Medium 10 Minuten bei 2000 U/min und vier Grad Celsius, geben Sie ein Milliliter des geklärten Mediums, das das Virus enthält, zu den OSC 19- oder US CCC eins-Zellen hinzu und inkubieren Sie 12 Stunden lang.Spülen Sie die Zellen und geben Sie anschließend ein zusätzliches Milliliter Virus für einen weiteren Zeitraum von 12 Stunden hinzu. Kultivieren Sie die Zellen zwei Wochen lang in Medium, das 200 Milligramm pro Milliliter Puromycin enthält, um resistente Kolonien auszuwählen. Überprüfen Sie visuell die überlebenden Kolonien auf Lebensfähigkeit. Analysieren Sie die mCherry-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie und lösen Sie einzelne positive Kolonien mit sterilen dreimillimetergroßen Klonierungsscheiben ab.Die positiven Zellen in Medium mit 200 Milligramm pro Milliliter Puromycin kultivieren, bis sie eingefroren werden oder für die orthotopische Injektion zur Erzeugung eines orthotopen Tumor-Xenotransplantats verwendet werden. Trypsin-Life Act M-cherry-exprimierende Tumorzellen anschließend zentrifugieren und etwa 2,5 × 10⁴ Zellen in 50 Mikroliter komplettem Medium resuspendieren. Die Tumorzellen in eine 1-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-½-Zoll-Nadel verbunden ist, aufziehen.Betäuben Sie anschließend eine acht Wochen alte weibliche athymische Fox. One Nude-Maus mit einer Kombination aus 80 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 10 Milligramm pro Kilogramm Xylazin. Sobald sich das Tier nicht mehr bewegt, tragen Sie einen Augenschmiermittel-Öl auf und überprüfen die Reaktionsfähigkeit, indem Sie einen Fingernagel in die Fußsohle drücken.Halten Sie die Mäuse auf einer Heizplatte zwischen 37 und 40 Grad Celsius. Greifen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig die Zungenspitze und ziehen Sie sie aus der Mundhöhle heraus. Injizieren Sie langsam die Zellen in eine Seite jeder Zunge, um eine knotige Masse in der Zungenmitte zu erzeugen.Injizieren Sie die Mäuse mit 2,1 Milligramm pro Kilogramm Yohi being und kehren Sie sie auf die Heizplatte zurück, um sie während der Erholung von der Anästhesie zu überwachen. Stellen Sie die Mäuse in sterile Käfige, die eine weiche transgene Teigdiät enthalten. Wiegen Sie die Mäuse alle zwei bis drei Tage und überwachen Sie sie visuell auf Tumoreinsatz. Um Mauszungen für die Bildgebung ex vivo vorzubereiten, euthanasieren Sie Mäuse mit Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten. Unter Verwendung von Kohlendioxid-Inhalation entnehmen Sie die Zungen und spülen sie mit einem XPBS ab. Verwenden Sie anschließend Monofile-Nähgarn aus einem örtlichen Bastelladen und eine Nähnadel der Größe acht.Befestigen Sie die Zunge an einer Seite einer herkömmlichen Paraffin-Gewebekassette. Sobald die Zunge fixiert ist, tauchen Sie die gesamte Kassettenanordnung in ein XPBS. Verarbeiten Sie die Zungen unverzüglich mittels Zweiphotonen-Mikroskopie, um die Zungen mittels Zweiphotonen-Mikroskopie abzubilden.Die Zungenkassetten in eine 60 mm-Dish mit einem XPBS tauchen. Die Dish in einer speziell angefertigten Halterung an einem versenkbaren Kragarm befestigen, der sich unterhalb des Objektivs des Zwei-Photonen-Mikroskops befindet. Ein 40x0,8-Objektiv mit Wasserimmersion direkt auf oder über eine sichtbare Tumorkrankheit platzieren.Untersuchen Sie die Zunge mittels Zweiphotonen-Mikroskopie mit dem Titan-Saphir-Laser mit einer Intensität von 60 Milliwatt und einer Eingangswellenlänge von 755 Nanometern. Um das M-Cherry-Signal zu optimieren, sammeln Sie serielle eindimensionale Laser-Scanning-Bilder in jeweils ein Mikrometer inkrementellen Tiefen über eine gesamte Gewebetiefe zwischen 15 und 100 Mikrometern. Mit dieser Konfiguration können Tumore bis zu einer Gewebetiefe von einem Millimeter analysiert werden.Verwenden Sie ScanImage, um Bilder aufzunehmen. ScanImage erzeugt eine zweikanalige Ausgabe von Raster-Scannmustern, um XY-Galvanospiegel zu steuern, und erfasst gleichzeitig maximal vier Kanäle an Signaleingängen von Photomultiplierröhren über eine Datenerfassungskarte. ScanImage sammelt Z-Stack-Bilder, indem es die Z-Achse des Objektivs steuert, und erfasst Zeitrafferbilder im Einzel- oder Zyklenmodus.Speichern Sie die Bilder in einer einzelnen TIF-Datei mit 16-Bit-Tiefe. Rendern Sie mit der Amira-Software Tumor-Bildstapel in ein einzelnes dreidimensionales Bild, indem Sie die TIF-Datei öffnen, die den Satz der Z-Stapel-Bilder enthält. Verwenden Sie die TEX-Funktion, um eine dreidimensionale Darstellung zu erzeugen.Im gerenderten Bild ist wahrscheinlich ein großes primäres Tumorbild mit mehreren kleineren, dissoziierten invasiven Gruppen oder IGS zu sehen. Um das Tumorvolumen zu messen, definieren Sie die Schwelle für den Bereich des primären Tumors und korrigieren Sie jede Schicht des Bildstapels, um die Hintergrundfluoreszenz zu eliminieren. Wiederholen Sie den Schwellenwertprozess für jede invasive Gruppe.Wenn der Primärtumor und alle Igs ausgewählt wurden, bestimmen Sie die Volumenmessung sowie die X-, Y- und Z-Tumor-OID-Koordinaten für den Primärtumor. Um die Abstände der Igs vom zentralen Tumorpunkt zu berechnen, ermitteln Sie den tumorinvasiven Index oder TI mithilfe der Formel TI = N NT × VT × dt. Dabei entspricht NT der Gesamtanzahl der Igs im Bild, VT dem Gesamtvolumen aller Igs und DT der Gesamtstrecke, die alle invasiven Gruppen vom Zentrum des Primärtumors aus zurückgelegt haben.Dreidimensionale Darstellungen mit höherer topographischer Auflösung können erstellt werden, indem die ursprünglichen 16-Bit-Graustufen-Spitzen-Dateien in die Software Nikon NIS-Elements importiert werden. Erstellen Sie eine ND-Datei aus einem Bildstapel. Kalibrieren Sie das Dokument anschließend manuell, um die Pixelgröße für qualitativ hochwertigere Darstellungen festzulegen.Fügen Sie zusätzliche Schnitte in der Z-Ebene hinzu. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Rohdaten, die mittels einer Zwei-Photonen-Bildaufnahme mit NIS-Elementen oder einem Spiegel gewonnen wurden. Mit Hilfe einer Software können die Rohdaten von Zungentumoren rekonstruiert werden, wie in dieser Abbildung dargestellt. Dieses Panel zeigt ein Beispiel der dreidimensionalen Darstellung mithilfe der TEX-Funktion in der Amira-Software. Hier sehen Sie ein Beispiel für die Schwellenwertanalyse einer einzelnen Zwei-Photonen-Schicht aus dem Bildstapel, um invasive Gruppen des primären Tumors sowie das Zentrum des primären Tumors oder Oids zu identifizieren. Nachdem jede Schicht mit Schwellenwertanalyse ausgewertet wurde, quantifiziert Amira das Volumen und die von jeder invasiven Gruppe zurückgelegte Distanz vom Centro.Diese Daten können grafisch dargestellt und genutzt werden, um den numerischen Wert für das Ausmaß der Tumorzellinvasion zu ermitteln. A, das dem primären Ort zuzuschreiben ist, zeigt repräsentative Bilder von Tumoren, wie sie mittels konventioneller immunhistochemischer Färbung in der Pathologie visualisiert wurden, verglichen mit einem dreidimensionalen Bild eines ähnlichen Tumors unter Verwendung des beschriebenen Protokolls. Sobald die Methode vom Zeitpunkt der Zungenentnahme bis zur endgültigen 3D-Darstellung beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Zunge nicht mit der Nadel zu durchstechen, wodurch Tumorzellen verlorengehen und die Tumoransiedlung behindert werden könnte. Im Anschluss an dieses Verfahren können Tests mit therapeutischen Substanzen oder Zellen mit modulierten Proteinspiegeln durchgeführt werden, um deren Wirksamkeit bezüglich der oralen Krebsinvasion zu bestimmen.Bei Arbeiten in einem In-vivo-Setting ist nicht zu vergessen, dass der Umgang mit humanen Tumorzellen, die mit Lentivirus modifiziert wurden, gefährlich ist; daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter PSA und die Arbeit in einem BSL-2-zertifizierten laminaren Flusswerk getroffen werden, wenn mit injizierten Mäusen gearbeitet wird.

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Forschung

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Medicine

Medizin

Einem orthotopen Modell des seröse Ovarialkarzinom in immunkompetenten Mäusen für In vivo Tumor Imaging und Überwachung der Tumor Immunantworten

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

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In diesem Video entwickeln wir ein orthotopes Modell für Kopf- und Halskrebs bei Mäusen durch intramukosale Inokulation der Plattenepithelkarzinom-Zelllinie. Die tumortragende Maus würde Ähnlichkeit mit klinisch relevanten Symptomen menschlicher Krankheiten aufweisen und könnte somit zur Untersuchung des Fortschreitens von Krebs und zur Entdeckung neuer therapeutischer Strategien verwendet werden.

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Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

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Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

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Die Translation von Befunden der Intravitalmikroskopie wird durch das geringe Eindringen in das Gewebe erschwert. Hier beschreiben wir ein Mausmodell mit dorsaler Fensterkammer, das die Co-Registrierung der Intravitalmikroskopie und klinisch anwendbarer Bildgebungsmodalitäten (z. B. CT, MRT) für eine direkte räumliche Korrelation ermöglicht und so die klinische Translation von Befunden der Intravitalmikroskopie möglicherweise rationalisiert.

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